陳楊揚,劉坤娜,李云姣,杜佳峰,霍 超,桑亞新,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北保定 071001;2.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北保定 071001)

副干酪乳桿菌VL8胞外多糖協(xié)同ConA對小鼠脾淋巴細胞增殖及細胞因子分泌的影響

陳楊揚1,劉坤娜2,李云姣1,杜佳峰1,霍 超1,桑亞新1,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北保定 071001;2.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北保定 071001)

本研究以前期從viili中分離得到的一株副干酪乳桿菌VL8為基礎,對其胞外多糖(VL8-EPS)的免疫活性進行了初步探究。首先分離制備小鼠脾淋巴細胞,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測不同濃度的VL8-EPS對小鼠脾淋巴細胞增殖及在其與有絲分裂原共同作用下對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用;雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測細胞因子白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)的含量。結果表明,VL8-EPS在濃度12.5～800 μg/mL范圍內,能顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖;VL8-EPS協(xié)同刀豆蛋白(ConA)也顯著地增強了脾淋巴細胞的增殖作用,且誘導效果高于單獨施用VL8-EPS;并能顯著促進協(xié)同ConA誘導的細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-6的分泌水平。綜上，VL8-EPS顯著地促進了脾淋巴細胞的增殖,并對ConA誘導的脾淋巴細胞的增殖有協(xié)同促進作用,還通過促進細胞因子的分泌發(fā)揮了免疫增強作用,說明VL8-EPS在一定程度上對免疫機制進行了調控。

viili,胞外多糖,副干酪乳桿菌,脾淋巴細胞,細胞因子,免疫調控

viili是一種源自于芬蘭的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品,又叫Vilia、Filia,具有絲狀或線狀的組織,質地粘稠,組織細膩、風味獨特,具有極其宜人的口味和較好的雙乙酰風味。研究發(fā)現(xiàn)viili在發(fā)酵過程中形成一層較厚的黏液樣物質,經(jīng)證實是viili乳制品中副干酪乳桿菌[1]在生長代謝過程中分泌到細胞壁外、易與菌體分離、分泌到環(huán)境中的水溶性多糖[2]。viili中的這種胞外多糖具有降低血液膽固醇含量、抗腫瘤以及促進益生菌與腸黏膜的吸附等重要的生理活性[3]。乳酸菌菌株及其胞外多糖能夠增強細胞介導的免疫反應,如促進T/B淋巴細胞增殖、NK細胞殺滅腫瘤活性、單核細胞吞噬能力、促有絲分裂、釋放細胞因子,從而增強宿主對致病菌的免疫防護作用[4-6]。大量的研究[7-9]表明乳酸菌胞外多糖主要用于研究食品和醫(yī)藥行業(yè)作為免疫增強劑來調節(jié)機體免疫能力。

脾臟作為機體最大的免疫器官,主要是T、B淋巴細胞的聚集場所,而T、B淋巴細胞是機體免疫活性細胞,其激活、分化、增殖在免疫應答過程中起著重要的作用[10-11]。目前,國內外有關乳酸菌胞外多糖的研究較多,但是有關VL8-EPS對體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細胞的免疫調節(jié)作用的研究鮮見報道。因此,本實驗是以VL8-EPS為研究對象,研究VL8-EPS對小鼠脾淋巴細胞的增殖及誘生細胞因子的影響,對VL8-EPS的免疫調節(jié)作用做初步探究,以期為VL8-EPS提高免疫作用機制的研究及其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

VL8-EPS 本實驗室制備[2],不含蛋白、主要由中性多糖組成,其單糖組成為甘露糖∶半乳糖醛酸∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖為1∶2.05∶3.46∶49.66∶16.74;RPMI-1640培養(yǎng)基、刀豆蛋白(ConA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT) 北京索萊寶科技有限公司;無支原體新生牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;IL-2、IFN-γ、IL-6試劑盒 南京建成生物工程研究所;其余化學試劑 均為分析純;清潔級ICR(Institute of Cancer Research)小鼠 雌性,體重(20±2) g 北京華阜康生物科技有限公司。

