汪 雄,趙 燕,徐明生,姚 瑤,張夢(mèng)雅,涂勇剛,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué),江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045; 2.南昌大學(xué),生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心,江西南昌 330047)

食源性抗炎肽的制備、分離、鑒定及其抗炎機(jī)制研究進(jìn)展

汪 雄1,趙 燕2,徐明生1,姚 瑤1,張夢(mèng)雅1,涂勇剛1,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué),江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045; 2.南昌大學(xué),生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心,江西南昌 330047)

生物活性肽是生命和食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。其抑菌、降血壓、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗炎等活性已相繼被證實(shí),其中肽的抗炎作用研究相對(duì)較為薄弱。慢性炎癥嚴(yán)重影響人體健康,而傳統(tǒng)治療炎癥藥物均有一定副作用,食源性抗炎肽的開(kāi)發(fā)應(yīng)用有望為機(jī)體炎性反應(yīng)提供新的抗炎策略。本文綜述了食源性抗炎活性肽的制備、分離純化、鑒定以及抗炎活性與分子作用機(jī)制的研究進(jìn)展,并對(duì)其研究進(jìn)行了展望,為食源性抗炎肽的進(jìn)一步深入研究提供參考。

食源性,抗炎肽,炎癥,免疫,抗炎機(jī)制

炎癥是機(jī)體受致炎因子損傷后所發(fā)生的一種以防御反應(yīng)為主的重要進(jìn)行性過(guò)程。當(dāng)機(jī)體發(fā)生慢性炎癥,機(jī)體免疫耐受遭受破壞,激活相關(guān)免疫細(xì)胞,使其釋放花生四烯酸、細(xì)胞因子、前列腺素、組胺等炎性介質(zhì)。炎性介質(zhì)通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)外炎癥信號(hào)通路,刺激免疫細(xì)胞分泌過(guò)量的IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子,這使得機(jī)體內(nèi)促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子不平衡,而促炎細(xì)胞因子又會(huì)促進(jìn)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。然而,過(guò)度的免疫應(yīng)答最終可能導(dǎo)致組織損傷,對(duì)人體產(chǎn)生重大傷害[1-2]。

目前預(yù)防和治療炎癥的方法包括抑制細(xì)胞免疫反應(yīng),減少促炎細(xì)胞因子分泌,抑制或干預(yù)NF-κB和MAPK信號(hào)通路。主要的藥物有糖皮質(zhì)激素類藥物、非特異性免疫抑制劑和抗-TNF-α抗體等[3-4]。毫無(wú)疑問(wèn),上述藥物對(duì)病情具有治療或緩解作用,但同時(shí)也會(huì)帶來(lái)一定的副作用,比如依賴性、過(guò)敏性,導(dǎo)致病人免疫力下降以及代謝紊亂等[5]。因此,研究開(kāi)發(fā)新的、安全的、具有治療或輔助治療炎癥的天然產(chǎn)品或天然產(chǎn)物的衍生產(chǎn)品成為越來(lái)越多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。

生物活性肽一直是生命和食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外諸多研究證實(shí)了食源性蛋白質(zhì)水解物和多肽在細(xì)胞和動(dòng)物水平均具有良好的抗炎作用,這為研究開(kāi)發(fā)新型安全抗炎藥物提供了很好的方向和途徑。由此,本文對(duì)抗炎活性肽的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,并對(duì)其研究和應(yīng)用進(jìn)行展望,以期為抗炎肽的進(jìn)一步深入研究和運(yùn)用提供參考。

