董克芝，陳春路，張德省，劉 輝，施 清

(1.中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江綏化152000； 2.國(guó)家酵母技術(shù)研究推廣中心，湖北宜昌443003)

氮源對(duì)酒精酵母的影響及復(fù)合營(yíng)養(yǎng)劑在酒精發(fā)酵中的應(yīng)用

董克芝1，陳春路1，張德省1，劉 輝1，施 清2

(1.中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江綏化152000； 2.國(guó)家酵母技術(shù)研究推廣中心，湖北宜昌443003)

概述了酒精酵母、原料的化學(xué)組成和酒精發(fā)酵時(shí)酵母的營(yíng)養(yǎng)需求，對(duì)尿素作為氮源產(chǎn)生氨基甲酸乙酯（EC）的過(guò)程進(jìn)行分析，闡述了一種酒精發(fā)酵復(fù)合營(yíng)養(yǎng)劑對(duì)酒精酵母的影響和使用該產(chǎn)品帶來(lái)的指標(biāo)優(yōu)化。

酒精酵母； 酒精發(fā)酵； 發(fā)酵促進(jìn)劑； 復(fù)合營(yíng)養(yǎng)； 食品安全

酵母，作為一種常見(jiàn)兼性厭氧微生物，大量用于面食、釀造、保健等領(lǐng)域。用于酒精發(fā)酵的釀酒酵母俗稱酒精酵母，該類酵母要求具備較高的耐滲透壓、耐受一定的底物（糖）和產(chǎn)物（酒精）、低產(chǎn)副產(chǎn)物能力。隨著酒精行業(yè)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的酒精酵母斜面擴(kuò)培技術(shù)早已被酒精高活性干酵母所取代?？梢哉f(shuō)，具備上述特性的酒精高活性酵母早已成為現(xiàn)代酒精工業(yè)生產(chǎn)中所不可或缺的一部分。

然而，縱使各大企業(yè)采用了同質(zhì)化的酒精酵母，但是企業(yè)間因發(fā)酵水平的不同產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益也不盡相同。這其中，既有企業(yè)發(fā)酵設(shè)備的差別，也有發(fā)酵方式的不同，更有工藝條件控制的千差萬(wàn)別。發(fā)酵設(shè)備作為企業(yè)經(jīng)營(yíng)者最直接的資本輸出，受資金和設(shè)備發(fā)展影響巨大；而發(fā)酵方式往往涉及設(shè)備改造，受發(fā)酵設(shè)備影響較大，在此不做具體分析；而工藝條件控制受資金和設(shè)備的影響小得多，更多的與工藝人員自身技術(shù)和理解相關(guān)，具有更多的優(yōu)化空間。酒精發(fā)酵的關(guān)鍵性工藝條件包括營(yíng)養(yǎng)、溫度和保護(hù)劑三大類。本文具體就營(yíng)養(yǎng)一大類中的氮源進(jìn)行分析，闡述復(fù)合氮源營(yíng)養(yǎng)對(duì)酒精酵母的影響，并介紹一種復(fù)合氮源營(yíng)養(yǎng)劑在酒精發(fā)酵中的可行性。

表1 酒精酵母的元素種類及含量[1]

1 酒精酵母、原料的組分

酒精酵母屬于釀酒酵母種之一，酒精酵母的化學(xué)組成與釀酒酵母也高度相似（功能性釀酒酵母除外），酒精酵母的化學(xué)組成見(jiàn)表1。

釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)需求極其復(fù)雜，酒精酵母的化學(xué)組成成分超過(guò)15種[1]，分為大量元素，其他元素以及微量元素，大量元素包括常見(jiàn)的C、H、O、N、P等，其他元素包括Ca、K、Mg、Na、S等，而微量元素則包括Fe、Cu、Zn、Co等。其中，大量元素中的C、H、O作為碳水化合物的主要成分，是原料的主要成分。而N、P和其他元素以及微量元素由于本身含量較低且成本較高而往往被弱化或忽視，尤其以氮源的選擇和利用為甚。大量研究表明，酵母作為一個(gè)類群能夠利用許多不同的化合物作為氮源，已經(jīng)用硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨、氨基酸和尿素做了大量的實(shí)驗(yàn)。這些化合物之間是可以互相轉(zhuǎn)換的[2]。酵母菌（真菌）利用銨鹽作為氮源。如果以硝酸鹽、亞硝酸鹽為氮源，則首先轉(zhuǎn)化成銨根，銨根參與谷氨酸的合成，最后進(jìn)入細(xì)胞氨基酸庫(kù)，進(jìn)入氮源代謝。而尿素及銨鹽作為氮源，則必須經(jīng)過(guò)水解成銨根后供谷氨酸代謝。在以上氮源代謝過(guò)程中，涉及到的非氮源物質(zhì)主要有酶以及酶激活劑，這些物質(zhì)往往需要額外的添加并且必須適量，否則有重金屬中毒的風(fēng)險(xiǎn)[4]。

