嚴(yán)婉盈，冼燕萍，林曉佳，王強(qiáng)，郭燕華，李秀英*

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東廣州511400）

固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定植物油中膽固醇和維生素E

嚴(yán)婉盈，冼燕萍，林曉佳，王強(qiáng)，郭燕華，李秀英*

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東廣州511400）

建立了固相萃?。⊿PE）凈化結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）同時(shí)檢測(cè)植物油中膽固醇和維生素E四種異構(gòu)體（α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚）的分析方法。樣品采用氨基固相萃取小柱提取凈化，洗脫液經(jīng)DB-5MS色譜柱分離，GC-MS選擇離子監(jiān)測(cè)模式（SIM）測(cè)定。實(shí)驗(yàn)表明，膽固醇和維生素E四種異構(gòu)體在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。方法的回收率為83.9%～108.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.3%～9.3%，膽固醇和α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的檢出限分別為0.2mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.0mg/kg、0.8mg/kg。結(jié)果表明，該方法結(jié)果可靠，可用于日常檢測(cè)。

植物油；膽固醇；維生素E；固相萃??；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

維生素E和膽固醇含量是食用植物油中的重要質(zhì)量指標(biāo)，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食用植物油中的維生素E和膽固醇含量對(duì)鑒定食用植物油產(chǎn)品的質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有積極意義，是食品檢測(cè)領(lǐng)域的重要課題。

維生素E（vitam in E，VE）是一種脂溶性維生素，對(duì)維持人體正常生理功能起重要作用，能延緩人體衰老，促進(jìn)性激素分泌，提高生育能力等；此外，維生素E也是一種重要的抗氧化劑，能減緩食品氧化變質(zhì)。維生素E包括生育酚和三烯生育酚兩類8種化合物，其中生物效價(jià)較高的4種是α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚[1]。

而膽固醇（又稱膽甾醇）則是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物。膽固醇并非是有害物質(zhì)，它存在于動(dòng)物體內(nèi)，是形成動(dòng)物組織細(xì)胞膜、膽汁酸、維生素D以及甾體激素的原料。但過(guò)多食用膽固醇會(huì)引發(fā)高血脂癥，誘發(fā)一系列心腦血管疾病，由于食用植物油中一般不含或含有較少量的膽固醇，因此檢測(cè)食用植物油中的膽固醇成分可以鑒別產(chǎn)品是否摻雜，是否含有膽固醇含量較高的動(dòng)物油脂，從而推測(cè)食用植物油中是否混有地溝油[2]。

目前，維生素E的檢測(cè)方法有比色法、分光光度法、光譜法、電化學(xué)法和色譜法，而色譜法又包括氣相色譜法、高效液相色譜法和超臨界色譜法[3-4]，膽固醇的檢測(cè)方法有比色法、氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法等[5-8]，但關(guān)于維生素E和膽固醇同時(shí)檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道甚少，僅有個(gè)別文獻(xiàn)介紹采用氣相色譜法同時(shí)檢測(cè)雞蛋中α-生育酚和膽固醇[9]。由于植物油中膽固醇含量較少，因此需采用適當(dāng)?shù)母患侄?。固相萃?。╯olid phaseextraction，SPE）是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的[10]。固相萃取作為樣品前處理技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境等樣品的檢測(cè)中[11]。本研究提出用固相萃取法處理食用植物油樣品，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法[12-13]同時(shí)檢測(cè)樣品中的α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和膽固醇[14]。目的是開發(fā)出一種簡(jiǎn)便快捷且抗干擾能力強(qiáng)的方法，用于同時(shí)檢測(cè)植物油中的維生素E和膽固醇，對(duì)于提高食品日常檢測(cè)的效率和可靠度具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆油、玉米油、花生油、葵花籽油等食用植物油均購(gòu)自本地市場(chǎng)；正己烷（色譜純）；丙酮水（98∶2，V/V）混合溶液（色譜純）、維生素E標(biāo)準(zhǔn)品（α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚），純度均＞98%：美國(guó)Supelco公司；膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；弗羅里硅土固相萃取柱（1 g，6m L）、氨基固相萃取柱（1 g，6m L）：CNW Technologies公司；硅膠固相萃取柱（500mg，3m L）：美國(guó)phenomenex公司；去離子水（18.2MΩ·cm）：美國(guó)M illipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A GC-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配7683自動(dòng)進(jìn)樣器）：美國(guó)Agilent公司；MS2M inshaker渦旋振蕩器：德國(guó)IKA公司；固相萃取裝置：美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