1 食源性抗炎肽概述

食源性抗炎肽是一類對(duì)生物機(jī)體有益,通過(guò)綜合調(diào)控細(xì)胞因子的分泌、炎性介質(zhì)合成釋放和炎癥信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng),由2個(gè)或多個(gè)氨基酸組成,來(lái)源于可食用性蛋白質(zhì)的一類小分子肽。通常,這些肽在完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不表現(xiàn)其生物活性,必須通過(guò)酶解或者酸堿等極端條件釋放出來(lái)才發(fā)揮特定活性。植物和動(dòng)物蛋白質(zhì)是抗炎肽的主要來(lái)源,目前已證實(shí),來(lái)源于蛋、肉、牛奶、魚(yú)、小麥,甚至蔬菜等的多肽和酶解復(fù)合物具有較好的抗炎效果[6-8]。禽蛋蛋白中含有豐富的蛋白質(zhì),主要是卵白蛋白。源于雞蛋中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的三肽IRW對(duì)上皮炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用[6]。這種小分子肽通過(guò)胞吞或者肽運(yùn)輸載體很容易進(jìn)入細(xì)胞,并且與細(xì)胞膜上的相關(guān)免疫受體結(jié)合起到調(diào)節(jié)炎癥作用。卵黃高磷蛋白含豐富的絲氨酸,其水解物能夠顯著性抑制促炎細(xì)胞因子分泌和釋放,從而抑制炎癥反應(yīng)[7]。在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)豬結(jié)腸炎模型中,大豆蛋白水解物通過(guò)降低過(guò)氧化物酶(MPO)活性和促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌,促進(jìn)淋巴系統(tǒng)免疫細(xì)胞成熟,改善豬的體重變化以及結(jié)腸組織,從而減輕豬結(jié)腸炎癥反應(yīng)[8]。綜上所述,抗炎肽在體內(nèi)和體外能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子起到緩解和抑制炎癥的良好作用。然而,關(guān)于這些肽是如何進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi),以及其如何介導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)并沒(méi)有做深入研究。

目前,應(yīng)用生物活性多肽作為藥物、疫苗、導(dǎo)向藥物、診斷試劑、酶抑制劑及藥物先導(dǎo)化合物等具有廣泛的理論和應(yīng)用價(jià)值[9]。但是,有關(guān)生物活性肽在抗炎方面的研究處在起步階段,而機(jī)體內(nèi)的炎癥對(duì)身體健康影響極其重大。因此,進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)抗炎肽產(chǎn)品具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。

2 食源性抗炎肽的制備

食源性抗炎肽的常用制備方法主要有直接分離食物中的天然抗炎肽、酶解食物蛋白質(zhì)獲得抗炎肽、微生物發(fā)酵法制備抗炎肽等。

2.1 食源性天然抗炎肽

天然抗炎活性肽具有高效、低毒、無(wú)污染等特點(diǎn),在畜牧、養(yǎng)殖、食品及藥品中都有廣泛的應(yīng)用前景。然而生物體內(nèi)含天然活性抗炎肽很微量,并且分離提純過(guò)程很復(fù)雜,很難得到純度高的抗炎活性肽。

目前已經(jīng)從大豆、柑橘、莧菜等植物性食物中分離得到天然抗炎肽。大豆是蛋白質(zhì)的豐富來(lái)源,De Mejia等[10]運(yùn)用RP-HPLC和MALDI-TOF等技術(shù),結(jié)合超濾從大豆中分離獲得的Lunasin抗炎肽片段,分子量分別為5、8、14 kDa,這些抗炎肽片段在LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥模型中表現(xiàn)較好抗炎作用。Moronta等[11]采用高效液相色譜法從莧菜分離得到序列為SSEDIKE的抗炎活性肽,該肽可以抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2趨化因子CCL20表達(dá),具有抑制炎癥的免疫特性。Noh等[12]從柑橘皮中分離出具有抗炎作用的柑橘環(huán)肽XI。雖然,通過(guò)色譜和超濾等手段能夠從食源性物質(zhì)中分離得到部分天然抗炎活性肽,但是,這些肽的純度普遍不高。另一方面,通過(guò)這些化學(xué)手段提取得到的肽活性可能會(huì)受到影響。這些都是阻礙天然抗炎肽實(shí)際運(yùn)用的因素。

2.2 酶法制備

因酶法制備抗炎肽具有生產(chǎn)條件溫和,水解易控制,成本低,獲得產(chǎn)品安全性極高等特點(diǎn),利用不同種類的酶水解蛋白質(zhì)獲得的抗炎活性肽已成為最主要的制備抗炎肽的方法。在制備抗炎肽的過(guò)程中,動(dòng)物胃蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰酶)、植物胃蛋白酶(木瓜蛋白酶)以及微生物蛋白酶(枯草桿菌中性蛋白酶)等均可使用。然而水解酶酶切位點(diǎn)不同,得到的肽的種類繁多,因此選擇合適的酶以及酶解條件很關(guān)鍵。另外,鑒于酶具有專一性、酶切位點(diǎn)有限等特點(diǎn),故單一酶酶解制備抗炎肽或含抗炎肽酶解復(fù)合物效果有時(shí)不佳,我們通常需要選擇適當(dāng)?shù)膹?fù)合酶進(jìn)行酶解以獲得目的產(chǎn)物。目前,通過(guò)酶解法已經(jīng)從雞蛋、大豆、玉米、魚(yú)等中分離得到各種抗炎肽。