MCO-18AC CO2培養(yǎng)箱 日本SANYO三洋有限公司;1500-823型酶標儀 Thermo Scientific公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;YS100顯微鏡 Nikon儀器公司;Feb-80電動離心機 天津市華北實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脾細胞懸液的制備 參照文獻[12-15],8～10周齡的小鼠眼球放血,脫頸致死,于75%乙醇內浸泡殺菌5 min,轉移超凈臺內取脾臟,先用RPMI 1640培養(yǎng)液清洗干凈,后轉到200目鋼網(wǎng)及培養(yǎng)皿內研磨,直至培養(yǎng)液發(fā)白為止,細胞懸液1000 r/min離心10 min。3倍體積紅細胞裂解液裂解2 min去除紅細胞,沉淀用PBS清洗三次,離心后靜置3 min。最后沉淀用1 mL含10%無支原體新生牛血清RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸。取出上述細胞懸液0.1 mL于小離心管中,臺盼藍染色1 min后,血球計數(shù)板計數(shù),調整細胞懸液濃度為5×106個/mL。臺盼藍染色檢測細胞存活率大于95%。

1.2.2 VL8-EPS對脾細胞的增殖作用 MTT法觀察VL8-EPS對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用。按上述方法制備脾細胞懸液,取80 μL加入96孔板中,實驗分為空白對照組、VL8-EPS組(終濃度分別為800、600、400、200、100、75、50、25、12.5 μg/mL)以及VL8-EPS協(xié)同ConA組(ConA終濃度分別為5 μg/mL)。每組6個復孔,最后用RPMI 1640培養(yǎng)液調整總體積至160 μL。96孔培養(yǎng)板置于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,在終止培養(yǎng)前4 h,各孔添加5 mg/mL MTT 10 μL,置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出,加入90 μL甲瓚溶解劑[2]培養(yǎng)過夜,酶標儀檢測570 nm處的吸光值,重復實驗3次。

1.2.3 VL8-EPS協(xié)同ConA對小鼠脾細胞分泌細胞因子的測定 按上述方法制備脾細胞懸液加入24孔板中,每孔1 mL,實驗分為ConA單獨刺激組(0.1 mL終濃度5 μg/mL)和VL8-EPS協(xié)同ConA組(VL8-EPS終濃度分別為800、400、200、100、50 μg/mL),最后用RPMI 1640培養(yǎng)液補足體積至1.5 mL。24孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,1000×g離心15 min,收集細胞培養(yǎng)上清液,按ELISA試劑盒操作說明測定脾細胞培養(yǎng)液中IL-2、IFN-γ、IL-6含量,重復實驗3次。

1.2.4 統(tǒng)計分析 組間差異采用統(tǒng)計軟件SPSS Statistics 17.0 作單因素ANOVA 處理,數(shù)據(jù)以均值±標準偏差表示,以p<0.05或p<0.01時,組間差異判斷為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 VL8-EPS對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響

VL8-EPS對脾淋巴細胞增殖作用的影響結果如圖1、圖2所示。

圖1 VL8-EPS對脾淋巴細胞增殖作用的影響Fig.1 Effect of VL8-EPS on proliferation of spleen lymphocyte注:與空白對照組相比,*:p<0.05,**:p<0.01。

圖2 VL8-EPS協(xié)同ConA對脾淋巴細胞增殖的影響Fig.2 Effect of VL8-EPS cooperated with ConA on proliferation of spleen lymphocyte注:與ConA組相比,*:p<0.05,**:p<0.01，圖3～圖5同。

由圖1可見,與空白組相比,單獨施用不同濃度的VL8-EPS的吸光值有不同程度的增加,并且在一定濃度范圍內有一定的劑量關系。在12.5～100 μg/mL低濃度范圍內,VL8-EPS對脾淋巴細胞增殖作用緩慢,且不具有統(tǒng)計學意義,而當VL8-EPS濃度為200、400、600 μg/mL時,能顯著地促進脾淋巴細胞增殖,吸光值比對照組分別提高了8.9%、12.5%和20.4%(p<0.01)。當濃度為800 μg/mL時,達到了最大吸光值,較對照組提高23.7%(p<0.01)。當VL8-EPS協(xié)同ConA作用時結果見圖2,隨著VL8-EPS濃度的增加,VL8-EPS與ConA共同作用對脾淋巴細胞增殖作用逐漸增強(p<0.05),并且在一定濃度范圍內有劑量關系。當VL8-EPS濃度為400 μg/mL時,誘導效果最好,其吸光值比ConA單獨刺激提高49.7%(p<0.01)。以上結果表明,在濃度12.5～800 μg/mL范圍內的VL8-EPS能顯著地促進小鼠脾淋巴細胞的增殖,而且在協(xié)同ConA作用時,其誘導小鼠脾淋巴細胞增殖效果明顯高于單獨施用VL8-EPS。

2.2 VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌細胞因子的影響

2.2.1 VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IL-2的影響 IL-2活化的CD4+T細胞產(chǎn)生的一種重要的T淋巴細胞生長因子,具有廣泛的生物調節(jié)活性。同時IL-2與其受體結合后,能引起T細胞分化、增殖,促進細胞毒T細胞的殺傷作用,增強NK細胞活性[16],其分泌水平高低可以反映機體的免疫功能的強弱。圖3為VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IL-2的影響。

