林嶺海，黃良喜，劉光明

(惠州市中心人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東惠州516001)

改良環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在瘧原蟲耐藥基因SNP檢測(cè)中的價(jià)值及可行性

林嶺海，黃良喜，劉光明

(惠州市中心人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東惠州516001)

目的探討改良環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)對(duì)常見藥物抗性基因SNP的檢測(cè)價(jià)值及可能性。方法采集非洲赤道幾內(nèi)亞馬拉博地區(qū)醫(yī)院提供的500例當(dāng)?shù)丿懠不颊叩耐庵苎簶颖荆猿彩絇CR為金標(biāo)準(zhǔn)，比較改良環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與其在惡性瘧原蟲耐藥基因SNP檢測(cè)中的反應(yīng)效率、敏感性及特異性。結(jié)果對(duì)照金標(biāo)準(zhǔn)巢式PCR方法，對(duì)500例患者進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法的檢測(cè)符合率為96.4%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。檢測(cè)效率比較顯示，通過(guò)與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，改良LAMP的初反應(yīng)時(shí)間較快，在10 min內(nèi)即起跳并迅速達(dá)到陽(yáng)性反應(yīng)閾值，而巢式PCR擴(kuò)增效率相對(duì)較低，明顯落后于改良LAMP(q渾濁度=6.492，P＜0.001；q反應(yīng)速率=0.931，P=0.079)；敏感性比較顯示，改良LAMP擴(kuò)增的陽(yáng)性反應(yīng)閾值較巢式PCR出現(xiàn)得早，并且隨著時(shí)間推移，反應(yīng)擴(kuò)增量逐漸增加，在反應(yīng)的20 min內(nèi)，改良LAMP反應(yīng)起跳時(shí)間較早(q渾濁度=20.171，P＜0.001；q反應(yīng)速率=0.326，P=0.674)；特異性比較顯示，改良LAMP對(duì)四種瘧原蟲均有較好的特異性，無(wú)論是起跳時(shí)間、擴(kuò)增產(chǎn)物速率均優(yōu)于巢式PCR(q渾濁度=18.619，P＜0.001；q反應(yīng)速率=1.927，P=0.073)。結(jié)論改良環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有較好的反應(yīng)速率、特異性及敏感性，操作簡(jiǎn)便、診斷效率高，值得推廣。

惡性瘧原蟲；抗藥性；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

瘧疾(malaria)是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生事件之一，其中已知的四種致病瘧原蟲中惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum，Pf)致病性及致死率均最高。根據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，非洲撒哈拉沙漠以南地區(qū)發(fā)病率及死亡率居全球首位。目前治療瘧疾的主要手段仍是藥物治療[1]。但隨著瘧原蟲抗藥性的不斷提升，現(xiàn)如今常用的氨基喹啉類、青蒿素類抗瘧藥物藥效已經(jīng)逐漸減弱甚至出現(xiàn)失效的情況[2-3]。目前的檢測(cè)手段主要依賴于體外培養(yǎng)分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，但由于瘧疾高發(fā)區(qū)多為經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)[4-6]，因此如何設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)單易行、靈敏度高的瘧原蟲耐藥性檢測(cè)方法，具有一定的臨床實(shí)用價(jià)值[7]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi于2000年開發(fā)的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，擴(kuò)增后結(jié)果精確率較高，能夠在傳統(tǒng)PCR技術(shù)優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上快速有效地進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的閱讀[8]。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2011年1月至2014年12月非洲赤道幾內(nèi)亞馬拉博地區(qū)醫(yī)院收治的500例當(dāng)?shù)丿懠不颊?，采集外周血液樣本，并收集血液樣本提供人員的年齡、性別、癥狀、耐藥情況等基本信息。