目前，用于發(fā)酵酒精的原料主要分為三大類：淀粉質(zhì)、糖質(zhì)和纖維質(zhì)，其中，淀粉質(zhì)和糖質(zhì)原料是目前世界范圍內(nèi)使用最廣，研究相對(duì)成熟的發(fā)酵原料。其中，我國(guó)發(fā)酵酒精的主要原料為淀粉質(zhì)原料和少量的糖質(zhì)原料，淀粉質(zhì)原料主要分為玉米和薯類。玉米原料的化學(xué)組成見(jiàn)表2。

木薯原料的化學(xué)組成見(jiàn)表3。

需要說(shuō)明的是，以表2、表3給出的數(shù)值僅僅是代表值，受地域、種類影響，玉米、木薯的化學(xué)組成比例會(huì)有不同。

表2 玉米的化學(xué)組成 (%)

表3 木薯的化學(xué)組成 (%)

從表2、表3可以看出，釀酒酵母的氮含量在7.5%～10%之間，若以粗蛋白含氮量計(jì)算，則釀酒酵母的粗蛋白含量在46.875%～62.5%之間，這個(gè)數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于玉米或木薯中蛋白質(zhì)的含量（假設(shè)該物質(zhì)中的蛋白質(zhì)全部可被酵母利用）。所以，在酒精發(fā)酵中補(bǔ)充氮源，并且補(bǔ)充可被酵母完全利用的可同化氮是非常必要的。

2 氮源的分類

目前，用于現(xiàn)代生物發(fā)酵的氮源分為兩大類：無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮。無(wú)機(jī)氮是植物、土壤和肥料中未與碳結(jié)合的含氮物質(zhì)的總稱。主要有銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮等，這些氮源主要來(lái)自化工生產(chǎn)，且來(lái)源廣泛，價(jià)格相對(duì)較低，使用效果顯著；而有機(jī)氮的概念恰恰相反，有機(jī)氮是植物、土壤和肥料中與碳結(jié)合的含氮物質(zhì)的總稱，如蛋白質(zhì)、氨基酸、酰胺等。這些氮源的獲得隨著現(xiàn)代生物工程的發(fā)展而為人們所熟悉，獲得途徑較為困難，價(jià)格較高，但使用效果具有針對(duì)性。有機(jī)氮根據(jù)來(lái)源，分為三大類：動(dòng)物有機(jī)氮、植物有機(jī)氮和微生物有機(jī)氮。動(dòng)物有機(jī)氮主要有牛肉膏、蛋白胨、魚(yú)粉等，這些物質(zhì)在生物工程領(lǐng)域被廣泛利用，但受認(rèn)證和風(fēng)俗禁忌影響，并不能為全世界所接受，若用于酒精生產(chǎn)，一定程度限制了酒精的銷售范圍；植物有機(jī)氮包括黃豆餅粉（最常用）、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉等，這些物質(zhì)雖來(lái)源廣泛，但往往是食品加工的廢棄物，存在著食品安全的隱患，如果要加工為食品級(jí)原料，則成本會(huì)成倍上升；微生物有機(jī)氮，目前使用最多的是酵母有機(jī)氮。酵母是第一個(gè)為人類所完全測(cè)序的微生物，也是目前被人類所廣泛熟知和接受的。在幾乎所有國(guó)家和地區(qū)，酵母被歸為食品或食品添加劑一類，不論從風(fēng)俗禁忌還是法律法規(guī)都完全符合安全氮源的要求。

3 不同氮源選擇對(duì)酵母及酒精發(fā)酵的影響[5-7]

真菌對(duì)氮源的利用類型是有限制的，除目前沒(méi)有明確的證實(shí)真菌能夠固定分子氮外，大部分真菌能夠同時(shí)利用硝酸鹽、銨鹽和有機(jī)氮，絕大部分真菌不能利用硝酸鹽，僅有少部分真菌只能利用有機(jī)氮源。不同氮源在酵母中的代謝圖見(jiàn)圖1。