圖3 VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IL-2的影響Fig.3 Effect of VL8-EPS on IL-2 induction of spleen lymphocyte

由圖3可知,不同濃度的VL8-EPS均可促進ConA誘導脾細胞分泌IL-2,其VL8-EPS協(xié)同ConA組的分泌量極顯著高于ConA單獨刺激組(p<0.01),并且隨著VL8-EPS的濃度的增加而逐漸增大,具有量效關系。在多糖濃度為50 μg/mL時,IL-2的分泌量較對照組就提高了26.18%。由此說明,在50～800 μg/mL濃度范圍內,VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IL-2具有促進作用。

2.2.2 VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IFN-γ的影響 IFN-γ作為體內重要的免疫調節(jié)因子具有多種生物活性,主要由活化的T細胞產(chǎn)生,能夠增強Th1細胞活性和細胞免疫功能。VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IFN-γ的影響結果見圖4。

圖4 VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IFN-γ的影響Fig.4 Effect of VL8-EPS on IFN-γ induction of spleen lymphocyte

由圖4可知,不同濃度的VL8-EPS均可促進ConA誘導脾細胞分泌IFN-γ,其分泌量顯著高于ConA單獨刺激組(p<0.01),并且隨著VL8-EPS的濃度的增加而逐漸增大,具有一定量效關系。在較低多糖濃度時(50 μg/mL),IFN-γ的分泌量達到了292.34 pg/mL,在最大多糖濃度時,IFN-γ的分泌量為486.48 pg/mL,比對照組提高了146.17%。由此說明,在50～800 μg/mL濃度范圍內,VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IFN-γ具有極顯著的促進作用。

2.2.3 VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IL-6的影響 IL-6是細胞因子的重要組成部分,不僅能使B細胞前體成為產(chǎn)生抗體的細胞,能促進原始骨髓源細胞的生長和分化,增強自然殺傷細胞的裂解功能。而且還參與機體炎性反應促進免疫球蛋白的產(chǎn)生。VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IL-6的影響結果見圖5。

圖5 VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IL-6的影響Fig.5 Effect of VL8-EPS on IL-6 induction of spleen lymphocyte

由圖5可知,100～800 μg/mL濃度范圍內的VL8-EPS均可促進ConA誘導脾細胞分泌IL-6,其分泌量顯著高于ConA單獨刺激組(p<0.01),并呈現(xiàn)一定的量效關系。在多糖濃度為800 μg/mL時,IL-6的分泌量達到最大含量值279.30 pg/mL,比對照組提高了71.11%。由此表明,VL8-EPS對小鼠脾細胞分泌IL-6具有促進作用。

3 討論

免疫調節(jié)系統(tǒng)是機體執(zhí)行免疫應答的一個重要系統(tǒng),淋巴細胞則是參與機體免疫應答的主要效應細胞[11]。脾臟淋巴細胞中含有T淋巴細胞和B淋巴細胞,它們均是機體的免疫活性細胞,其增殖是反映細胞免疫最直接的指標[17]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),VL8-EPS對小鼠淋巴細胞的增殖作用顯著,并在一定濃度范圍內存在著量效關系。ConA是T淋巴細胞的有絲分裂原,作用于T細胞膜上的相應受體,主要促進T淋巴細胞的增殖[18]。劉翠平[19]等已經(jīng)報道5～80 μg/mL的干酪乳桿菌LC2W胞外多糖可以顯著地促進小鼠脾淋巴細胞的增殖。劉佳[20]等在硒化乳酸菌胞外多糖免疫功能機制研究中發(fā)現(xiàn),在250～800 μg/mL濃度范圍內的硒化乳酸菌胞外多糖顯著地促進了小鼠脾臟淋巴細胞增殖,表明硒化乳酸菌胞外多糖與ConA有協(xié)同作用。據(jù)顧笑梅[21]報道,乳酸菌Z222胞外多糖EPSⅠ單獨作用小鼠脾細胞就能促進體外淋巴細胞增殖,且具有劑量依賴關系。EPSⅠ也可促進ConA誘導的體外小鼠淋巴細胞轉化。本研究發(fā)現(xiàn),VL8-EPS與ConA共同作用對小鼠脾淋巴細胞增殖反應具有明顯的促進作用,由此推斷VL8-EPS可能是淋巴細胞的有絲分裂原,通過誘導細胞分裂、促進淋巴細胞增殖,達到增強機體免疫能力的目的,對調節(jié)機體免疫發(fā)揮重要作用。

