王標(biāo)詩,吳藝華,周澤捷,江 敏,胡小軍,彭元懷,楊 娟,劉淑敏
(嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,廣東湛江 524048)
超聲波輔助提取菠蘿皮渣多糖及其抗氧化活性研究
王標(biāo)詩,吳藝華,周澤捷,江 敏,胡小軍,彭元懷,楊 娟,劉淑敏
(嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,廣東湛江 524048)
采用超聲波技術(shù)輔助提取菠蘿皮渣多糖,利用正交設(shè)計實驗優(yōu)化其提取工藝,并利用體外實驗研究該多糖對羥自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)的清除能力及其還原能力,以評價其抗氧化活性。研究結(jié)果表明,超聲波輔助提取最佳工藝參數(shù)為:料液比1∶50 (m/v),時間40 min,溫度60 ℃,功率為570 W,該條件下多糖的得率為2.38%;在本實驗濃度范圍(1.50~3.50 mg/mL)內(nèi),菠蘿皮渣多糖對·OH的清除率隨其濃度的增加而增加,但清除能力均低于同濃度VC,清除DPPH·自由基的IC50為2.47 mg/mL,對Fe3+的還原能力隨多糖濃度的增加而增加??梢?超聲波輔助提取工藝效果較好,能縮短提取時間,提高菠蘿皮渣多糖的得率;體外抗氧化實驗表明菠蘿皮渣多糖具有一定的抗氧化活性。從菠蘿皮渣中提取活性多糖,可以變廢為寶,實現(xiàn)菠蘿資源的高值化利用。
菠蘿皮渣,多糖,超聲提取,抗氧化
菠蘿又名鳳梨,是鳳梨科鳳梨屬植物,原產(chǎn)美洲熱帶和亞熱帶,是多年生草本植物。是熱帶和亞熱帶地區(qū)的著名水果,我國是菠蘿十大主產(chǎn)國之一,主要分布在廣東、海南、廣西、福建、云南等省[1]。菠蘿果實營養(yǎng)豐富,含有還原糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、粗纖維和有機酸等。主要以菠蘿為原料的綜合開發(fā)新產(chǎn)品如菠蘿蛋白酶、菠蘿纖維、菠蘿涼果、菠蘿飼料、菠蘿酒和菠蘿生物有機肥等也將逐漸形成規(guī)模生產(chǎn),進入國內(nèi)外市場[2]。菠蘿果實由于不易貯存,除極少部分用于直接銷售鮮食外,大部分用于加工。菠蘿在鮮食或加工利用時,被丟棄的外皮和果心等廢料成為菠蘿皮渣,其重量大約為全果的50%~60%[3]。若菠蘿皮渣不加以綜合利用,則可造成資源的浪費和環(huán)境的污染。
菠蘿皮渣的高值化綜合利用,不僅有利于解決環(huán)境問題,還將帶來良好的經(jīng)濟效益。目前,對菠蘿皮渣的綜合開發(fā)利用研究主要集中在以下幾個方面,一是生物發(fā)酵利用:如氫氣、乙醇、沼氣[3]和動物飼料[4]等;二是營養(yǎng)成分和功能成分的提取和利用:如酚類物質(zhì)[5]、果膠[6-7]、色素[8]、膳食纖維等的提取與利用[9-11];三是食品輕化工領(lǐng)域的應(yīng)用:果醋的加工[13]、有機酸的生產(chǎn)[14]、蝦青素的生產(chǎn)[15]、金屬吸附劑的制備和利用[16]等。李俶等[17]研究表明,菠蘿皮渣總糖含量為93.6%。目前,多糖的提取技術(shù)有:溶劑(水、酸、堿、乙醇)提取法,酶提取法,物理場輔助提取法等。羅建平等[18]研究用熱水提取菠蘿皮渣多糖,但是該法提取時間較長,效率不高。嚴(yán)浪等[19]和吳靖等[20]研究用堿法提取菠蘿皮渣半纖維素多糖并分析其性質(zhì)。郭巧玲等[21]研究用熱水提取菠蘿皮渣粗多糖及其抗氧化性能,但是提取效率也不高。超聲波輔助提取技術(shù)因其低能耗和高得率而在近年被廣泛應(yīng)用[22]。
為了提高菠蘿皮渣多糖的提取效率,本研究將超聲波輔助提取技術(shù)應(yīng)用于菠蘿皮渣多糖的提取,并優(yōu)化提取工藝條件,在獲得多糖的基礎(chǔ)上,進一步研究其抗氧化活性。為菠蘿的深加工和副產(chǎn)物的充分利用提供實驗數(shù)據(jù)。
1.1 材料與儀器
菠蘿皮渣(九成熟)產(chǎn)地湛江雷州,制作菠蘿罐頭剩下的皮渣,由廣東收獲罐頭食品有限公司提供。
無水葡萄糖 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;牛血清蛋白 分裝進口;考馬斯亮藍G-250 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH自由基) Sigma公司分裝產(chǎn)品;鄰二氮菲、抗壞血酸、硫酸二鐵(Ⅲ)銨、苯酚 廣東化學(xué)試劑廠;其他化學(xué)試劑均為分析純。
SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機(總功率950 W) 寧波新芝生物科技股份有限公司;80-2型電動離心機 金壇市新航儀器廠;FA1004N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;V-1100D型可見風(fēng)光光度計 上海美譜達儀器有限公司;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;CG001型德爾粉碎機 廣東德爾電器有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 原料預(yù)處理 取菠蘿皮渣,剔除大顆粒雜質(zhì),置于烘箱中55±0.2 ℃干燥8 h,經(jīng)粉碎機粉碎后過60目篩,得粉末狀菠蘿皮渣,儲存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 超聲波輔助提取菠蘿皮渣多糖的工藝 參考羅建平等[18]方法,并進行適當(dāng)修改。稱取菠蘿皮渣干粉2 g,按料液比要求加入適當(dāng)蒸餾水并混合,設(shè)定超聲功率、超聲時間后進行超聲提取,提取液離心:3500×g,15 min,取上清液濃縮10 min,濃縮液與Sevage試劑混合,振搖30 min后離心:3500×g,15 min,取上清液,與3倍上清液體積的95%乙醇溶液混合,室溫下靜置沉淀30 min后離心:3500×g,15 min,取沉淀,蒸餾水重新溶解沉淀,得菠蘿皮渣多糖。
1.2.3 多糖含量的測定
1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 參考王文平等方法[23]。分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的0.04 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,置于10 mL具塞試管中,加水至2.0 mL,加入6%苯酚1.0 mL,搖勻,迅速滴加濃硫酸5.0 mL,靜置5 min,沸水浴20 min,迅速冷卻至室溫(約25 ℃),在490 nm處測其測吸光度。
1.2.3.2 多糖換算因子的測定 準(zhǔn)確稱取37 ℃干燥后的菠蘿皮渣多糖30.56 mg,蒸餾水溶解,定容至100 mL。吸取多糖溶液1.0 mL,按上述操作步驟,測吸光度,將吸光度值帶入回歸方程計算供試品中葡萄糖質(zhì)量體積,根據(jù)下式計算換算因子F。
式(1)
式(1)中,W為多糖的質(zhì)量(mg),C為多糖液中葡萄糖質(zhì)量體積(mg/L),V為多糖體積(L),D為多糖稀釋倍數(shù)。
1.2.3.3 樣品多糖含量的測定 取樣品溶液1.0 mL,按上述操作步驟,測吸光度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線和下式計算多糖含量。
式(2)
式(2)中,C為樣品液中所測葡萄糖的質(zhì)量體積(mg/L);D為樣品液的稀釋倍數(shù);V為溶液體積(L);F為換算因子;M為菠蘿皮渣干粉質(zhì)量(mg)。
1.2.4 多糖提取單因素實驗
1.2.4.1 提取時間對菠蘿皮渣多糖得率的影響 在料液比1∶35,溫度45 ℃,功率比50%的條件下,探討不同提取時間(20、25、30、35、40 min)對菠蘿皮渣多糖得率影響。
1.2.4.2 溫度對菠蘿皮渣多糖得率的影響 在提取時間20 min,料液比1∶35,功率比50%的條件下,探討不同溫度(45、50、55、60、65 ℃)對菠蘿皮渣多糖得率影響。
1.2.4.3 超聲波功率對菠蘿皮渣多糖得率的影響 在提取時間20 min,溫度45 ℃,料液比1∶35的條件下,探討不同功率比(45%、50%、55%、60%、65%)對菠蘿皮渣多糖得率影響。
1.2.4.4 料液比對菠蘿皮渣多糖得率的影響 在提取時間20 min,溫度45 ℃,功率比50%的條件下,探討不同料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50)對菠蘿皮渣多糖得率影響。
