高玉蘭，姚永良，俞黎婭，吳建紅，浦雄勇，黃鋒，夏龍飛

(1.江蘇大學(xué)附屬昆山第一人民醫(yī)院放免科，江蘇蘇州215300；2.江蘇大學(xué)附屬昆山第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州215300；3.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

姜黃素對脂多糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及分子機(jī)制

高玉蘭1，姚永良2，俞黎婭2，吳建紅2，浦雄勇2，黃鋒2，夏龍飛3

(1.江蘇大學(xué)附屬昆山第一人民醫(yī)院放免科，江蘇蘇州215300；2.江蘇大學(xué)附屬昆山第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州215300；3.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

目的研究姜黃素對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)炎癥因子表達(dá)的影響，初步探討可能的分子機(jī)制。方法使用LPS(1 μg)和姜黃素(5 μmol/L、15 μmol/L或30 μmol/L)處理HUVEC細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)和ELISA方法檢測細(xì)胞TNF-α、MCP-1水平；Western blot檢測細(xì)胞TLR4、MAPKs、NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65及NF-κB抑制蛋白IκBα的表達(dá)情況。結(jié)果與空白對照組比較，姜黃素能顯著抑制LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞TNF-α、MCP-1和TLR4的過表達(dá)(P＜0.05)，明顯降低NF-κB p65和MAPKs的磷酸化及IκBα蛋白降解(P＜0.05)。結(jié)論姜黃素可能基于抑制TLR4/NF-κB，從而影響LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。

姜黃素；動(dòng)脈粥樣硬化；脂多糖；核因子-κB；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

作為心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種累及全身血管的病變，其最主要的特征變化就是血管壁內(nèi)脂質(zhì)及炎癥細(xì)胞聚集[1]。目前研究表明AS是內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生紊亂后的炎癥反應(yīng)及在此基礎(chǔ)上的損傷-修復(fù)過程，是血管炎癥性損傷的重要表現(xiàn)[2]。脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中對熱抵抗、只有當(dāng)細(xì)菌崩解破壞后才釋放出來的非蛋白質(zhì)成分，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的強(qiáng)烈激活劑[3-4]。近年來的最新研究發(fā)現(xiàn)，在AS的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，某些炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等起著關(guān)鍵性作用，脂多糖可通過TLR4/NF-κB途徑[5]，間接調(diào)控炎癥因子的表達(dá)，從而激活血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)，誘導(dǎo)細(xì)胞粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子1 (VCAM-1)及E選擇素在VEC表面的表達(dá)增強(qiáng)，促使單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞等與血管內(nèi)皮細(xì)胞相結(jié)合，通過釋放蛋白酶及氧自由基直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞[3]，亦可通過體液免疫反應(yīng)間接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞[4]，最終加速AS的進(jìn)程[5]。姜黃素(curcumin)是一種從姜科植物姜黃等的根莖中提取得到的天然多酚，由于其存在的普遍性，姜黃素早已用于各類疾病的治療[6]。姜黃素已被發(fā)現(xiàn)具有抗炎、抗致癌和抗氧化作用等多種藥理作用[7-9]，Sikora等[10]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素也有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化的功效，從而認(rèn)為其有保護(hù)心血管的作用。Zhong等[11]的最新研究報(bào)道表明：氧化性低密度脂蛋白(OX-LDL)能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)炎癥因子過表達(dá)，然而姜黃素能抑制這一過程。但是，關(guān)于姜黃素能否對LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮的損傷產(chǎn)生影響，目前尚無相關(guān)性的研究報(bào)道。因此，本研究旨在探討姜黃素能否影響LPS誘導(dǎo)HUVEC炎癥因子的表達(dá)，并在此基礎(chǔ)上初步探討可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑HUVEC細(xì)胞(上海中國科學(xué)院細(xì)胞研究所)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(美國Gibco公司)，ELISA檢測試劑盒TNF-α和MCP-1(Thermo Fisher Scientific公司)，兔抗人TLR4、NF-κB p65、ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2、p-NF-κB p65、p-ERK1/2、p-p38MAPK和p-JNK1/2單克隆抗體以及兔抗人NF-κB抑制蛋白(IκB-α)多克隆抗體(Cell Signaling公司)，兔抗人p38MAPK單克隆抗體(SantaCruz公司)，兔抗人β-actin抗體(Protein Tech Group公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體(南京生興生物技術(shù)公司)，RIPA裂解液(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)，總RNA抽提試劑Trizol (Invitrogen公司)，ECL顯色劑(GE Healthcare公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，TAK-242(MedChem Express公司)，姜黃素、LPS(Sigma公司)，采用Oligo7.0設(shè)計(jì)并由上海生物工程公司合成引物，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)HUVEC的細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2濃度、飽和濕度及37℃恒溫的孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿75%～85%培養(yǎng)瓶底部時(shí)，0.25%胰酶消化，細(xì)胞傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用第3～8代細(xì)胞，待細(xì)胞生長融合成單層后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄取1.2.1中培養(yǎng)的狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞，將其按2×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，1 mL無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓過夜。根據(jù)需要將細(xì)胞用不同梯度濃度的姜黃素(5 μmol/L、10 μmol/L或30 μmol/L)預(yù)處理1 h，空白對照組為0 μmol/L，然后加入LPS(1 μg/mL)刺激2 h，棄掉培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗三次，隨后加入1 mL Trizol裂解，將收集的細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至EP管(1.5 mL)中，混勻后于室溫條件下放置20 min，確保裂解充分。最后，將裂解充分的細(xì)胞液，按照Trizol說明書的步驟提取細(xì)胞總RNA，然后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于檢測mRNA的表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞蛋白裂解物的制備按照1.2.2描述的步驟，依次對HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)、饑餓過夜、預(yù)處理、刺激、緩沖液清洗后，將細(xì)胞收集于1.5 mL的EP管中，加入50 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上裂解1 h后，離心收集上清液，用BCA法檢測上清液的細(xì)胞蛋白濃度，于-70℃冰箱中分裝保存。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測TNF-α和MCP-1 mRNA RT-qPCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min；一個(gè)循環(huán)：95℃15 s，62℃20 s，72℃20 s；38個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參基因。TNF-α引物序列為上游：5′-CCATGTCTTTCTACCCTAATC-3′，下游：5′-AGCTGCTCTGTCGGATGAGCA-3′，擴(kuò)增片段為157bp；MCP-1引物序列為：上游：5′-GCTCGCTCAGCCAGATGCAAT-3′，下游：5′-TGGG TTGTGGAGTGAGTGTTC-3′，擴(kuò)增片段為257 bp；β-actin引物序列為：上游：5′-CACGAAACTACCTTCA ACTCC-3′，下游：5′-CATACTCCT-GCTTGCTGATC-3′，擴(kuò)增片段為262 bp。目的基因的相對表達(dá)水平，其數(shù)值等于目的基因拷貝數(shù)與β-actin拷貝數(shù)的比值。

