薛正楷，薛原，楊根慶，張宿義，倪斌，6

（1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院白酒學(xué)院，四川瀘州646001；2.瀘州市生物醫(yī)學(xué)工程研究所，四川瀘州646000；3.同濟(jì)大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，上海200016；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗科，河南新鄉(xiāng)453003；5.瀘州老窖股份有限責(zé)任公司，四川瀘州646000；6.瀘州江潭窖酒業(yè)有限公司，四川瀘州646300）

產(chǎn)己酸菌LysinibacillusfusiformisSigA基因的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析

薛正楷1，2，薛原3，楊根慶4，張宿義5，倪斌5，6

（1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院白酒學(xué)院，四川瀘州646001；2.瀘州市生物醫(yī)學(xué)工程研究所，四川瀘州646000；3.同濟(jì)大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，上海200016；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗科，河南新鄉(xiāng)453003；5.瀘州老窖股份有限責(zé)任公司，四川瀘州646000；6.瀘州江潭窖酒業(yè)有限公司，四川瀘州646300）

通過克隆產(chǎn)己酸菌LysinibacillusfusiformisSigA全長基因，并對其進(jìn)行表達(dá)和生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，SigA基因開放閱讀框（ORF）有1 128個堿基，編碼327個氨基酸，其分子質(zhì)量為45.275 kDa；生物信息學(xué)預(yù)測表明，L.fusiformis與Lysinibacillussphaericus具有較近的親緣關(guān)系，二者序列相似度達(dá)97%；該蛋白為親水性可溶性蛋白，與Bacillus sp.B14905相似度達(dá)100%，其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和loop環(huán)狀構(gòu)成，α-螺旋和loop環(huán)狀分別占其二級結(jié)構(gòu)的60.15%和37.79%；預(yù)測并優(yōu)化的三級結(jié)構(gòu)由14個α-螺旋和15個loop構(gòu)成。

產(chǎn)己酸菌；Lysinibacillusfusiformis；SigA基因；生物信息學(xué)

細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄是一個復(fù)雜的過程，由多種分子共同調(diào)控，其中核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）聚合酶是催化轉(zhuǎn)錄合成RNA的重要酶，也是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵酶，是以脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或RNA為模板合成RNA的酶，全酶是由核心酶及一個獨立的亞基σ因子兩部分組成。σ因子參與了轉(zhuǎn)錄起始的各個過程，包括啟動子的定位、啟動子的解鏈、起始RNA的合成、脫離啟動子等過程[1-3]。σ因子種類繁多，目前在美國國家生物技術(shù)信息中心（nationalcenterofbiotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中，細(xì)菌σ因子基因序列已高達(dá)31 236條。σ因子按其功能，可分為σ70和σ54家族，σ70屬于細(xì)菌σ因子的一個家族，它是以大腸桿菌中70 kDa的σ因子命名，可分為四個亞族：初級σ因子、類初級σ因子、選擇性σ因子以及孢子形成相關(guān)σ，其中的初級σ亞家族中的σD（rpod）是最主要的σ因子，負(fù)責(zé)與細(xì)胞生長相關(guān)的超過1 000個基因的轉(zhuǎn)錄控，尤其是與生存相關(guān)基因的表達(dá)，是調(diào)原核生物抗脅迫的最佳對象[4-6]，被廣泛用于隨機突變篩選高抗脅迫性的突變菌株，取得了較好的應(yīng)用價值[7-10]。

己酸菌是一類產(chǎn)己酸微生物，在濃香型白酒生產(chǎn)過程中，生活在窖泥和糟醅中的己酸菌，代謝產(chǎn)生的己酸與糟醅中乙醇作用，生成了己酸乙酯，己酸乙酯是濃香型白酒主體香物質(zhì)，在很大程度上決定著濃香型白酒的品質(zhì)，因此，提高己酸在糟醅中的濃度是提高濃香型白酒質(zhì)量的關(guān)鍵[11-12]。由于濃香型白酒發(fā)酵過程中，低酸度和高乙醇濃度等脅迫條件的限制，己酸生長和代謝受到嚴(yán)重影響，因此，如何增強己酸菌的抗脅迫能力，日益成為提高己酸菌產(chǎn)己酸特性的理論和技術(shù)依據(jù)。

本研究擬采用基因工程的方法，以產(chǎn)己酸菌的Lysini bacillusfusiformis為出發(fā)菌，克隆其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子rpod基因SigA，并在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行實物信息學(xué)分析，以期為構(gòu)建原位超表達(dá)SigA工程菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株Lysinibacillusfusiform is：本實驗室保存；pET32（+）：重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥工程公司范開教授惠贈提供。