1.2.5 多糖提取正交實驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取四因素三水平做正交實驗,因素水平表如表1所示,通過直觀分析法得到影響多糖得率因素的主次順序和最佳提取工藝參數(shù),并用方差分析分析其結(jié)果。
表1 因素與水平Table 1 Factors and levels
1.2.6 菠蘿皮渣多糖的抗氧化性研究
1.2.6.1 羥自由基(·OH)清除能力的測定 采用鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2體系[24]進行實驗。
1.2.6.2 DPPH自由基(DPPH·)清除能力的測定 參考Wang等[25]方法。取1.0 mL多糖樣品溶液于具塞試管中,加入3.0 mL DPPH乙醇溶液,混合均勻,室溫下于黑暗處靜置60 min后,測其517 nm處吸光度值,同時測定多糖樣品空白以及不加多糖樣品的空白樣的吸光度值。同時以不同濃度的VC溶液作陽性對照實驗。按下式計算其對DPPH·清除率。
式(3)
式(3)中,I為清除率(%);Ai為3.0 mL DPPH溶液+1.0 mL樣品液的吸光度值;Aj為1.0 mL樣品液+3.0 mL 無水乙醇的吸光度值;A0為3.0 mL DPPH溶液+1.0 mL樣品溶劑的吸光度值。
1.2.6.3 還原能力的測定 參考羅建平等[18]方法,并進行適當(dāng)修改。分別取1.0 mL 5×10-3mol/L鄰二氮菲溶液于若干具塞試管中,各加入0.5 mL 0.002 mol/L Fe3+溶液,搖勻,分別加入1.0 mL多糖樣品溶液,迅速補水至7.0 mL,搖勻,30 ℃水浴1 h后在536 nm波長下測其吸光度。同時測定多糖樣品空白以及不加多糖樣品的空白樣的吸光度值。以不同濃度的VC溶液作陽性對照實驗。按下式計算樣品還原能力。
式(4)
式(4)中,A樣品為1.0 mL鄰二氮菲+0.5 mL Fe3++1.0 mL樣品的吸光度值,A對照為1.0 mL樣品+0.5 mL Fe3+的吸光度值,A空白為1.0 mL鄰二氮菲+0.5 mL Fe3+的吸光度值。
1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
以上實驗均平行3次,根據(jù)三次實驗結(jié)果計算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果以均值或均值(標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。
2.1 超聲波輔助提取菠蘿皮渣多糖的工藝
2.1.1 多糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線 以吸光度為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo),所得其線性回歸方程為y=0.0561x-0.0009,相關(guān)系數(shù)為0.9988,線性關(guān)系良好。說明在測定的濃度范圍內(nèi),制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度較高,可以用于樣品多糖含量的測定。根據(jù)該方程,可以計算出樣品中含有的多糖質(zhì)量,再結(jié)合式(2)可以計算出多糖的得率。
2.1.2 單因素實驗結(jié)果
2.1.2.1 提取時間對菠蘿皮渣多糖得率的影響 圖1為提取時間對菠蘿皮渣多糖得率的影響結(jié)果。由圖1可知,菠蘿皮渣多糖得率隨提取時間增加而升高。然而,多糖得率隨時間增加而升高的幅度不大,同時,當(dāng)時間大于30 min時,多糖得率雖仍呈升高之勢,但趨勢不明顯??赡苡捎谠谇?0 min內(nèi),絕大部分菠蘿皮渣多糖都能被提取出來,而后再繼續(xù)增加時間僅有少量的菠蘿皮渣多糖被提取出來,故增加幅度不大。而且提取時間的增加會增加更多的能量,造成能量的浪費。因此選擇提取時間30、35、40 min三個水平做正交實驗。
圖1 提取時間對菠蘿皮渣多糖得率的影響Fig.1 Effects of extraction time on extraction yield of polysaccharides from the pineapple peel
2.1.2.2 溫度對菠蘿皮渣多糖得率的影響 圖2為溫度對菠蘿皮渣多糖得率的影響結(jié)果。由圖2可知,當(dāng)溫度小于50 ℃時,多糖得率隨溫度升高而升高,溫度在50~60 ℃范圍內(nèi),多糖得率升高趨于平緩,當(dāng)溫度繼續(xù)升高,可能由于一方面溫度的提高可以提高多糖的溶解度和擴散率,但是溫度太高會破壞多糖的結(jié)構(gòu),引起多糖的降解[22],最終使得溫度大于60 ℃時,多糖得率反而降低。故選擇溫度50、55、60 ℃三個水平做正交實驗。