1.2 研究方法①瘧原蟲DNA提?。杭羟?.5 cm× 0.5 cm濾紙血斑后加入500 μL去離子蒸餾水，反復(fù)震蕩后離心(13 600 r/min，4 min)棄上清液，加入自配Chelex-100(160 μL，10%)，震蕩后用56℃孵育2 h，98℃變性8 min，震蕩、離心后置于4℃冷卻；②合成引物合成：選取pfcrt、pfmdrl和K13-propeller[9-10]等突變位點(diǎn)作為本次研究對(duì)象，借助上海生工設(shè)計(jì)合成巢式PCR引物，并對(duì)惡性瘧原蟲患者進(jìn)行抗藥基因SNP檢測(cè)，電泳檢測(cè)條帶大小剩余物由上海英俊公司進(jìn)行測(cè)序；③標(biāo)準(zhǔn)品制備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的耐藥基因及載體序列設(shè)計(jì)In-fusion克隆引物，測(cè)序驗(yàn)證耐藥基因野生型和突變型重組質(zhì)粒，經(jīng)全波段酶標(biāo)儀(Biotek Epoch)測(cè)定濃度，調(diào)整質(zhì)粒倍比稀釋為10-1～10-6μg/μL的標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3 改良LAMP引物設(shè)計(jì)根據(jù)研究的目標(biāo)耐藥基因序列特點(diǎn)，在LAMP引物設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)修正：①設(shè)計(jì)中F3、B3 Tm≈60℃，F(xiàn)IP、BIP Tm≈65℃，擴(kuò)增長(zhǎng)度控制在150～350 bp；②突變位點(diǎn)依托FIP或BIP引物中F1c、B1c、F2、B2中之一的末位，突變位點(diǎn)前一個(gè)堿基根據(jù)引物特異性可設(shè)計(jì)為錯(cuò)配堿基；③根據(jù)各個(gè)基因的野生型末班設(shè)計(jì)MGB修飾的高Tm值阻滯針；④比對(duì)后確定引物特異性；⑤LAMP引物由上海生工合公司合成，運(yùn)用Primer Explorer V4軟件在設(shè)計(jì)LAMP引物的過(guò)程中避免含有二級(jí)結(jié)構(gòu)。最終利用運(yùn)用Primer Explorer V4 LAMP引物抗藥基因SNP相應(yīng)區(qū)域設(shè)計(jì)出4套引物序列：Pfcrt K76T、Pfmdr1 N86Y、Pfmdr1 Y184E、K13-propeller A578S，詳細(xì)信息見表1。

表1 LAMP引物序列

1.4 反應(yīng)體系及條件構(gòu)建重組質(zhì)粒和濾紙血提取的基因組DNA為模板，對(duì)抗喹啉類或青蒿素類藥物基因(pfcrt、pfmdrl和K13-propeller)的SNP檢測(cè)。改良后的LAMP反應(yīng)參考體系為：40 mmol/L Tristan (pH 8.8)、20 mmol/L KCl、16 mmol/L MgSO4、0.20% Tween-20、20 mmol/L(NH4)2SO4、1.6 mol/L Betaine、2.8 mmol/L each dNTPs、1 mmol/L MnCl2、50 μmol/L鈣黃綠素、40 pmol FIP、40 pmol BIP、10 pmol F3、10 pmol B3、20 pmol Block probe、8 U Bst DNA polymerace、20 ng DNA template，滅菌過(guò)濾后蒸餾水25 μL。反應(yīng)條件控制為95℃5 min、60℃60 min、80℃5 min后終止反應(yīng)。利用正交設(shè)計(jì)軟件控制模板、鎂離子濃度、引物、反應(yīng)溫度計(jì)時(shí)間，促使引物融合。

1.5 效果評(píng)價(jià)以巢式PCR(巢式PCR檢測(cè)體系(NP-1993體系)為金標(biāo)準(zhǔn)[11]，比較改良LAMP對(duì)瘧原蟲耐藥基因SNP檢測(cè)的特異性、敏感性，同時(shí)對(duì)其應(yīng)用的可行性進(jìn)行探究。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方差齊性計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，兩組間檢測(cè)效率、敏感性、特異性比較均采用時(shí)間序列分析(ARIMA模型)，計(jì)數(shù)資料比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，有序資料采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 改良LAMP檢測(cè)結(jié)果比較對(duì)照金標(biāo)準(zhǔn)巢式PCR方法，對(duì)500例患者進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法的檢測(cè)符合率為(455+27)/500×100%=96.4%，經(jīng)配對(duì)χ2檢驗(yàn)(McNemar檢驗(yàn))，兩種方法檢測(cè)效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.815)，見表2。

表2 兩組檢測(cè)方法結(jié)果比較(例)