1.2.5 Western blotting分析取1.2.3中收集的細(xì)胞蛋白裂解上清液標(biāo)本(總蛋白100 μg)，加入Loading buffer作用，開水煮沸10 min后，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，然后350 mA轉(zhuǎn)膜2 h，將膜置于5%的脫脂牛奶中室溫封閉1 h；再分別用相應(yīng)的兔抗人抗體，4℃孵育過夜；用TBS/T洗5次，5 min/次；然后用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h；再用TBS/T洗5次，5 min/次，ECL顯色系統(tǒng)定影顯色，使用光密度分析軟件處理分析。

1.2.6 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α和MCP-1水平按照1.2.2描述的步驟，依次對HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)24 h、饑餓過夜、預(yù)處理1 h、刺激24 h后，收集刺激后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書的步驟，分別檢測該上清液中TNF-α和MCP-1的蛋白含量。

1.2.7 TLR4信號(hào)通路測定為了探究姜黃素是否是通過抑制TLR4的炎癥反應(yīng)而抑制其他炎癥因子的過表達(dá)，故用TLR4抑制劑TAK-242(5 μmol/L)和/或姜黃素(30 μg/mL)預(yù)處理HUVEC細(xì)胞1 h后，然后用LPS刺激(1 μg/mL)處理24 h后，采用上述方法，分別檢測該上清液中TNF-α和MCP-1的蛋白含量。