圖2 溫度對菠蘿皮渣多糖得率的影響Fig.2 Effects of temperature on extraction yield of polysaccharides from the pineapple peel
2.1.2.3 超聲波功率對菠蘿皮渣多糖得率的影響 圖3為超聲波功率對菠蘿皮渣多糖得率的影響結(jié)果。由圖3可知,當(dāng)超聲功率比由45%增加到60%時,菠蘿皮渣多糖的得率逐漸增加。在功率比為60%時,多糖的含量達到最高,而后降低。可能由于在其他條件不變的情況下,超聲功率越高,超聲波在水介質(zhì)中產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機械波動效應(yīng)對細胞壁的破壞作用就越大,多糖也就越容易析出。然而當(dāng)超聲功率過高時可能會導(dǎo)致多糖降解,因而得率會降低。故超聲功率比選擇為60%左右為宜,選擇功率比50%(即功率為475 W)、55%(即功率為523 W)、60%(即功率為570 W)三個水平做正交實驗。
圖3 功率對菠蘿皮渣多糖得率的影響Fig.3 Effects of power on extraction yield of polysaccharides from the pineapple peel
2.1.2.4 料液比對菠蘿皮渣多糖得率的影響 圖4為料液比對菠蘿皮渣多糖得率的影響結(jié)果。由圖4可見,料液比從1∶25增加到1∶40時,菠蘿皮渣多糖得率隨著料液比的增加而升高;當(dāng)料液比大于1∶40時,多糖得率升高不明顯,趨于平緩??赡苡捎诹弦罕葟?∶25增加到1∶40時,超聲波的空化效應(yīng)使得多糖能更充分的被水提取出來,而后繼續(xù)增加料液比,多糖的量雖然有增加,但是由于溶劑水也增加較多,相當(dāng)于對多糖進行了部分稀釋,反而不利于多糖的提升,故其總的濃度增加沒有特別明顯。故選擇料液比1∶40、1∶45、1∶50三個水平做正交實驗。
表3 正交實驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance on the result of orthogonal experiment
圖4 料液比對菠蘿皮渣多糖得率的影響Fig.4 Effects of material to liquid ratio on extraction yield of polysaccharides from the pineapple peel
注:**p<0.01為影響極顯著,*p<0.05為影響顯著。2.1.3 正交實驗結(jié)果 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,確定影響菠蘿皮渣多糖得率的4個因素3個水平(見表1),采用L9(34)表用進行正交實驗,結(jié)果見表2。
表2 正交實驗及結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment and its results
從表2的極差分析可知,影響菠蘿皮渣多糖得率的因素主次順序為料液比(A)>功率比(D)>溫度(C)>時間(B),最優(yōu)的參數(shù)組合為A3B3C3D3,即料液比1∶50,時間40 min,溫度60 ℃,功率比60%。由表3方差分析可知,在菠蘿皮渣多糖超聲波輔助提取工藝正交實驗所選擇的因素和水平范圍內(nèi),A和D因素的影響達到了顯著性水平(p<0.05),即料液比和超聲功率對菠蘿皮渣多糖得率有顯著影響,而提取時間和溫度對菠蘿皮渣多糖得率的影響不顯著,方差分析結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致。正交實驗驗證實驗結(jié)果顯示,以料液比1∶50,時間40 min,溫度60 ℃,功率比60%的提取參數(shù)進行提取,得率為2.38%±0.14%。說明優(yōu)化后的提取工藝參數(shù),使多糖得率顯著(p<0.05)提高。羅建平等[18]采用熱水法提取菠蘿皮渣多糖,利用三因素二次通用旋轉(zhuǎn)組合實驗優(yōu)化其提取工藝,最佳提取工藝為料液比1∶25 (m/V)、提取時間5 h、提取溫度70 ℃,得率為23.72 mg/g,即為2.37%。本實驗用超聲波輔助水提取僅用40 min就可以達到和熱水提取5 h幾乎一樣的提取效率,可見,超聲波提取技術(shù)的應(yīng)用可大大縮短提取時間,降低提取溫度,從而提高多糖的提取效率。