Cheng等[13]人用堿性蛋白酶和風(fēng)味酶分別酶解煮熟的金槍魚(yú)湯汁,發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解獲得的肽片段抗炎效果更佳,并且運(yùn)用Q-TOF和ESI手段測(cè)得抗炎肽氨基酸序列分別為PRRMMNGGR和MGPAMMRTMPG,分子量分別為1543.8、1211.5 Da。通過(guò)酶解手段獲得的抗炎肽抗炎能力存在差異性,這和肽片段的分子量存在一定的關(guān)系,小分子量的多肽或者氨基酸更容易被機(jī)體吸收。Shi等[14]采用堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶酶解雞蛋殼膜,結(jié)合超濾技術(shù),已經(jīng)從雞蛋殼膜中獲得不同分子量的小分子抗炎肽復(fù)合物,發(fā)現(xiàn)超濾得到的各組分表現(xiàn)出不同程度的抗炎活性,這表明分子量和氨基酸組成影響抗炎肽活性。另外,這些肽復(fù)合物在體外化學(xué)和體內(nèi)細(xì)胞水平表現(xiàn)出一定的清除自由基、還原鐵離子等能力。Iskandar等[15]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解乳清蛋白得到的酶解復(fù)合物,經(jīng)過(guò)超濾獲得不同分子量的肽片段可以調(diào)控NF-κB信號(hào)通路、抑制炎癥因子表達(dá)。Ahn等[16]采用六種酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)胃蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶)酶解鮭魚(yú)胸鰭,結(jié)合凝膠色譜和超濾技術(shù)獲得抗炎肽片段SPHF1,并且發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)RAW.264.7炎癥模型中,SPHF1能夠抑制細(xì)胞NO釋放和減少IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子合成。我們可以看到,不同復(fù)合酶制備得到的多種小分子肽表現(xiàn)出來(lái)的活性能力有高低。因此,選擇合適的酶或者復(fù)合酶在制備抗炎活性肽過(guò)程中至關(guān)重要。

雖然通過(guò)酶解技術(shù)已經(jīng)分離得到很多抗炎肽以及復(fù)合物,但是目前獲得生物活性肽的大量研究主要集中在蛋白質(zhì)水解酶和蛋白質(zhì)來(lái)源篩選以及酶解條件優(yōu)化上,研究者由于不知道原料蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu),往往是隨機(jī)選取蛋白原料和蛋白水解酶,通過(guò)對(duì)不同酶解液的活性比較來(lái)確定蛋白原料和酶類,因此此法制備抗炎肽存在盲目性,得到的抗炎肽成分復(fù)雜。為了快速篩選出抗炎活性肽,最近幾年提出了模擬酶切特定已知序列蛋白制備小分子多肽,建立酶解肽庫(kù),并對(duì)其抗炎肽進(jìn)行抗炎活性表征。

2.3 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法也是獲得生物活性肽的有效方法之一,該法主要是運(yùn)用微生物體內(nèi)的酶系統(tǒng)水解特定蛋白質(zhì)。牛奶中含豐富的酪蛋白,經(jīng)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生很多活性多肽,Hirota等[17]從細(xì)菌發(fā)酵酪蛋白產(chǎn)物中分離得到的三肽VPP能夠降低人血管上皮細(xì)胞NO的釋放,減輕血管擴(kuò)張。同樣,豆類發(fā)酵制品也具有許多生物活性肽,來(lái)自韓國(guó)的發(fā)酵型豆制品Chungkookjang中含有豐富的生物活性肽,這些抗炎肽在人乳腺癌細(xì)胞中,可抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)并且能夠激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子而起到減輕炎性反應(yīng)的作用[18]。Elfahri等[19]采用瑞士乳酸菌在37 ℃條件下發(fā)酵牛奶蛋白12 h,獲得含有4～18個(gè)氨基酸殘基短肽混合物,這些短肽可以促進(jìn)人外周血單核細(xì)胞中IL-10和IFN-γ合成分泌而減輕細(xì)胞炎性反應(yīng)。

微生物發(fā)酵的原材料都富含豐富的蛋白質(zhì),并且微生物體內(nèi)含有各種代謝酶,因此控制發(fā)酵過(guò)程條件可以產(chǎn)生不同活性肽,另一方面這些小分子活性肽很容易被人體腸道吸收,從而更好地發(fā)揮它們的作用。