圖1 不同氮源在酵母中的代謝圖

目前，我們使用的銨鹽和尿素都是需要經(jīng)過(guò)酵母菌的一級(jí)或多級(jí)代謝形成谷氨酸之后才能進(jìn)一步為酵母所利用，而谷氨酸的合成本身是一個(gè)消耗能量的過(guò)程，而酵母抽提物則不同，氨基酸大量存在于酵母抽提物之中，酵母菌利用氨基酸不需要輔酶（NADPH等）、微量元素（Mn、Fe、Cu、Mg等）參與，也就是不消耗ATP，而ATP的合成需要依靠呼吸作用，呼吸作用需要消耗物質(zhì)，所以使用酵母浸出物（有機(jī)氮）可避免因ATP的合成而消耗原本應(yīng)該轉(zhuǎn)化為酒精的原料，使得這些原料避免被酵母繁殖而消耗，轉(zhuǎn)為酵母菌的酒精發(fā)酵底物，同時(shí)避免了酒精發(fā)酵產(chǎn)生大量的熱量，可節(jié)約冷卻水。

4 尿素生成氨基甲酸乙酯（EC）的代謝途徑

在酒精發(fā)酵過(guò)程中，尿素的來(lái)源主要有兩種：一是在發(fā)酵前作為氮源添加入發(fā)酵液中；二是酵母吸收氮源時(shí)降解精氨酸生成。當(dāng)酵母細(xì)胞內(nèi)尿素含量過(guò)高來(lái)不及吸收利用時(shí)，會(huì)有一部分尿素被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外。分泌到細(xì)胞外的尿素和發(fā)酵前添加的尿素都有可能和發(fā)酵液中的乙醇反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯。氨基甲酸乙酯具有一定的神經(jīng)毒性、強(qiáng)烈的肺毒性和較強(qiáng)的致癌性。在食用酒精中，長(zhǎng)期攝入微量的胺（氨）類物質(zhì)也會(huì)顯著增加各種癌癥的發(fā)病率。胺（氨）類物質(zhì)的存在，嚴(yán)重影響了我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的安全性，限制了我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的出口貿(mào)易和食品文化影響力。

釀酒酵母可同化氮源（YAN）包括銨鹽和含α-氨基氮的氨基酸（脯氨酸除外，它在有氧發(fā)酵時(shí)不能作為酵母的氮源）。釀酒酵母對(duì)氮的吸收分兩步：首先通過(guò)特定的透性酶吸收有效的氮源；其次降解氮源參與氮代謝途徑。

當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)存在多種氮源時(shí)，釀酒酵母會(huì)優(yōu)先利用豐富型氮源如谷氨酰胺、銨鹽、谷氨酸、天冬酰胺等。只有在培養(yǎng)基中缺少上述豐富型氮源或在豐富型氮源已被完全利用的情況下，釀酒酵母才會(huì)開(kāi)始利用精氨酸、尿素、尿囊素、GABA和脯氨酸等貧乏型氮源。這種由缺失豐富型氮源而引起的氮源對(duì)貧乏型氮源的轉(zhuǎn)錄水平上的去阻遏現(xiàn)象就稱之為氮代謝阻遏效應(yīng)（Nitrogen catabolite repression，NCR）。研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母對(duì)幾種氮源利用的先后順序?yàn)樘於彼?谷氨酰胺＞銨鹽＞谷氨酸＞尿素＞GABA＞脯氨酸，即：酵母浸出物＞銨鹽＞尿素。

研究指出，酵母是不能直接利用尿素分子的，酵母只能利用銨態(tài)氮作為自身氮源，所以尿素在進(jìn)入發(fā)酵系統(tǒng)時(shí)，必須經(jīng)過(guò)下面的步驟才能為酵母所利用。

酵母利用尿素的氮同化作用途徑如下：

尿素在酸/堿/尿酶的作用下首先緩慢分解為（NH4）2CO3和 CO2，（NH4）2CO3不穩(wěn)定，分解為 NH4+和CO2：

NH4++α-ketoglutarate（α-酮戊二酸）+NADPH? glutamate（谷氨酸）+NADP+，反應(yīng)由NADP相關(guān)的谷氨酸脫氫酶（NADP-GDH）催化發(fā)生。

Glutamate（谷氨酸）+NH4++ATP→glutamine（谷氨酰胺）+ADP+Pi，反應(yīng)由谷氨酰胺合成酶（GS）催化發(fā)生。

Glutamate（谷氨酸）+NAD+? NH4++NADH+α-ketoglutarate（α-酮戊二酸），反應(yīng)由依賴于NAD的谷氨酸脫氫酶（NAD-GDH）催化發(fā)生。