準(zhǔn)確稱取0.5 g植物油樣品（精確至0.01 g）于10m L具塞試管中，加入約5m L正己烷，加蓋，渦旋分散1min，將全部樣液轉(zhuǎn)移至氨基固相萃取小柱（使用前用10m L正己烷活化）中，用20m L正己烷淋洗，抽干柱子并棄去以上步驟流出液。用8m L洗脫液（98∶2丙酮和水混合溶液）洗脫，收集于10m L比色管，以上步驟控制柱子流速在1m L/min。然后用洗脫液將收集液定容至10m L，經(jīng)0.22μm聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）微孔膜過(guò)濾，濾液供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別精確稱取α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品各25mg至25m L棕色容量瓶中，以正己烷定容至刻度，配置成1 000mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚使用前按GB/T 5009.82—2003《食品中維生素A和維生素E的測(cè)定》進(jìn)行濃度校正。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：量取適量α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成質(zhì)量濃度為100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.025m L、0.05m L、0.1m L、0.5m L、1.0m L至10m L容量瓶中，用丙酮定容。配制成質(zhì)量濃度為0.25mg/L、0.50mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L和10mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。由于維生素標(biāo)準(zhǔn)品易受光照、溫度等環(huán)境因素的影響，因此配制過(guò)程中要保證避光、現(xiàn)配現(xiàn)用。對(duì)于超出曲線范圍的樣品應(yīng)做適當(dāng)稀釋使之在線性范圍內(nèi)再進(jìn)行測(cè)量。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm× 0.25μm）；載氣為高純度氦氣（純度99.999%），流速1.5m L/m in；進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?20℃保持5min，然后以10℃/m in升至280℃，保持15m in，再以20℃/m in升至300℃，保持2min，進(jìn)樣量1μL；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電離能量70 eV；離子源溫度230℃；四級(jí)桿溫度150℃；傳輸線溫度280℃；溶劑延遲6m in，采用選擇離子掃描定量。目標(biāo)物的保留時(shí)間、特征離子見表1。

表1 膽固醇和維生素E四種形式的保留時(shí)間、特征離子Table 1 Retention time,characteristic ions of cholesteroland four kinds of vitam in E isomers

1.3.4 實(shí)驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化方法

以5種目標(biāo)化合物的回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察分散溶劑為正己烷、丙酮以及二氯甲烷時(shí)，固相萃取柱為弗羅里硅土固相萃取柱、氨基固相萃取柱、硅膠固相萃取柱，淋洗溶劑（正己烷）用量為5～25m L，洗脫溶劑（丙酮水混合溶液）的水百分含量為1.0%～5.0%時(shí)，各參數(shù)對(duì)目標(biāo)化合物的回收率的影響，確定前處理?xiàng)l件的最優(yōu)參數(shù)；并對(duì)色譜柱的類型進(jìn)行考察，以目標(biāo)化合物的分離度及響應(yīng)值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選出理想的色譜柱。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 分散溶劑的選擇

植物油樣品黏度較大，上柱前應(yīng)進(jìn)行稀釋，選擇與油互溶性良好的有機(jī)溶劑（正己烷、丙酮以及二氯甲烷）作為分散劑，比較3種溶劑對(duì)加標(biāo)量為20mg/kg的加標(biāo)樣品的分散情況及5種目標(biāo)化合物在氨基固相萃取柱上的回收率，回收率計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 不同分散溶劑對(duì)各目標(biāo)物回收率的影響Table 2 Effect o f different dispersion so lvent on the recovery rate of each target compound

由表2可知，用極性較大的丙酮和二氯甲烷作為分散劑稀釋樣品上柱時(shí)，目標(biāo)物在固相萃取柱上的保留率為22.4%～36.5%，而用正己烷稀釋油樣上柱時(shí)，5種目標(biāo)物回收率達(dá)92%以上，因此選擇正己烷作為分散劑對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后上柱富集凈化。

2.1.2 固相萃取柱的選擇

分別使用弗羅里硅土固相萃取柱[15]、氨基固相萃取柱、硅膠固相萃取柱[2]3種正相萃取柱對(duì)加標(biāo)量為20mg/kg的加標(biāo)樣品進(jìn)行富集凈化處理，以20m L正己烷淋洗，10m L 98%丙酮水溶液洗脫，比較其凈化回收率。結(jié)果如圖1所示，3種固相萃取柱對(duì)5種目標(biāo)化合物的凈化回收率均較好，而氨基柱回收率最接近100%，因此選擇氨基柱作為凈化固相萃取柱。

圖1 不同固相萃取柱凈化回收率比較Fig.1 Comparison of purification recovery rate of different solid phase extraction