2.4 其它方法

隨著生物活性肽研究的不斷進(jìn)行,除了上述方法,化學(xué)合成、基因工程等方法也用于抗炎肽的制備[20]?；蚬こ谭ㄉ胁煌晟?會(huì)出現(xiàn)翻譯后產(chǎn)物難以修飾,容易形成不恰當(dāng)折疊構(gòu)型等不利影響[21]?；瘜W(xué)合成法是基于抗炎肽氨基酸序列已知情況下,從C斷開(kāi)始添加目的氨基酸的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程。Kim等[22]通過(guò)固相合成法得到一種嵌合肽FKRLKKLISWIKRKRQQNH2,并且發(fā)現(xiàn)該肽可以阻斷RAW264.7中LPS與TLR4受體結(jié)合,從而抑制LPS誘導(dǎo)引起的細(xì)胞炎性反應(yīng)。另外,有學(xué)者選用酸堿降解蛋白質(zhì)從而獲得活性氨基酸和多肽,但是,該法具有產(chǎn)物復(fù)雜、破壞氨基酸、難以控制水解程度和破壞多肽結(jié)構(gòu)等缺點(diǎn)[9]。

3 食源性抗炎肽分離純化與鑒定

抗炎肽的分離純化的進(jìn)步和改進(jìn)與其是否能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化和連續(xù)生產(chǎn)有關(guān)?，F(xiàn)階段,抗炎肽分離純化技術(shù)主要有鹽析法、超濾、凝膠色譜、離子交換色譜和高效逆流色譜等。色譜技術(shù)分辨率和靈敏性高,其在活性肽分離純化中運(yùn)用最廣泛。色譜法相對(duì)傳統(tǒng)的鹽析或者有機(jī)溶劑萃取具有能夠更好地保護(hù)抗炎肽活性的特點(diǎn)。由于通過(guò)酶解或者酸解水解獲得的抗炎肽復(fù)合物成分復(fù)雜,通常樣品在進(jìn)行液相色譜純化前,需要經(jīng)過(guò)色譜柱初步純化,比較常用的有葡聚糖凝膠柱。Ma等[23]人利用葡聚糖凝膠柱結(jié)合高效液相,在波長(zhǎng)280 nm,流速8 mL/min,0.1%TFA水溶液(A)和0.1%TFA乙腈溶液(B)系列梯度(5% B 2 min;50% B 50 min;60%B 62 min)的條件下洗脫,從乳清蛋白中獲得8個(gè)肽,其中只有DYKKY和DQWL能夠減輕LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎性反應(yīng)。超濾可有效獲得不同分子量肽段,從而有效篩選出活性肽片段。目前,利用色譜分離法結(jié)合超濾手段已經(jīng)從禽蛋[24]、牛乳[25]、大豆[26]中分離出各種具有抗炎活性的小分子肽,分子量主要集中在3～10 kDa?？偟膩?lái)說(shuō),根據(jù)待分離的樣品理化性質(zhì)(電荷、分子大小、極性等)和分離方法原理選擇一種或多種結(jié)合的方式,避免分離的盲目性。

對(duì)分離純化所得到的抗炎肽進(jìn)一步進(jìn)行活性和結(jié)構(gòu)分析,繼而可以確定其構(gòu)效關(guān)系,這對(duì)抗炎肽在藥代動(dòng)力學(xué)領(lǐng)域和進(jìn)一步的應(yīng)用具有很大的促進(jìn)作用。傳統(tǒng)測(cè)定蛋白質(zhì)和多肽序列的方法主要是Edman降解和DNA轉(zhuǎn)譯法。目前,隨著質(zhì)譜、色譜等技術(shù)不斷成熟,氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、解析質(zhì)譜、IR、UV光譜、圓二色譜、生物活性鑒定法、放射性同位素標(biāo)記法及免疫學(xué)方法等都已應(yīng)用于多肽類物質(zhì)的結(jié)果鑒定、分析檢測(cè)之中?？焖僭愚Z擊質(zhì)譜(FAB-MS)避免了傳統(tǒng)樣品加熱氣化的缺陷,而且在測(cè)序過(guò)程具有用量少、方便快速、適合小分子肽檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)[27]。除此之外,以已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)制備獲得的多肽,可通過(guò)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)快速確定其結(jié)構(gòu)。MALDI-TOF-MS具有操作簡(jiǎn)單、快速、譜圖直觀等特點(diǎn),能夠準(zhǔn)確測(cè)定分子量和結(jié)構(gòu)序列。Ma等[23]人利用UPLC-Q-TOF-MS手段鑒定從乳清蛋白中分離出的抗炎組分活性肽序列為DYKKY和DQWL。然而,各種方法都有其適用性和局限性,在實(shí)際使用中主要根據(jù)研究目的和效果進(jìn)行選擇和方法聯(lián)用。