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA純化試劑盒：天根生化科技有限公司；2×TSINGKEMaster M ix（blue）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑盒、DL2000和感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）：北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaI和Hind III：美國Fermentas公司；TAKARA DNA Ligation Kit Ver.2.1：寶生物工程（大連）有限公司；GeneRulerTMDNA Ladder M ix（100～10 000 bp）：美國Thermo Fisher Scientific公司；DL15000 Plus：瑞楚生物科技有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：碧云天生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：成都科龍試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

BSD-YF3600全溫培養(yǎng)搖床：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：金壇市良友儀器有限公司；SCIENTZ.IID超聲波細(xì)胞粉碎機：寧波新芝生物科技有限公司：759MC紫外可見分光光度計：上海箐海儀器有限公司；DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠；梯度PCR儀：杭州艾普儀器設(shè)備股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因SigA表達(dá)載體的構(gòu)建

（1）引物設(shè)計及合成

采用引物設(shè)計軟件，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中L.fusiform is SigA序列，設(shè)計PCR引物：上游引物為GTACCCGGGGA TATCTCTAGAATGGCGGACAAGTCAGAACG，下游引物為GACACTATAGAATACAAGCTTTTATTCTAAGAA GTCTTT TAGACGTTTACTACG。上下游引物斜體部分分別為XbaI和HindII酶切位點，將設(shè)計引物送上海捷瑞生物技術(shù)公司合成。

（2）L.fusiform is基因組DNA的提取

取L.fusiformis甘油菌，在固體乙酸鈉培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，3 d后挑單菌落入乙酸鈉液體培養(yǎng)基中，34℃、0.08MPa條件下靜置培養(yǎng)8～10 d，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行L.fusiform is總基因組提取，并進(jìn)行基因組濃度測定。

（3）基因SigA的PCR擴(kuò)增及純化

以L.fusiform is總基因組DNA為模板，建立PCR反應(yīng)體系：上、下游引物（10μmol/L）各1μL，2×TSINGKEMaster M ix 25μL，總DNA 1μL，ddH2O 22μL，總體積50μL；反應(yīng)條件：95℃、3min，95℃、24 s，60℃、25 s，72℃、60 s，72℃、5m in，32個循環(huán)，PCR產(chǎn)物結(jié)束后，采用天根公司普通產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

（4）基因SigA的PCR純化產(chǎn)物的雙酶切及與原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a（+）的連接

基因SigA的PCR純化產(chǎn)物和pET32a（+）按Fermentas XbaI和Hind III提供的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，并進(jìn)行酶切產(chǎn)物的純化；將目的基因與pET32a（+）片段按照DNA Ligation KitVer.2.1使用說明書提供的方法進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染BL21(DE3），篩選陽性克隆，進(jìn)行菌落PCR，挑取菌落PCR驗證正確的菌落至3m L含100μg/m L氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，采用天根公司質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗證，將酶切驗證正確的質(zhì)粒，送上海生工工程公司測序，測序結(jié)果采用Chromas2.41軟件進(jìn)行分析。

1.3.2 基因SigA的誘導(dǎo)表達(dá)

挑pET-rpod單克隆至5m L 100μg/m L的氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h后，按1∶20接種至5m L 100μg/m L的氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，37℃、180 r/min培養(yǎng)2.5 h，加異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）至終濃度為1mmol/L，30℃、180 r/m in繼續(xù)培養(yǎng)OD值至0.4～0.6，后放置于冰上過夜。

取上述培養(yǎng)液1m L，4℃、10000g×離心10m in，去上清，加入8mol/L尿素，煮沸6～8min至菌液澄清，冷卻至室溫，10 000 g×離心5min，取60μL上清，加10μL 5×buffer，煮沸3～5m in，冷卻至室溫，取10μL上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacry lam ide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測。

1.3.3 基因SigA的生物信息學(xué)分析

采用NCBI的blast工具繪制L.fusiformis SigA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹；運用Expasy tool軟件分析L.fusiform is rpod理化性質(zhì)、疏水性。

采用在線工具預(yù)測L.fusiformis rpod因子的二級結(jié)構(gòu)，采用Phyre2軟件構(gòu)建L.fusiformis rpod三維結(jié)構(gòu)，并運用分子動力學(xué)程序中的SPC（simple pointcharge）水模型、GROMOS54A7 force field力場、在溫度為300K條件下，做步長為1ns分子動力學(xué)模擬優(yōu)化，并取出最后一組坐標(biāo)生成程序數(shù)據(jù)庫文件（program database file，PDB），采用Discovery studio2.5軟件對優(yōu)化后的結(jié)果進(jìn)行拉曼分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.fusiform is SigA基因的克隆

以L.fusiformis基因組DNA為模板，擴(kuò)增SigA基因。結(jié)果見圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物增凝膠電泳圖Fig.1 Gelelectrophoresis of PCR amp lification products