1.2.8 NF-κB信號(hào)通路測定為了觀察姜黃素是否通過抑制NF-κB的途徑，從而抑制LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞TNF-α和MCP-1的表達(dá)，首先采用30 μmol/L姜黃素干預(yù)細(xì)胞，然后用LPS(1 μg/mL)處理細(xì)胞，收集刺激后24 h細(xì)胞總蛋白，利用相應(yīng)抗體進(jìn)行Western blot分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析方法(One-way ANOVA)對單因素處理組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞TNF-α和 MCP-1表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)本實(shí)驗(yàn)研究中，首先用不同梯度濃度(5 μmol/L、10 μmol/L或30 μmol/L)的姜黃素預(yù)先處理HUVEC細(xì)胞，然后加入1 μg/mL的LPS分別刺激2 h和24 h，分別收集刺激2 h和24 h后的細(xì)胞及相應(yīng)的上清液，用于TNF-α和MCP-1基因和蛋白表達(dá)的分析。結(jié)果表明：LPS能夠誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞TNF-α和MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯地的升高，并且姜黃素以濃度依賴性方式抑制TNF-α和MCP-1的過表達(dá)(圖1)，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 姜黃素對LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞表達(dá)TNF-α和MCP-1的影響

圖1 姜黃素對LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞表達(dá)TNF-α和MCP-1的影響

2.2 姜黃素對LPS刺激炎癥因子過表達(dá)的抑制效應(yīng)與TLR4之間的關(guān)系LPS(1 μ g/mL)刺激HUVEC細(xì)胞24 h后，TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加(圖2A、圖2B)。然而，在用姜黃素(30 μmol/L)預(yù)處理的HUVEC細(xì)胞中，能夠抑制LPS刺激TLR4 mRNA(圖2A)和蛋白(圖2B)的過表達(dá)。結(jié)果如圖2C和圖2D所示，用TAK-242和姜黃素預(yù)處理的都能部分抑制LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞TNF-α和MCP-1的過表達(dá)。此外，TAK-242和姜黃素聯(lián)合用藥能協(xié)同逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的TNF-α和MCP-1的表達(dá)(圖2C、圖2D)。結(jié)果表明TLR4可能涉及姜黃素抑制LPS誘導(dǎo)HUVEC的炎癥，見表2。

表2 姜黃素對LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞表達(dá)TLR4、TNF-α和MCP-1的影響

圖2 姜黃素對LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞炎癥的抑制效應(yīng)與TLR4之間的關(guān)系

2.3 姜黃素對LPS刺激HUVEC細(xì)胞NF-κB p65磷酸化和IκB-α蛋白的影響用LPS刺激HUVEC細(xì)胞24 h后，IκBα蛋白顯著降低，而NF-κB p65的磷酸化顯著增加；與空白對照組比較，姜黃素能明顯抑制IκBα蛋白降解和p-NF-κB p65的表達(dá)，見圖3。

2.4 姜黃素對LPS刺激HUVEC細(xì)胞MAPK信號(hào)途徑的影響MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑是重要的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，為了確定MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑是否參與了姜黃素抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。而與對照組比較，LPS (1 μg/mL)處理HUVEC細(xì)胞30 min，p38MAPK、ERK1/2及JNK1/2的磷酸化是顯著增加。然而，姜黃素預(yù)處理HUVEC細(xì)胞1 h后，能顯著減弱MAPKs(p38MAPK、ERK1/2及JNK1/2)的磷酸化(圖4)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該MAPK信號(hào)途徑參與了姜黃素抑制LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

圖3 姜黃素對LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞p-NF-κB p65及IκBα的影響

圖4 姜黃素對LPS刺激HUVEC細(xì)胞MAPKs信號(hào)通路磷酸化的影響

3 討論

AS作為心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，在其早期的病理進(jìn)程中，炎癥細(xì)胞(特別是單核細(xì)胞)與活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)發(fā)生粘附和遷移的過程，被認(rèn)為是形成AS最重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)。大量的研究已經(jīng)表明AS是由多因素導(dǎo)致的，在AS和斑塊不穩(wěn)定性的發(fā)生、發(fā)展中，持久的、低級(jí)別的炎癥反應(yīng)扮演重要的作用[1]。MCP-1可以招募單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)膜和動(dòng)脈壁，從而在炎癥中扮演重要角色[12]。TNF-α則可以通過提高其他炎性細(xì)胞因子等的產(chǎn)生，促進(jìn)粘附分子的表達(dá)來影響白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附及遷移，從而加劇AS病變的進(jìn)程，并引發(fā)形成不穩(wěn)定性的斑塊[13]。此外，炎癥因子的表達(dá)同時(shí)受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)節(jié)。有文獻(xiàn)報(bào)道LPS可激活TLR4/NF-κ B途徑上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1和TNF-α等炎癥因子，參與單核細(xì)胞聚集，啟動(dòng)進(jìn)一步炎癥反應(yīng)[14]。