4 食源性抗炎肽在體內(nèi)和體外的抗炎活性評(píng)價(jià)

4.1 食源性抗炎肽在細(xì)胞炎癥模型中的抗炎作用

體外細(xì)胞炎癥模型具有快速、經(jīng)濟(jì)、周期短等優(yōu)點(diǎn),因此,由TNF-α或LPS刺激誘導(dǎo)的Caco-2、HT-29和巨噬細(xì)胞等的炎癥模型被廣泛用于各種活性物質(zhì)的篩選與驗(yàn)證研究。近年來(lái),很多學(xué)者利用此模型證實(shí)了來(lái)源于牛奶、雞蛋和大豆等的食源性多肽和蛋白質(zhì)酶解物的抗炎活性,并對(duì)其作用機(jī)制作了初步探討。

眾所周知,牛奶中富含大量的酪蛋白和乳清蛋白,這些蛋白經(jīng)水解、消化或者發(fā)酵可以釋放大量活性肽。研究表明來(lái)自酪蛋白發(fā)酵過(guò)程中的三肽VPP和IPP可以抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性和NO釋放,從而緩解了與粥樣動(dòng)脈硬化有關(guān)的炎癥[17]。Nielsen等[28]通過(guò)酶解酪蛋白得到的混合水解物和多肽能夠抑制被激活的巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放。乳清蛋白水解物通過(guò)減少呼吸道和腸道上皮細(xì)胞IL-8細(xì)胞因子釋放,從而抑制炎癥[29]。乳鐵蛋白不僅具有抗菌作用,其水解多肽在人軟骨和滑膜細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)抗炎作用,表明其在關(guān)節(jié)炎治療中具有潛在的作用[30]。

表1 食源性抗炎肽的分離純化方法以及在體內(nèi)、外的抗炎活性Table 1 Separation and purification of food-derived anti-inflammatory peptides and its anti-inflammatory activity in vitro and in vivo

雞蛋也是抗炎活性肽的一個(gè)主要來(lái)源。Majumder等[31]發(fā)現(xiàn)從雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解物中分離出的三肽IRW和IQW能夠有效地降低促炎細(xì)胞因子的釋放、調(diào)節(jié)NF-κB炎癥信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá),并且表現(xiàn)出抗氧化和抑制ACE活性,從而進(jìn)一步增強(qiáng)其生物活性作用。但是,研究發(fā)現(xiàn)IRW和IQW結(jié)構(gòu)中單獨(dú)的氨基酸卻不顯示這些活性,這說(shuō)明這些生物活性必須基于完整的三肽結(jié)構(gòu),也進(jìn)一步揭示抗炎肽和其構(gòu)象具有重要關(guān)系。

植物性食物(主要是大豆)是抗炎肽和蛋白酶解物的另外一種重要豐富來(lái)源。來(lái)源于大豆酶解物中的三肽VPY,通過(guò)寡肽PepT-1運(yùn)輸通過(guò)Caco-2單層細(xì)胞模型并被吸收,能夠有效減少促炎因子釋放[32]。Hernández-Ledesma等[33]研究發(fā)現(xiàn)大豆抗炎肽Lunasin能夠有效地通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)通路,從而降低LPS誘導(dǎo)引起的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和前列腺素E2產(chǎn)生量。Haria等[34]從小麥面筋中提取的多聚焦谷氨酰亮氨酸(PyroGlu-Leu)可以抑制LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7促炎因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生。

4.2 食源性抗炎肽在動(dòng)物炎癥模型中的抗炎作用

基于抗炎肽在細(xì)胞模型中通過(guò)抑制炎癥因子合成以及調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥信號(hào)通路表現(xiàn)出抗炎作用,一些抗炎肽和蛋白質(zhì)酶解物在結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化等動(dòng)物疾病模型中被進(jìn)一步研究,以探討抗炎機(jī)制及劑量關(guān)系。