由圖1可知，經(jīng)1%凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 140 bp左右，與理論值相符。

2.2 L.fusiformis SigA基因表達(dá)載體pET-SigA的構(gòu)建

目的基因轉(zhuǎn)化后陽性克隆的菌落PCR和其質(zhì)粒雙酶切結(jié)果分別見圖2和圖3。

圖2 菌落PCR凝膠電泳圖Fig.2 Gelelectrophoresis of colony PCR products

由圖2可知，泳道1菌落為pET-rpod陽性克隆。由圖3可知，酶切產(chǎn)物符合pET32（+）和SigA基因大小，因此，菌落PCR和雙酶切結(jié)果表明，pET-SigA表達(dá)載體初步構(gòu)建成功。將菌落PCR鑒定正確的菌落搖菌后取1m L菌液送上海生工工程公司進(jìn)行進(jìn)一步測序鑒定。

圖3 質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.3 Double enzyme digestion of plasm id

2.3 基因SigA的表達(dá)

基因SigA重組表達(dá)細(xì)菌株與空載體細(xì)菌株IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，上清進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見圖4。

圖4 SigA基因的表達(dá)Fig.4 Expression o f gene SigA

由圖4可知，pET-SigA重組菌株表達(dá)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小在45 kDa左右，符合rpod大小特征，且其表達(dá)量明顯高于對照組（BL21空載體組），表明SigA基因在大腸桿菌中得到超表達(dá)。

2.4 以L.fusiform isSigA基因序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將rpod基因測序結(jié)果采用NCBI中blast工具獲得不同物種序列，選取其中與L.fusiformis SigA基因序列覆蓋度超過75%的序列，采取鄰位連接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖5。

圖5 L.fusiform is以SigA基因序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of L.fusiform is based on gene SigA

由圖5可知，L.fusiform is與Lysinibacillus sphaericus和Lysinibacillus varians GY32菌株具有較近的親緣關(guān)系，其相似度分別達(dá)97%和87%，三者間只有點突變，沒有插入或缺失突變。

2.5 L.fusiform is rpod的理化性質(zhì)

對L.fusiformisSigA基因序列首先采用expasy translate軟件采用獲得氨基酸序列，結(jié)果見圖6，并運用expasy protparam軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析。

圖6 L.fusiform is rpod氨基酸序列Fig.6 Am ino acid sequence of rpod in L.fusiform is

由圖6可知，L.fusiform is rpod具有375個氨基酸，分子質(zhì)量為45.275 kDa；理論等電點為4.73；在波長280 nm時，其消光系數(shù)為19 940 L/（mol·cm）；在大腸桿菌的體內(nèi)的預(yù)測半衰期＞10 h；其不穩(wěn)定指數(shù)為52.65，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪族氨基酸指數(shù)為89.05，這是由于分子中含有較多的谷氨酸和精氨酸所致。

2.6 L.fusiform is rpod氨基酸序列相似性分析

采用NCBIblast工具，獲得L.fusiform is rpod的同源序列，將其與其他細(xì)菌σ70序列采用軟件進(jìn)行UPMAG聚類分析，結(jié)果見圖7。

圖7 L.fusiform is rpod與其細(xì)菌σ70的UPMAG聚類分析Fig.7 UPMAG cluster analysis o f rpod in L.fusiform is and bacteriaσ70

由圖7可知，L.fusiform is rpod的氨基酸序列與Bacillus sp.B14905的rpod序列最相似，二者相似度達(dá)100%；與Lysinibacillus macroides、Lysinibacillus sphaericus、Lysinibacillus sp.FJAT-14222、Lysinibacillus sp.AC-3和Lysinibacillus xylanilyticus的σ70的相似性也達(dá)99%，表明Lysinibacillusfusiform is rpod氨基酸序列同源性高，也說明σ70在進(jìn)化過程中比較保守。

2.7 親疏水性分析

采用軟件分析L.fusiform is rpod的親疏水性，結(jié)果見圖8。

圖8 L.fusiform is rpod的親疏水性Fig.8 Hydrophily and hydrophobicity of L.fusiform is rpod

由圖8可知，L.fusiform is rpod分子其中親水性最高的氨基酸為多肽鏈上137位的谷氨酸，其親水性分值高達(dá)-2.833；疏水性最高的是位于多肽鏈149和150位的亮氨酸和纈氨酸，其疏水性分值為1.5；該蛋白總的親水性平均系數(shù)為-0.705，預(yù)測該蛋白屬于親水性蛋白。

2.8 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

L.fusiform is rpod的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果見圖9。

圖9 L.fusiform is rpod二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Secondary structure prediction of L.fusiform is rpod

由圖9可知，L.fusiformis rpod因子分子中α-螺旋占60.15%，loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)占37.79%，β-折疊股占僅2.06%。2.9三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