2.1.3 淋洗溶劑和洗脫溶劑的考察

選擇氨基固相萃取柱凈化常用的淋洗溶劑正己烷，考察其用量分別為5m L、10m L、15m L、20m L和25m L時(shí)對(duì)雜質(zhì)的淋洗效果及回收率，結(jié)果見圖2。由圖2可知，淋洗劑用量對(duì)回收率的影響不大，但用量20m L以上色譜的總離子流圖顯示雜質(zhì)較少，因此選擇正己烷淋洗劑用量為20m L。

圖2 樣品的GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of samples analysis by GC-MS

氨基固相萃取柱凈化常用極性溶劑作為洗脫液，丙酮是強(qiáng)極性溶劑，能把目標(biāo)物從固相萃取柱中洗脫出來(lái)，加入一定量的水能降低填料對(duì)目標(biāo)物的吸附能力從而更易被洗脫，最終目的是使目標(biāo)物最大程度隨洗脫液流出。但有文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)表明，含水量過(guò)多會(huì)使回收率降低[6]，同時(shí)由于氣相色譜柱對(duì)水僅有一定耐受性，進(jìn)樣初期水分未能完全揮發(fā)可能會(huì)損害色譜柱。因此要控制水分的比例。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了水的含量分別是1.0%、2.0%、3.0%和5.0%的丙酮溶液對(duì)5種目標(biāo)物的洗脫效果，回收率計(jì)算結(jié)果見圖3。由圖3可知，丙酮中水的百分含量在2%以上時(shí)可獲得良好的回收率，為了保護(hù)色譜柱，選擇丙酮∶水（98∶2，V/V）作為洗脫溶劑。

圖3 丙酮中水的百分含量對(duì)凈化回收率的影響Fig.3 Effect of the percentage ofwater in acetone on purification recovery rate

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究的5種目標(biāo)化合物均是環(huán)鏈型結(jié)構(gòu)，極性基團(tuán)較少，因而極性較弱，因此選擇極性較弱的色譜柱進(jìn)行分離，考察DB-1MS和HP-5MS毛細(xì)管氣相色譜柱對(duì)目標(biāo)物的保留和分離情況[16]，在優(yōu)化的條件下5種目標(biāo)化合物的SIM模式下總離子流色譜圖見圖4。

圖4 DB-1 MS（A）和HP-5 MS（B）色譜柱分離5種目標(biāo)化合物的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chrom atogram s of five target compounds separation by co lumn DB-1 MS(A)and HP-5 MS(B)

由圖4可知，兩種色譜柱對(duì)5種目標(biāo)物均有較好的保留，分離情況良好，但是DB-1MS的保留時(shí)間稍長(zhǎng)，且HP-5 MS的應(yīng)用更為廣泛，因此選擇HP-5MS作為分離的色譜柱。

2.3 線性關(guān)系、檢出限

在優(yōu)化條件下，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，擬合線性方程和相關(guān)系數(shù)R，結(jié)果見表3。

表3 目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Tab le 3 Linear equation,correlation coefficient,detection lim it and quantitative lim it of target com pounds

由表3可知，5種目標(biāo)物在0.25～10mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均＞0.999。以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限，結(jié)合樣品的前處理過(guò)程，計(jì)算出方法的檢出限為0.2～2.0mg/kg。

2.4 精密度和回收率

選擇大豆油樣品進(jìn)行了低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量分別為5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，對(duì)中間加標(biāo)水平連續(xù)測(cè)量5 d，計(jì)算方法的回收率和精密度，結(jié)果見表4。

表4 回收率與精密度測(cè)試結(jié)果Table 4 Results of recovery rate and precision tests

由表4可知，5種目標(biāo)物的平均回收率為83.9%～108.0%，日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandard deviation，RSD，n=6）為1.3%～9.3%，日間精密度（n=5）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.2%～9.3%，表明該檢測(cè)方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確性。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)從市場(chǎng)購(gòu)買的10份植物油（大豆油2份、玉米油3份、花生油2份和葵花籽油3份）中膽固醇及維生素E進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 5 Determ ination results of actualsamples

由表5可知，樣品中均檢出膽固醇，含量為0.41～0.74mg/kg，玉米油和葵花籽油均檢出維生素E，含量范圍為12.9～632mg/kg。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)食用油中膽固醇和四種維生素E含量的方法，樣品中的膽固醇和維生素E經(jīng)過(guò)氨基固相萃取柱凈化提取，用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分離分析，外標(biāo)法定量分析，方法的精密度和回收率均滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)要求，檢出限低，與現(xiàn)行國(guó)標(biāo)相比，樣品經(jīng)過(guò)固相萃取柱凈化處理并采用具有強(qiáng)抗干擾能力的氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)，有效降低樣品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；且能同時(shí)檢測(cè)植物油中兩項(xiàng)重要指標(biāo)膽固醇和維生素E，更好地滿足日常檢測(cè)需要。

[1]陳樹東，林曉佳，吳鐘玲，等.固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定植物油中的維生素E[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（6）：710-712.