細胞因子(cytokine,CK)是免疫原、有絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞產(chǎn)生的低分子量可溶性蛋白質,具有調節(jié)固有免疫和適應性免疫、血細胞生成、細胞生長、APSC多能細胞以及損傷組織修復等多種功能,是免疫系統(tǒng)重要的信息分子,在免疫調節(jié)中充當十分重要的角色[22]。1986年,Mosmann等[23]根據(jù)輔助T細胞活化后分泌細胞因子的不同將其分為Th1和Th2細胞,這兩種輔助性T細胞均從Th0細胞分化而來,在免疫應答反應中維持相互平衡進而調節(jié)機體免疫。Th1細胞主要分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ等細胞因子,通過抑制Th2分化和促進Th1分化使Th1細胞處于優(yōu)勢,介導機體細胞免疫應答反應。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子,主要通過促進Th2分化和抑制Th1分化使Th2細胞處于優(yōu)勢,介導體液免疫反應。Wei[15]等研究發(fā)現(xiàn)滸苔多糖可以增加T淋巴細胞中IFN-γ和IL-2的分泌。吳廣楓[24]等還發(fā)現(xiàn)改性的雙歧桿菌胞外多糖能顯著提高IL-2、IFN-γ細胞因子的含量。鄭乃珍[25]等研究發(fā)現(xiàn)猴頭菇多糖在25～400 mg/L濃度范圍內能顯著協(xié)同ConA刺激Th1細胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)和Th2細胞因子(IL-4、IL-6)的分泌,通過調節(jié)Th1/Th2平衡發(fā)揮免疫調節(jié)作用。且在癌癥治療中發(fā)現(xiàn)IL-2、TNF-α和IFN-γ分泌物增加可以增強身體的免疫功能和抗腫瘤的活動[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn),VL8-EPS協(xié)同ConA可以顯著地促進小鼠脾細胞中IL-2、IFN-γ、IL-6因子的分泌,說明VL8-EPS可以調控機體的雙重免疫功能。

4 結論

綜上所述,VL8-EPS能夠顯著促進小鼠脾淋巴細胞的增殖,并且可協(xié)同ConA促進脾淋巴細胞增殖,還對脾淋巴細胞培養(yǎng)液中細胞因子的分泌有促進作用。由此表明,VL8-EPS可能是通過促進淋巴細胞的增殖及細胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ的分泌發(fā)揮免疫增強作用,而關于VL8-EPS對免疫功能的影響及作用機制還需做進一步深入研究。

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Effect of exopolysaccharides fromLactobacillusparacaseiVL8 cooperated with ConA on spleen lymphocyte proliferation and induction of cytokine in mice

CHEN Yang-yang1,LIU Kun-na2,LI Yun-jiao1,DU Jia-feng1,HUO Chao1,SANG Ya-xin1,*

(1.College of Food Science of Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China; 2.College of Food Science of Technology,Agricultural University of Hebei, College of Biological Engineering,2014 Undergraduate Students,Baoding 071001,China)

The strains oflactobacillusparacaseiVL8 was isolated form viili as base as described previously,futher researching of the immunomodulation of VL8-EPS was investigated. Firstly,preparation of mouse spleen lymphocytes and the proliferation of spleen lymphocytes in mice with different concentrations of VL8-EPS were determined by MTT. The contents of IL-2,IFN-γand IL-6 were determined by using ELISA. The results showed that VL8-EPS at a concentration ranging from 12.5 μg/mL to 800 μg/mL resulted in a significant increase of spleen lymphocyte proliferation,VL8-EPS could also enhance the effect of ConA-induced spleen lymphocyte proliferation and the induction effects was higher than that of single application of VL8-EPS. Moreover,VL8-EPS could significantly increase the secretion level of IL-2,IFN-γand IL-6 in ConA-induced spleen lymphocyte. In summary,VL8-EPS can effectively increase spleen lymphocyte proliferation and enhance the effect of ConA-induced spleen cell growth. VL8-EPS has the ability to enhance immune responses by increasing the secretion of cytokine. It showed that VL8-EPS could regulate the immune mechanisms partly.

viili;exopolysaccharides;lactobacillusparacasei;spleen lymphocyte;cytokine;immunoregulation

2017-02-21

陳楊揚(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：yangyangchen1991@163.com。

*通訊作者:桑亞新(1972-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物和農(nóng)副產(chǎn)品綜合加工利用，E-mail：Sangyaxin@sina.com。

國家公益性行業(yè)科研專項(201205031)；河北省科技廳科技支撐項目(15273202D、16227109D)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)15-0302-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.056