預(yù)測并優(yōu)化的L.fusiform is rpod三維結(jié)構(gòu)見圖10A，其拉曼圖分析結(jié)果見圖10B。

由圖10A可知，模擬的L.fusiform is rpod三級結(jié)構(gòu)與模板分子pdb數(shù)據(jù)庫中的5UH8均為只有螺旋和環(huán)這2種二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋均為14個，15個loop，說明本研究預(yù)測結(jié)果與晶體結(jié)構(gòu)較相符合；由圖10B可知，其拉曼圖中蛋白質(zhì)分子325個氨基酸中有4個分子處于不允許構(gòu)象，其允許構(gòu)象達(dá)98.77%，表明本研究模擬結(jié)構(gòu)合理。

圖10 L.fusiform is rpod三級結(jié)構(gòu)預(yù)測、優(yōu)化及評價Fig.10 Tertiary structure prediction,optim ization and evaluation o f L.fusiform is rpod

3 結(jié)論

rpod是微生物啟動轉(zhuǎn)錄過程管家轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)近1 000個基因的表達(dá)，在對抗微生物環(huán)境脅迫的過程中起了關(guān)鍵的作用，因此，對該基因進(jìn)行遺傳修飾并定向篩選有利突變，實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄組水平上改造微生物表型的分子育種新方法[13-14]。

本研究利用瀘州老窖180余年老窖池窖底泥分離的產(chǎn)己酸菌Lysinibacillusfusiformis克隆了rpod轉(zhuǎn)錄因子基因SigA，測序結(jié)果表明，基因ORF有1 128個堿基，編碼327個氨基酸，其分子質(zhì)量為45.275 kDa，該蛋白在BL21細(xì)胞中成功進(jìn)行了表達(dá)，表明蛋白質(zhì)主要以可溶性蛋白形式存在。進(jìn)一步，采用鄰位連接法建立該基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，表明該L.fusiformis與Lysinibacillus sphaericus和Lysinibacillus varians GY32具有較近的親緣關(guān)系；理化分析表明，該轉(zhuǎn)錄因子為親水性蛋白，其中親水性最高的氨基酸為多肽鏈上137位的谷氨酸，其親水性分值達(dá)-2.833；對該蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白主要由α-螺旋構(gòu)成和loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，二分別占60.15%和37.79%；拉曼圖分析結(jié)果表明，該模擬結(jié)構(gòu)合理，符合立體化學(xué)規(guī)則。由于，目前對產(chǎn)己酸微生物主要集中于生產(chǎn)應(yīng)用研究，對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子研究較少，因此本研究將為rpod轉(zhuǎn)錄因子在產(chǎn)己酸微生物菌種改良方面研究提供理論和應(yīng)用依據(jù)。

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Cloning,expression and bioinformaticsanalysisofgene SigA in hexanoic acid-producing Lysinibacillusfusiform is

XUEZhengkai1,2,XUEYuan3,YANGGenqing4,ZHANG Suyi5,NIBin5,6
(1.SchoolofLiquor-making Engineering,Luzhou Vocationaland TechnicalCollege,Luzhou 646001,China;2.Institute ofBiomedical Engineering,Luzhou 646000,China;3.SchoolofChemicalScience and Engineering,TongjiUniversity,Shanghai200016,China; 4.Departmentof Inspection,the Third Affiliated HospitalofXingxiang MedicalUniversity,Xinxiang 453003,China; 5.Luzhou Laojiao Group Co.,Ltd.,Luzhou 646000,China;6.Luzhou Jiangtanjiao Co.,Ltd.,Luzhou 646300,China)

The full-length of gene SigA,which encodes transcription factor rpod,was cloned from hexanoic acid-producing Lysinibacillus fusiform is, meanwhile,the expression and bioinformatics analysiswere carried out.The results demonstrated that the open reading frame(ORF)of gene SigA contained 1 128 bases,encoded 327 am ino acids and itsmolecularmass was 45.275 kDa.The bioinformatics prediction results showed that L. fusiform is and Lysinibacillussphaericus had a closegenetic relationship,and the similarity was97%.The predicted protein wasa hydrophilic soluble protein,and the similarity to Bacillus sp.B14905wasup to 100%.Thesecondary structurewasmainly composed ofalphahelix and loop ring,two of whichwere60.15%and 37.79%,respectively.The predicted and optimized tertiary structure consisted of14 alpha-helix and 15 loops.

hexanoic-acid producing bacterium;Lysinibacillusfusiformis;SigA;bioinformatics

TS262.1

0254-5071（2017）08-0120-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.026

2017-05-31

四川省科技支撐計劃項目（NO.2014FZ0018）；瀘州市生物工程研究所重點項目（BME201702）

薛正楷（1968-），男，副研究員，博士，研究方向為微生物代謝工程。