2.2 檢測(cè)效率比較改良LAMP渾濁度與反應(yīng)速率差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.992，P＜0.001)，金標(biāo)準(zhǔn)渾濁度與反應(yīng)速率差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.691，P＜0.001)，改良LAMP通過(guò)與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，渾濁度差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=6.492，P＜0.001)，但反應(yīng)速率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.931，P＜0.079)，說(shuō)明改良LAMP的初反應(yīng)時(shí)間較快在10 min內(nèi)即起跳并迅速達(dá)到陽(yáng)性反應(yīng)閾值，而巢式PCR擴(kuò)增效率相對(duì)較低，明顯落后于改良LAMP，見表3。

表3 兩組檢測(cè)效率比較(%)

表3 兩組檢測(cè)效率比較(%)

組別改良LAMP渾濁度反應(yīng)速率金標(biāo)準(zhǔn)渾濁度反應(yīng)速率例數(shù)500反應(yīng)初反應(yīng)10 min 反應(yīng)20 min 反應(yīng)30 min 反應(yīng)40 min 反應(yīng)1 h 0 0 0 0 0.15±2.00 0.05±1.92 0.41±1.43 0.25±0.91 0.69±1.55 0.05±1.43 0.81±1.33 0.03±1.96 0.92±1.93 0.02±0.81 500 0 0 0 0 0.01±1.92 0.01±0.13 0.11±0.89 0.10±1.22 0.52±1.38 0.03±1.51

2.3 敏感性比較改良LAMP渾濁度與反應(yīng)速率差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=12.955，P＜0.001)，金標(biāo)準(zhǔn)渾濁度與反應(yīng)速率差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q= 16.848，P＜0.001)，改良LAMP通過(guò)與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，渾濁度差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=20.171，P＜ 0.001)，但反應(yīng)速率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.326，P= 0.674)，說(shuō)明改良LAMP擴(kuò)增的陽(yáng)性反應(yīng)閾值較巢式PCR出現(xiàn)得早，并且隨著時(shí)間推移，反應(yīng)擴(kuò)增量逐漸增加，在反應(yīng)的20 min內(nèi)，改良LAMP反應(yīng)起跳時(shí)間較早，見表4。

表4 兩組敏感性比較(%，

表4 兩組敏感性比較(%，

反應(yīng)初反應(yīng)10 min 反應(yīng)20 min 反應(yīng)30 min 反應(yīng)40 min 反應(yīng)1 h組別改良LAMP渾濁度反應(yīng)速率金標(biāo)準(zhǔn)渾濁度反應(yīng)速率例數(shù)500 0.1±0.13 0.1±1.92 0.51±1.13 0.33±1.10 0.63±1.54 0.07±2.10 0.80±1.90 0.03±1.22 0.91±1.04 0.01±0.13 500 0 0 0 0 0 0 0 0 0.12±1.62 0.21±1.19 0.45±1.22 0.06±1.95 0.64±1.91 0.04±1.83

2.4 特異性比較分別用兩種方法對(duì)惡性瘧原蟲進(jìn)行了檢測(cè)并得出渾濁度、反應(yīng)速率，改良LAMP渾濁度與反應(yīng)速率差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=8.560，P＜0.001)，金標(biāo)準(zhǔn)渾濁度與反應(yīng)速率差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=13.493，P＜0.001)，改良LAMP通過(guò)與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，渾濁度差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=18.619，P＜0.001)，但反應(yīng)速率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=1.927，P= 0.073)，說(shuō)明結(jié)果可以看出改良LAMP對(duì)四種瘧原蟲均有較好的特異性，無(wú)論是起跳時(shí)間、擴(kuò)增產(chǎn)物速率均優(yōu)于巢式PCR，見表5。

表5 兩組特異性比較(%

表5 兩組特異性比較(%

組別改良LAMP渾濁度反應(yīng)速率金標(biāo)準(zhǔn)渾濁度反應(yīng)速率例數(shù)500反應(yīng)初反應(yīng)10 min 反應(yīng)20 min 反應(yīng)30 min 反應(yīng)40 min 反應(yīng)1 h 0.1±0.12 0.1±1.90 0.51±1.22 0.39±1.44 0.62±1.90 0.62±1.42 0.78±1.2 0.03±1.10 0.88±1.02 0.01±0.61 500 0 0 0 0 0 0 0 0 0.05±1.92 0.06±1.22 0.41±1.13 0.21±1.92 0.61±1.90 0.01±1.73