[2]周永生，羅士平，孔泳.固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)地溝油中膽固醇[J].色譜，2012，30（2）：207-210.

[3]別瑋，劉韋華，王琳麗，等.食用植物油中天然維生素E檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代儀器與醫(yī)療，2015，21（6）：6-9.

[4]向慧敏，代志凱，吳陽(yáng)鋒，等.維生素E檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品添加劑，2011（3）：180-188.

[5]王蕊.測(cè)定雞蛋中膽固醇含量方法的探討[J].畜禽業(yè)，2002（12）：4-5.

[6]吳鐘玲，何仲?gòu)?qiáng)，郭茂章，等.固相萃取-GC/MS法測(cè)定油脂膽固醇含量的研究[J].包裝與食品機(jī)械，2011，29（6）：20-23.

[7]周蓉，沙雪，趙國(guó)輝，等.應(yīng)用固相萃取技術(shù)快速檢測(cè)植物油中膽固醇含量[J].分析儀器，2012（3）：95-97.

[8]廖連英，韓飛，趙質(zhì)創(chuàng)，等.食用植物油中膽固醇含量的快速測(cè)定[J].化學(xué)分析計(jì)量，2012，21（2）：32-33.

[9]金米聰，王立，符展明.毛細(xì)管氣相色譜法同時(shí)測(cè)定雞蛋中的膽固醇和α-維生素E[J].色譜，2001，19（5）：478-480.

[10]李存法，何金環(huán).固相萃取技術(shù)及其應(yīng)用[J].天中學(xué)刊，2005，20（5）：13-16.

[11]李廣慶，馬國(guó)輝.固相萃取技術(shù)在食品痕量殘留和污染分析中的應(yīng)用[J].色譜，2011，29（7）：606-612.

[12]徐忠，陸步詩(shī)，李新社，等.GC-MS法測(cè)定白酒塑化劑樣品前處理方法的選擇與優(yōu)化[J].中國(guó)釀造，2015，34（1）：137-142.

[13]王貴雙，高麗華，趙俊平，等.氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定食品中甜蜜素定性分析的探討[J].中國(guó)釀造，2011，30（12）：171-172.

[14]廖連英，韓飛，趙質(zhì)創(chuàng)，等.食用植物油中膽固醇含量的快速測(cè)定[J].化學(xué)分析計(jì)量，2012，21（2）：32-33.

[15]王貴雙，高麗華，趙俊平，等.固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定糧谷中17種有機(jī)氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留[J].中國(guó)釀造，2010，29（11）：165-168.

[16]羅赟，孫成均.氣相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中四種維生素E異構(gòu)體[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（4）：824-826.

Simultaneousdeterm ination of cholesteroland vitam in E in vegetableoilby solid phase extraction and gas chromatography-massspectrometry

YANWanying,XIAN Yanping,LIN Xiaojia,WANGQiang,GUO Yanhua,LIXiuying*
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,Guangzhou 511400,China)

An analysismethod wasestablished for the simultaneousdetection of cholesteroland four kindsof vitam in E isomers(alpha tocopherol,beta tocopherol,gamma tocopheroland delta tocopherol)in vegetableoilusing solid phaseextraction(SPE)and gas chromatography-massspectrometry (GC-MS).Sampleswere concentrated and purified by NH2SPE cartridges.The eluentwas separated by DB-5MS capillary chromatographic column and detected by selected ionmonitoring(SIM)modeof GC-MS.Experiments resultsshowed that the cholesteroland four kindsof vitam in E isomers were linear in their respective concentration range.The recovery rate of themethod for target compoundswas83.9%-108.0%.The relative standard deviation(RSD)was1.3%-9.3%.Limits of detection of cholesterol and alpha tocopherol,beta tocopherol,gamma tocopherol and delta tocopherol were 0.2mg/kg,1.0mg/kg,2.0mg/kg,2.0mg/kg,and 0.8mg/kg,respectively.The results showed that the analysismethod was reliable and can be used for daily inspection.

vegetableoil;cholesterol;vitamin E;solid phaseextraction;GC-MS

TS207.3

0254-5071（2017）08-0168-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.037

2017-03-08

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2016A030310102）

嚴(yán)婉盈（1991-），女，助理工程師，本科，研究方向?yàn)槭称芳跋嚓P(guān)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)。

*通訊作者：李秀英（1984-），女，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称芳跋嚓P(guān)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)。