乳制品本身就含有很多活性肽,由此,乳源性多肽的抗炎活性在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被大量研究。Chatterton等[35]研究發(fā)現(xiàn),乳源性三肽VPP和IPP在小鼠結(jié)腸炎模型中能夠有效緩解小鼠炎癥癥狀,從而減輕炎癥作用。研究表明,乳清蛋白水解物可以減輕小鼠皮炎癥狀[35],而經(jīng)嗜熱乳酸桿菌發(fā)酵酪蛋白獲得的水解物能夠緩解小鼠結(jié)腸炎[36]。另外一方面,很多植物性抗炎肽和富含抗炎肽的水解物的活性作用也被在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。大豆水解三肽VPY在豬腸道炎癥模型中具有抑制細(xì)胞因子表達(dá)、減少氧化應(yīng)激和保護(hù)機(jī)體組織等活性功能,這表明該肽有望用于治療腸道炎癥[8]。在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型,VPY可以改善小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、減少組織中炎癥因子的表達(dá)、緩解小鼠體重減輕[32]。通過(guò)對(duì)小鼠灌胃玉米水解蛋白,發(fā)現(xiàn)蛋白復(fù)合物能夠減輕小鼠炎癥損傷[37]。

雖然,許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗炎肽在體外細(xì)胞和體內(nèi)動(dòng)物炎癥模型中能夠有效抑制炎癥,但是,關(guān)于抗炎肽在人體內(nèi)是否有抗炎作用以及如何發(fā)揮其作用仍然有待研究,這將對(duì)開(kāi)發(fā)治療炎癥藥物帶來(lái)新的方向。表1總結(jié)了各種食源性抗炎肽的分離純化方法以及在體外和體內(nèi)抗炎作用。

5 食源性抗炎肽的作用機(jī)制

炎癥是一個(gè)受免疫細(xì)胞、代謝酶、炎癥介質(zhì)等因素綜合調(diào)控的復(fù)雜的進(jìn)行性過(guò)程。食源性抗炎肽通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子基因的表達(dá)、抑制炎性介質(zhì)的合成、調(diào)控炎癥信號(hào)通路等方式達(dá)到減輕炎癥的作用。

5.1 調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥因子合成釋放

機(jī)體的免疫應(yīng)答是通過(guò)體內(nèi)錯(cuò)綜復(fù)雜的控制單元調(diào)控完成。在這些控制單元中,細(xì)胞因子的平衡在調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程起著重要調(diào)節(jié)作用。當(dāng)外源性致炎因子刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥,免疫細(xì)胞合成并且釋放相關(guān)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α和抑炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β,其中促炎細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞炎性反應(yīng),使得機(jī)體持續(xù)免疫[43]?？寡纂耐ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌平衡,抑制促炎因子合成并且上調(diào)抑炎因子表達(dá),從而起到減輕致炎因子誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的作用。

Mukhopadhya等[44]研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白水解物和肽片段能夠減少細(xì)胞內(nèi)IL-8分泌,并且在DSS誘導(dǎo)豬結(jié)腸炎癥模型中發(fā)現(xiàn),通過(guò)對(duì)酪蛋白水解物超濾截取獲得的1 kDa分子量肽片段能夠顯著抑制促炎細(xì)胞因子IL-1α、IL-1β表達(dá)。來(lái)源于雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的三肽IRW和IQW在腸上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)減少IL-8、IL-6合成和抑制細(xì)胞粘附分子(ICAM-1和VCAM-1)表達(dá)來(lái)減輕炎癥;而且,在小鼠動(dòng)物炎癥模型中體系,IRW和IQW也能有效降低小鼠結(jié)腸組織中IL-8、IL-6、TNF-α促炎細(xì)胞因子分泌,促進(jìn)IL-10抑炎因子分泌,從而達(dá)到減輕小鼠炎癥的作用[6,31]。大豆三肽VPY在2 mmol/L濃度能夠顯著降低Caco-2和THP-1中IL-6、IL-17、IL-1β、IFN-γ分泌,并下調(diào)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ基因表達(dá)[32]。Millán等[45]研究發(fā)現(xiàn),來(lái)源于羽扇豆抗炎活性肽GPETAFLR可以顯著降低THP-1分化的巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β分泌,并且促進(jìn)因炎因子IL-10分泌。

5.2 抑制炎癥介質(zhì)合成與釋放

炎癥期間,受損組織和T細(xì)胞分泌的代謝酶等化學(xué)介質(zhì)參與炎癥反應(yīng),代謝酶包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶(COX-2),炎癥介質(zhì)有前列腺素(PGE2)和白三烯等。