3 討論

赤道幾內(nèi)亞共和國(guó)地處非洲中部，屬熱帶雨林氣候，是全世界最不發(fā)達(dá)的國(guó)家之一，衛(wèi)生、經(jīng)濟(jì)條件較差，瘧疾盛行。而其中瘧原蟲滋生是該地區(qū)瘧疾大范圍暴發(fā)的主要原因[12]。青蒿素是祖國(guó)醫(yī)學(xué)通過(guò)現(xiàn)代藥物萃取技術(shù)對(duì)其進(jìn)行提純的一類高效、低毒、副作用小的新型抗瘧藥物，同時(shí)因其對(duì)瘧疾具有良好的治療效果，現(xiàn)已被推薦為治療瘧疾的首選藥物[13]。2000年后隨著瘧疾發(fā)病率逐漸被人類所控制，人們對(duì)瘧疾的成因及治療有了更加深刻的理解，但單方面使用青蒿素會(huì)造成瘧原蟲對(duì)其敏感度的減低，部分地區(qū)甚至出現(xiàn)了耐藥患者[14]，一旦以青蒿素為主的聯(lián)合用藥失去了效應(yīng)，則會(huì)出現(xiàn)大規(guī)模的瘧疾暴發(fā)，最終導(dǎo)致大量的死亡。因此，如何對(duì)惡性瘧原蟲的抗藥性進(jìn)行監(jiān)控，是當(dāng)今瘧疾治療領(lǐng)域的一大重點(diǎn)研究方向。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)惡性瘧原蟲抗藥性研究獲得了新的突破，多種證據(jù)表明惡性瘧原蟲抗藥與其單核酸多態(tài)性(SNP)密切相關(guān)，并通過(guò)SNP作為瘧原蟲抗藥性的重要標(biāo)志物[15]，尋找一種能夠有效、快速進(jìn)行瘧原蟲耐藥基因SNP檢測(cè)的方法是進(jìn)行瘧原蟲抗藥性監(jiān)控的有效途徑。

近年來(lái)隨著人們對(duì)LAMP的研究不斷深入，讓其在瘧原蟲SNP檢測(cè)方面也有了一定的成效，國(guó)外部分學(xué)者對(duì)LAMP進(jìn)行了優(yōu)化，例如Iwasaki率先使用LAMP方法分析細(xì)胞色素中3種等位基因型[16]。Badolo等[17]通過(guò)改進(jìn)Allele specific LAMP從而提高基因突變檢出率。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)任何基于LAMP平臺(tái)的瘧原蟲耐藥基因SNP檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

本研究針對(duì)性地設(shè)計(jì)合成巢式PCR引物，對(duì)惡性瘧濾紙血樣本6個(gè)耐藥蛋白的31個(gè)位點(diǎn)突變情況進(jìn)行分析，從中選出Pfcrt、Pfmdr1、K13-propeller基因的4個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究對(duì)比，對(duì)改良LAMP與巢式PCR技術(shù)對(duì)于瘧原蟲耐藥基因SNP檢測(cè)的擴(kuò)增效率、檢測(cè)特異性和敏感性進(jìn)行了比較，采用濁度儀分別用改良LAMP及巢式PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示改良LAMP與巢式PCR檢測(cè)符合率為(455+27)/500× 100%=96.4%，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明改良后的LAMP檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)一致，均具有良好的準(zhǔn)確性。改良LAMP的擴(kuò)增效率遠(yuǎn)高于巢式PCR，擴(kuò)增速率較為均勻，可20 min內(nèi)起跳并迅速達(dá)到陽(yáng)性反應(yīng)閾值，改良后的LAMP陽(yáng)性檢出率與金標(biāo)準(zhǔn)比較相差不多，但金標(biāo)準(zhǔn)(巢式PCR)反應(yīng)時(shí)間要略遜色于改良后的LAMP，同時(shí)從研究的陽(yáng)性反應(yīng)閾值時(shí)間來(lái)看，改良LAMP的敏感性要更加優(yōu)越，同時(shí)對(duì)反應(yīng)的最低原蟲密度角度分析改良后的LAMP敏感性較巢式PCR要高出10倍左右。文章研究的改良LAMP能夠提高LAMP的單個(gè)堿基突變檢測(cè)，從而通過(guò)改變引物設(shè)計(jì)提高SNP檢測(cè)的特異性，通過(guò)進(jìn)行深層次的抗藥性基因篩查，能夠提前對(duì)抗藥性瘧原蟲的大規(guī)模增殖提供堅(jiān)實(shí)有力的基礎(chǔ)技術(shù)保障，建立一種便捷、有效的抗藥性檢測(cè)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的藥敏實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行快速的抗藥性篩查，應(yīng)用市場(chǎng)較為廣闊。