2.2 菠蘿皮渣多糖的體外抗氧化活性
2.2.1 菠蘿皮渣多糖對羥自由基體系的清除能力 圖5為菠蘿皮渣多糖對羥自由基體系的清除能力實驗結(jié)果。由圖5可知,在1.50~3.50 mg/mL范圍內(nèi),菠蘿皮渣多糖對羥自由基有一定的清除能力,然而,菠蘿皮渣多糖在實驗濃度范圍內(nèi)對羥自由基的清除率均不高,而且較同濃度的VC低,且隨著濃度的增加,其升高的趨勢明顯低于VC對羥自由基的清除率。羅建平等[18]采用熱水法提取菠蘿皮渣多糖,在3.0 mg/mL時對羥自由基的清除率為26.12%,而本實驗中3.0 mg/mL時對羥自由基的清除率只有18.0%,相對較低,可能由于超聲波輔助提取對菠蘿皮渣多糖的大分子結(jié)構(gòu)有一定的影響,特別是活性基團。研究表明多糖能清除羥基自由基的機制可能是多糖中的羥基能夠貢獻一個質(zhì)子使其與羥基自由基結(jié)合,從而達到清除的目的[22]。
圖5 菠蘿皮渣多糖對羥自由基的清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavenging capacity of polysaccharides from the pineapple peel
2.2.2 菠蘿皮渣多糖對DPPH·清除能力的測定結(jié)果 圖6為菠蘿皮渣對DPPH·清除能力的實驗結(jié)果。由圖6可知,在實驗濃度范圍內(nèi)(1.50~3.50 mg/mL),菠蘿皮渣多糖對DPPH·的清除效果與濃度有較好的量效關(guān)系,多糖濃度(x)與清除率(y)的回歸線性方程為y=5.699x+33.262,相關(guān)系數(shù)為0.9847;VC對DPPH·的清除率均大于90%,可能由于VC在實驗濃度范圍內(nèi)對DPPH·的清除反應(yīng)接近平衡,清除效果與濃度的量效關(guān)系不明顯;在相同濃度情況下,VC對DPPH·清除率均高于菠蘿皮渣多糖,菠蘿皮渣多糖清除DPPH·的IC50為2.47 mg/mL。研究認為,一些化合物之所以能清除DPPH·,可能是因為這些化合物能提供一個電子使其與DPPH·的單電子配對,從而使DPPH·的吸收逐漸消失[22]。
圖6 菠蘿皮渣多糖對DPPH·清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging capacity of polysaccharides from the pineapple peel
2.2.3 菠蘿皮渣多糖還原能力的測定結(jié)果 圖7為菠蘿皮渣多糖還原能力的測定結(jié)果??寡趸瘎┑倪€原力與其抗氧化活性之間存在聯(lián)系,一般來說,還原力越大,抗氧化性越強。由圖7可知,菠蘿多糖對Fe3+的還原能力隨著濃度的增加而升高,且還原力與多糖濃度呈正相關(guān)。在相同濃度下,VC的還原能力均高于菠蘿皮渣多糖,如試樣濃度為1.5 mg/mL時,VC的還原能力為0.786,多糖僅為0.389。這些結(jié)果與羅建平等[18]和郭巧玲等[21]的研究結(jié)果基本一致。
圖7 菠蘿皮渣多糖對鐵離子還原能力 Fig.7 Ferric ion reducing capacity of polysaccharides from the pineapple peel
采用超聲波輔助提取技術(shù)提取菠蘿皮渣多糖,利用正交設(shè)計實驗優(yōu)化其提取工藝,最佳工藝參數(shù)為料液比1∶50,時間40 min,溫度60 ℃,功率比60%,得率為2.38%。通過比較可知,超聲波輔助提取技術(shù)的應(yīng)用可大大縮短提取時間,提高提取效率。
體外模型從·OH的清除能力,DPPH·的清除能力和還原能力三個角度評價菠蘿皮渣多糖的抗氧化活性。研究結(jié)果表明,在實驗濃度范圍內(nèi)(1.50~3.50 mg/mL),菠蘿皮渣多糖對·OH的清除率均較低,清除DPPH·的IC50為2.47 mg/mL,表明菠蘿皮渣多糖具有一定的抗氧化活性。
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Ultrasound-assisted extraction and antioxidant activities of polysaccharides from pineapple peel