Noh等從柑橘皮中分離得到的柑橘環(huán)肽XI在LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中表現(xiàn)較好抗炎活性,其作用機(jī)制是抑制iNOS和COX-2代謝酶的表達(dá),從而減少NO和PGE2的合成釋放。另一方面,通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB和MAPK信號(hào)通路減少IL-6、TNF-α促炎因子分泌,阻止炎癥進(jìn)一步惡化循環(huán)[12,46]。源于大豆Lunasin抗炎肽片段,與陽(yáng)性對(duì)照組比較,樣品處理組濃度在0.1 μmol/L時(shí)對(duì)COX-2活性抑制率分別為40.9%±6.6%、45.2%±4.8%和60.5%±2.9%,但是三者對(duì)COX-1活性均沒(méi)有影響[10]。Kim等[22]研究發(fā)現(xiàn)貽貝可食用部分酶解產(chǎn)物MEHs中分子量大于5 kDa的肽片段,在LPS誘導(dǎo)RAW264.7炎癥模型中可減少NO和PGE2分泌,并且抑制iNOS和COX-2基因表達(dá)從而抑制細(xì)胞炎性反應(yīng)。

5.3 調(diào)控炎癥相關(guān)信號(hào)通路及其轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)

雖然抗炎肽能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥因子來(lái)減輕炎癥,但此調(diào)節(jié)作用主要是通過(guò)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)完成的。Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus ki-nase-signal transduction and transcription activator,JAK-STAT)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor-kapa B,NF-κB)是細(xì)胞內(nèi)3條重要信號(hào)通路,在炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控中具有重要意義[47-48],目前研究表明肽的抑制細(xì)胞炎性反應(yīng)作用主要和NF-κB與MAPK通路相關(guān)。

炎癥誘導(dǎo)因子LPS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程首先是激活細(xì)胞膜上特殊受體,主要是CD14和TLR-4,從而活化NF-κB信號(hào)通路[49]。Iskandar等[15]研究發(fā)現(xiàn)高壓處理過(guò)后的乳清蛋白水解物能夠抑制LPS引起的細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-8分泌,但是對(duì)TNF-α和IL-1β誘導(dǎo)刺激細(xì)胞分泌IL-8均無(wú)影響,這充分說(shuō)明乳清蛋白水解物可能是通過(guò)Toll樣受體通路減少促炎因子表達(dá),上調(diào)抑炎因子表達(dá)量。另一方面,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其水解物并不下調(diào)TLR4受體的表達(dá),提示乳清蛋白可能是通過(guò)抑制LPS與Toll樣受體結(jié)合阻止NF-κB信號(hào)通路激活,從而調(diào)控細(xì)胞因子分泌起到調(diào)控炎癥的作用。另外,可能由于蛋白質(zhì)和氨基酸長(zhǎng)鏈空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜,可以與LPS相互作用或結(jié)合,從而減少LPS對(duì)細(xì)胞的刺激作用。Huang等[50]從雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中分離得到的三肽IRW在50 μmol/L通過(guò)抑制IκBα磷酸化阻斷NF-κB細(xì)胞信號(hào)通路,從而減少細(xì)胞膜上粘附分子表達(dá),調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性反應(yīng)。De Mejia等研究表明,在TNF-α誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥模型中,用超濾截取獲得的5 kDa大豆天然抗炎肽片段預(yù)處理巨噬細(xì)胞18 h,發(fā)現(xiàn)該肽片段能夠抑制TNF-α引起與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的p65和p50蛋白表達(dá)量。在TNF-α誘導(dǎo)Caco-2炎癥模型中,膳食風(fēng)味化合物二肽γ-EC和γ-EV通過(guò)刺激鈣離子敏感受體CaSR磷酸化,導(dǎo)致CaSR-β-arrestin2與TNF-α相關(guān)受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,使TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥信號(hào)通路中IκBα和JNK磷酸化減少,從而可阻斷NF-κB通路和MAPK(JNK)通路激活,抑制由TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性反應(yīng)[51]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌發(fā)酵酪蛋白獲得的三肽VPP在體外通過(guò)衰減白細(xì)胞內(nèi)皮相互作用,減少白細(xì)胞滲出,并且抑制炎癥信號(hào)通路JNK減少粗鹽細(xì)胞因子合成與釋放從而起到調(diào)節(jié)炎癥的作用[39]。

食源性抗炎肽可通過(guò)上述炎癥信號(hào)通路的調(diào)控起到抑制炎癥作用,不同的抗炎肽其調(diào)控的信號(hào)通路不一樣。大多數(shù)研究表明,抗炎肽通過(guò)多條信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)炎性反應(yīng),并且調(diào)控信號(hào)通路中細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的表達(dá)?？傊?抗炎肽通過(guò)細(xì)胞信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,其精確的作用和調(diào)控機(jī)制仍然是今后研究的重要方向。