改良后的LAMP具有敏感性強(qiáng)、特異性高、操作簡(jiǎn)便、診斷效率高等特點(diǎn)，為惡性瘧原蟲抗藥基因SNP診斷研究彌補(bǔ)了此方面的空白，同時(shí)能夠降低篩查的漏診率和誤診率，有效地對(duì)患者瘧原蟲抗藥性進(jìn)行實(shí)時(shí)診斷，為臨床合理用藥提供有效證據(jù)。由于其操作簡(jiǎn)單、能夠迅速做出診斷，因此值得在臨床上推廣應(yīng)用。但是需要注意的是該方法在對(duì)單一蟲種感染還是混合感染做鑒別時(shí)比復(fù)合PCR要復(fù)雜，且用到的Bst DNA聚合酶價(jià)格偏高，成本要略高于巢式PCR；此外，由于改良后的LAMP敏感性較高，被污染后容易造成假陽(yáng)性，因此提取DNA與LAMP反應(yīng)需要區(qū)分開區(qū)域開展，避免出現(xiàn)交叉污染而影響檢測(cè)結(jié)果，若需要檢測(cè)的樣品數(shù)量較大時(shí)，可以每10個(gè)陽(yáng)性樣品間設(shè)計(jì)1個(gè)陰性對(duì)照，讓結(jié)果更為可信。

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Value and feasibility of improved loop-mediated isothermal amplification technique in the detection of SNPs of Plasmodium falciparum resistance gene.

LIN Ling-hai,HUANG Liang-xi,LIU Guang-min.Department of Pharmacy, Huizhou Center People's Hospital,Huizhou 516001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the value and possibility of the SNP detection of the common drug resistance gene by the improved loop-mediated isothermal amplification(LAMP)technique.MethodsA total of 500 peripheral blood samples collected from the local malaria patients in the hospitals of Malabo area of African Equatorial Guinea,using nested PCR as the gold standard,was used to evaluate the reaction efficiency,sensitivity and specificity of the improved loop mediated isothermal amplification technology in the detection of SNPs of Plasmodium falciparum resistance gene.ResultsThe coincidence rates of the two methods in 500 patients were 96.4%,and the difference was not statistically significant(P＞0.05).The comparison of the detection efficiency showed that the initial reaction time of the modified LAMP was faster than that of the nested PCR amplification and reaches the positive reaction threshold quickly in 10 mins,and the nested PCR amplification efficiency was relatively low,significantly behind the improved LAMP(qTurbidity=6.492,P＜0.001;qReactionrate=0.931,P=0.079).The sensitivity comparison showed that the positive response threshold of modified LAMP amplification appeared earlier than nested PCR,and the reaction amplification gradually increased with time.The take-off time of the improved LAMP was early in 20 min(qTurbidity=20.171,P＜0.001,qResponserate= 0.326,P=0.674).The specificity results showed that the modified LAMP had good specificity for the four kinds of malaria parasites,both the take-off time and the rate of the amplified products were better than the nested PCR(qTurbidity= 18.619,P＜0.001;qReactionrate=1.927,P=0.073).ConclusionThe improved LAMP technology has the advantages of better reaction rate,specificity and sensitivity,easy operation and high diagnostic efficiency,which is worthy of promotion.

Plasmodium falciparum;Drug resistance;Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.019

R382.3+1

A

1003—6350（2017）15—2474—04

2017-05-09)

廣東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1614050000695）

林嶺海。E-mail：2735858141@qq.com