WANG Biao-shi,WU Yi-hua,ZHOU Ze-jie,JIANG Min,HU Xiao-jun, PENG Yuan-huai,YANG Juan,LIU Shu-min
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Lingnan Normal University,Zhanjiang 524048,China)
Using pineapple peel as materials,optimal process conditions of ultrasound-assisted extraction of polysaccharides and its antioxidant activities were studied. Based on the single factor experiment,orthogonal experiment was conducted to optimize the extraction process. The antioxidant activitiesinvitrowere also evaluated in three systems with hydroxyl radical(·OH)scavenging capacity,DPPH free radical(DPPH·)scavenging capacity and reducing capacity. The optimum conditions of pineapple peel polysaccharides were determined as follows:material to liquid ratio was 1∶50,extraction time was 40 min,extraction temperature was 60 ℃,ultrasound power was 60%. Under the optimal conditions,the extraction yield was 2.38%. The scavenging rate on hydroxyl radical(·OH)of the polysaccharides from pineapple peel increased with the increase of polysaccharides concentration(1.5~3.5 mg/mL)and was lower than VCat the same concentration. The polysaccharides from pineapple peel had good DPPH scavenging effect when compared with standard VCand the IC50on DPPH· was 2.47 mg/mL. The reducing capacity on Fe3+increased with the increasing concentration. So,the polysaccharides can be extracted effectively by this method and the polysaccharides have good antioxidant activities. The extraction of active polysaccharides from pineapple peel residue can realize the high value utilization of pineapple resources.
Pineapple peel;polysaccharides;ultrasound-assisted extraction;antioxidant activities
2017-01-13
王標(biāo)詩(1980- ),男,博士,副教授,研究方向:功能性食品、食品加工及安全,E-mail:hang_kong2002@163.com。
廣東省公益研究與能力建設(shè)項目(2015A010107015);嶺南師范學(xué)院熱帶與南海資源協(xié)同創(chuàng)新中心項目(CIL1503)和嶺南師范學(xué)院自然科學(xué)研究項目(YL1403)聯(lián)合資助。
TS201.1
B
1002-0306(2017)15-0207-06
10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.039