目前治療AS的主要方法是以降血脂為主，輔以使用對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血栓形成、免疫損傷起抑制作用的藥物。姜黃素是治療AS的常用藥物。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素在緩解炎癥反應(yīng)、抗免疫性疾病、抗氧化等方面也發(fā)揮了重要作用。美國VITY維他命雜志報(bào)道，姜黃素具有抗炎、抗凝、降脂、抗氧化、消除自由基等抗AS和抑制腫瘤生長等多種重要的藥理作用[15-18]。而且，近期Zhong等[11]報(bào)道姜黃素能抑制血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)的過表達(dá)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS能顯著增加HUVEC細(xì)胞TNF-α和MCP-1的表達(dá)，這與先前的報(bào)道一致[15-18]。更重要的是，姜黃素能以濃度依賴的方式有效地抑制LPS誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子(TNF-α和MCP-1)的過表達(dá)。此外，已有一些研究證實(shí)在不同類型的細(xì)胞中，姜黃素也能抑制ox-LDL、PMA誘導(dǎo)的炎癥[19-20]。因此，我們認(rèn)為姜黃素的抗炎作用可能是多重的，而不是特異性針對脂多糖的。我們猜測可能的機(jī)制是姜黃素通過抑制TLR4-MAPKs/NF-κB途徑來調(diào)控HUVEC細(xì)胞TNF-α和MCP-1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一猜測，姜黃素不僅可以抑制LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)，也能減弱NF-κB p65和MAPKs(p38MAPK、ERK1/2及JNK1/2)的磷酸化。說明姜黃素可通過抑制TNF-α和MCP-1的表達(dá)，減少單核細(xì)胞向炎癥部位的遷移以及內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而達(dá)到抗AS的作用。這可能是姜黃素抗AS的作用機(jī)制之一，為臨床應(yīng)用及治療提供了合理的思路和有效的實(shí)驗(yàn)室資料。

綜上所述，姜黃素能衰減LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞TNF-α和MCP-1的表達(dá)；姜黃素抑制炎癥反應(yīng)的能力，可能部分是基于抑制TLR4的活化、抑制ERK1/2、p38 MAPKs、JNK1/2和NF-κB的磷酸化。因此，本實(shí)驗(yàn)研究為姜黃素作為治療AS等慢性炎癥性疾病潛在的治療劑而提供了新的且更加有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of curcumin on inflammatory response induced by lipopolysaccharide in human umbilical vein endothelial cells and its molecular mechanisms.

GAO Yu-lan1,YAO Yong-liang2,YU Li-ya2,WU Jian-hong2,PU Xiong-yong2, HUANG Feng2,XIA Long-fei3.1.Department of Radioimmunoassay,the First People's Hospital of Kunshan Affiliated to Jiangsu University,Suzhou 215300,Jiangsu,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,the First People's Hospital of Kunshan Affiliated to Jiangsu University,Suzhou 215300,Jiangsu,CHINA;3.School of Medicine,Jiangsu University, Zhenjiang 212013,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on the expression of inflammatory response induced by lipopolysaccharide(LPS)in human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)and to explore its molecular mechanisms.Methods The total RNA was extracted from HUVEC treated with LPS(1 μg/L)and curcumin(5,15,or 30 μmol/L)for 24 h.The levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α)and monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1) were detected using real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Western blot was used to detect the activation of Toll like receptor 4(TLR4),mitogen-activated protein kinases(MAPKs),nuclear factor kappa B(NF-κB)p65,phosphor-NF-κB p65 and nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor alpha(IκBα)in the cells.ResultsCompared with the untreated cells,curcumin significantly inhibited the overexpression of TNF-α,MCP-1 and TLR4 in HUVEC cells induced by LPS(P＜0.05),which also significantly reduced NF-κB p65 and MAPKs phosphorylation and IκBα protein degradation.ConclusionCurcumin suppresses LPS-induced inflammatory response in HUVEC in vitro via inhibiting the TLR4/NF-κB pathways.

Curcumin;Atherosclerosis;Lipopolysaccharide(LPS);Nuclear factor kappa B(NF-κB);Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.003

R543

A

1003—6350（2017）15—2418—06

2016-12-01)

江蘇省昆山市社會(huì)發(fā)展科技專項(xiàng)項(xiàng)目（編號(hào)：KS1645）

黃鋒。E-mail：huangfengksrmyy@163.com