6 展望

隨著對(duì)生物活性肽越來(lái)越多的深入研究,抗炎肽有望作為潛在的抗炎制劑添加到各種功能性食品當(dāng)中起到膳食干預(yù)炎癥的作用,甚至直接用于炎癥治療。但是抗炎肽的篩選、作用機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系以及抗炎肽應(yīng)用仍然有待進(jìn)一步研究。主要從以下幾個(gè)方面:

建立抗炎肽的快速篩選方法：目前抗炎肽篩選方法有限,對(duì)于肽的分離策略一般是以體外活性模型為導(dǎo)向,采用超濾、層析,結(jié)合高效液相色譜等技術(shù)手段進(jìn)行跟蹤式篩選。毫無(wú)疑問(wèn),此思路不但耗時(shí)、成本高,而且存在組分越分離活性越小、體外活性較好但體內(nèi)卻無(wú)活性的風(fēng)險(xiǎn),使得研究無(wú)功而返。因此,有必要研究和建立抗炎肽的快速篩選方法,這將為建立新的肽庫(kù)做出貢獻(xiàn)。

闡明抗炎肽的作用分子機(jī)制：抗炎肽可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌、炎性介質(zhì)合成釋放與調(diào)控炎癥相關(guān)信號(hào)通路等多方面表現(xiàn)出抗炎活性,但目前大多數(shù)研究皆為驗(yàn)證性推論,缺乏深入系統(tǒng)的分子機(jī)制研究。總體上來(lái)講,抗炎肽均是通過(guò)調(diào)節(jié)與炎癥相關(guān)介質(zhì)和細(xì)胞信號(hào)通路來(lái)減輕炎性反應(yīng),但是其是如何達(dá)到此調(diào)控作用的尚需進(jìn)一步闡明,作用機(jī)制的不明確將會(huì)妨礙抗炎肽在醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品等各行業(yè)中的廣泛應(yīng)用。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ),未來(lái),我們應(yīng)該把重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到研究氨基酸代謝與免疫調(diào)節(jié)之間的關(guān)系。

解析抗炎肽的構(gòu)效關(guān)系：抗炎肽的分子量大小、帶電性質(zhì)、甚至酸堿性都可能影響其抗炎活性?，F(xiàn)階段抗炎肽的研究較為薄弱,對(duì)其構(gòu)效關(guān)系僅為簡(jiǎn)單的理論推測(cè),缺乏充足、系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù),不能令人信服。隨著對(duì)抗炎肽的不斷深入研究,我們應(yīng)該將多肽的活性與其空間結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來(lái),如α-螺旋、β-折疊。對(duì)抗炎肽的構(gòu)效關(guān)系的解析不但可為研究其作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ),也可為定向合成、改造、開(kāi)發(fā)具有活性更佳的多肽類產(chǎn)品提供依據(jù)。

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Research progress in the preparation,isolation,identification and anti-inflammatory mechanism of anti-inflammatory peptides derived from food

WANG Xiong1,ZHAO Yan2,XU Ming-sheng1,YAO Yao1,ZHANG Meng-ya1,TU Yong-gang1,*

(1.Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China; 2. Engineering Research Centre of Biomass Conversion,Ministry of Education,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Bioactive peptides are one of the hotspots in the area of life and food science. Antimicrobial activity,antihypertensive effect,immune regulation,anti-viral and anti-inflammaroty activity of peptides have gradually been confirmed,but research on anti-inflammatory of peptides is limited. Chronic inflammation seriously affects human health,and the traditional drugs of inflammatory treatment show some side effects. The development and application of food-derived anti-inflammatory peptides is expected to provide new anti-inflammatory strategy for the body inflammatory response. Therefore,this paper reviewed the preparation,purification,identification and molecular mechanism of food-derived anti-inflammatory peptides. Directions for further study and their potential application in practice were also discussed,which provided a reference for further in-depth study of anti-inflammatory peptides derived from food.

food-derived;anti-inflammatory peptide;inflammation;immune;anti-inflammation mechanism

2017-02-20

汪雄(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：生物活性肽，E-mail:945661038@qq.com。

*通訊作者:涂勇剛(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：動(dòng)物性食品科學(xué)理論與技術(shù)，E-mail:tygzy1212@aliyun.com。

江西省杰出青年人才資助計(jì)劃項(xiàng)目(20162BCB23031)；江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)對(duì)象計(jì)劃項(xiàng)目(20153BCB23028)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20171BAB204027)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)15-0335-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.063