Glutamine（谷氨酰胺）+α-ketoglutarate（α-酮戊二酸）+NADH→2glutamate（谷氨酸）+NAD+，反應(yīng)由谷氨酸合成酶（GOGAT）催化發(fā)生。

以上反應(yīng)的各步驟涉及到了ATP和NADPH的轉(zhuǎn)化，也就是說(shuō)需要能量的支持。再看酵母浸出物的組分。

作為各大酒精企業(yè)的后盾，安琪酵母股份公司已經(jīng)為各行業(yè)同仁找到了一條有效的途徑。安琪發(fā)酵促進(jìn)劑是由酵母浸出物、酶制劑和營(yíng)養(yǎng)鹽配制的一種復(fù)合型產(chǎn)品，主要用于酒精發(fā)酵過(guò)程。適用于淀粉質(zhì)（玉米、木薯、小麥等）、糖質(zhì)（蔗糖、糖蜜等）、纖維素（甜高梁秸桿等）為原料的酒精發(fā)酵過(guò)程。它能夠促進(jìn)酵母生長(zhǎng)，提高酵母活力；是一種高效營(yíng)養(yǎng)助推器，為酒精酵母提供天然、安全的生物營(yíng)養(yǎng)源；加快酒精發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵周期；總之，該產(chǎn)品能夠豐富酒母繁殖環(huán)境，提高酵母發(fā)酵能力。圖2為酵母由尿素和乙醇反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯示意圖。

5 安琪發(fā)酵促進(jìn)劑在酒精發(fā)酵中的應(yīng)用

在酒精發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌處于主體地位，酵母的生長(zhǎng)和乙醇生成是緊密聯(lián)系在一起的，所以有必要在發(fā)酵過(guò)程中加入相應(yīng)的酵母必需物質(zhì)，創(chuàng)造條件使酵母菌維持旺盛的生長(zhǎng)繁殖能力，避免發(fā)酵不徹底。對(duì)于酒精濃醪發(fā)酵而言，發(fā)酵醪液中的酵母所需營(yíng)養(yǎng)成分顯得格外重要。

圖2 酵母由尿素和乙醇反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯示意圖[3]

酒精是酵母的強(qiáng)毒性代謝產(chǎn)物，一方面酒精抑制酵母對(duì)氨基酸的吸收，影響酵母的生長(zhǎng)、繁殖和代謝，進(jìn)而抑制酒精的生成；同時(shí)酒精還會(huì)破壞細(xì)胞膜中的磷脂雙層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)的組分流失；另一方面，酒精對(duì)酒精脫氫酶也有抑制作用，大大增加了乙醛的毒性。

研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度發(fā)酵條件下，補(bǔ)充不飽和脂肪酸和甾醇等這些影響細(xì)胞膜活性的存活因子，可以抵消酒精的破壞作用，使細(xì)胞膜恢復(fù)原有的通透性和流動(dòng)性，從而穩(wěn)定和提高酒精發(fā)酵產(chǎn)率。同時(shí)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吸收了存活因子后，酵母細(xì)胞在發(fā)酵過(guò)程中耐受酒精的能力有很大提高。

磷脂是細(xì)胞膜的最重要成分。有研究發(fā)現(xiàn)，在酒精發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞中磷脂酰肌醇[Phosphatidylinosito(PI)]含量高時(shí)，酵母菌產(chǎn)酒精的速率和培養(yǎng)基中積累的最終乙醇產(chǎn)量都較高。這表明PI對(duì)于酵母細(xì)胞產(chǎn)酒精速度和高產(chǎn)酒精起到很重要的作用[4]。

復(fù)合酒精發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)劑的出現(xiàn)是對(duì)該領(lǐng)域空白的填充。目前，我廠引進(jìn)了安琪發(fā)酵促進(jìn)劑作為氮源補(bǔ)充。安琪公司通過(guò)對(duì)酵母組分的細(xì)致研究，對(duì)酒精酵母工作機(jī)制的科學(xué)分析，合理配比，開(kāi)發(fā)了以復(fù)合營(yíng)養(yǎng)，兼顧有機(jī)氮、無(wú)機(jī)氮，增加速效、緩釋氮源的新型配方。經(jīng)小試、中試和大生產(chǎn)試驗(yàn)三級(jí)試驗(yàn)證明，該產(chǎn)品完全符合食用酒精濃醪發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)的要求。

6 采用復(fù)合酒精發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)劑的直接指標(biāo)優(yōu)化

采用安琪發(fā)酵促進(jìn)劑并進(jìn)行工藝微調(diào)后，最直接的表現(xiàn)是：①酵母的細(xì)胞數(shù)有一定程度的下降，但是出芽率較對(duì)照有了明顯提升；細(xì)胞形態(tài)較之前更加飽滿、細(xì)胞膜明顯增厚，內(nèi)含物豐富；②生酸值降低了約10%，尤其是揮發(fā)酸，降低幅度達(dá)到50%；③降低了原料處理的蒸汽消耗，降低了由于高溫蒸煮造成的糖分損失；④取消了硫酸的添加，消除了危險(xiǎn)源和酸對(duì)設(shè)備的腐蝕影響；⑤提升了成品酒精的品質(zhì)。

7 總結(jié)

縱觀酒精發(fā)酵工業(yè)這一百多年以來(lái)，技術(shù)工藝漸趨成熟，隨著科技的進(jìn)步，濃醪發(fā)酵是酒精發(fā)酵工業(yè)的必然發(fā)展目標(biāo)和方向，同時(shí)食品安全生產(chǎn)的管理理念必然貫徹在食用酒精生產(chǎn)的整個(gè)環(huán)境中，積極尋找安全營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)物，顯得尤為重要。添加酒精發(fā)酵復(fù)合營(yíng)養(yǎng)劑，可提高細(xì)胞耐滲透壓和底物、產(chǎn)物耐性。從而能有效幫助提高酵母活性、加快酵母耗糖能力、促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程、降低發(fā)酵殘?zhí)?、提高原料出酒率；更能滿足酒精企業(yè)節(jié)糧降耗、降低綜合生產(chǎn)成本和運(yùn)行費(fèi)用的需求，這也會(huì)給酒精工業(yè)的新發(fā)展帶來(lái)非常重要的推動(dòng)作用。

[1] 賈樹(shù)彪,李盛賢,吳國(guó)峰.新編酒精工藝學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2009.

[2] 孫建祥.用小麥淀粉生產(chǎn)酒精的工藝探討[J].釀酒科技,2002(5)：91-93.

[3] 張偉平,趙鑫銳,堵國(guó)成,等.釀酒酵母氮代謝物阻遏效應(yīng)及其對(duì)發(fā)酵食品安全的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2012,18(5)：862-872.

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瀘州老窖窖齡酒上半年完成銷售近10億

本刊訊：據(jù)《中國(guó)酒業(yè)新聞》報(bào)道，四川瀘州老窖窖齡酒類銷售股份有限公司2017年7月2日召開(kāi)2017半年度總結(jié)會(huì)，會(huì)議透露，截止2017年6月20日，窖齡酒公司2017年已完成銷售超六成，銷售額逼近10億，復(fù)合增長(zhǎng)率45%。在品項(xiàng)結(jié)構(gòu)上，轉(zhuǎn)變了以窖齡酒30年為主的產(chǎn)品動(dòng)銷結(jié)構(gòu)，窖齡酒60年銷售占比迅速擴(kuò)大，窖齡酒90年完成包裝升級(jí)與市場(chǎng)布局。（江源薦，黃筱鸝編輯）

來(lái)源：中國(guó)酒業(yè)新聞 2017-07-04

Influence of Nitrogen Source on S.cerevisiae and Application of Compound Nutrient in Ethanol Fermentation

DONG Kezhi1,CHEN Chunlu1,ZHANG Desheng1,LIU Hui1and SHI Qing2
(1.COFCO Energy(Zhaodong)Co.Ltd.,Suihua,Heilongjiang 152000;2.State Yeast Technology Research&Promotion Center,Yichang,Hubei 443003,China)

In this paper,we summarized the chemical composition of S.cerevisiae and the fermentation raw materials,and the nutritional requirement of S.cerevisiae in ethanol fermentation.Then we analyzed the generating process of ethyl carbamate(EC)with urea as the nitrogen source,and introduced the influence of a compound nutrient on S.cerevisiae and its advantages in practice.(Trans.by HUANG Xiaoli)

S.cerevisiae;ethanol fermentation;fermentation accelerator;compound nutrition;food safety

TS262.3；TS261.4；TS261.3

：A

1001-9286（2017）08-0086-05

10.13746/j.njkj.2017204

2017-07-24

董克芝（1971-），女，黑龍江肇東人，本科，工程師，主要從事酒精生產(chǎn)管理工作。

施清（1987-），男，工程師，主要從事發(fā)酵酒精用酵母、營(yíng)養(yǎng)方面的研究工作，E-mail：shiqing@angelyeast.com。