楊小沖，陳忠軍*，趙潔，蔡佳敏，王譯萱，胡佳星

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

耐高酒精野生酵母菌株的篩選及其特性研究

楊小沖，陳忠軍*，趙潔，蔡佳敏，王譯萱，胡佳星

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

以從內(nèi)蒙古各旗縣果園的果實和土壤中分離得到的200株酵母菌為出發(fā)菌株，經(jīng)四級篩選最終得到一株酒精耐受力為16%vol的菌株K1-2，并對該菌株的發(fā)酵特性與生物學特性進行了研究。結果表明，該酵母菌的最適生長pH值為5.5，最適生長溫度為28℃，最高可耐受600mg/L的SO2，在葡萄糖含量為60%的條件下仍可生長。發(fā)酵5 d后糖醇轉(zhuǎn)化率可達68.45%，產(chǎn)酒精度為6.4%vol，表明該菌株是一株具有良好酒精耐受性與發(fā)酵性能的酵母菌株，除擁有較高的耐SO2與耐高糖能力以外，還具備較強的產(chǎn)酒精能力，有很高的應用價值。

耐酒精；酵母；特性；篩選

酵母菌是釀酒工業(yè)主要微生物。在發(fā)酵過程中，酵母所產(chǎn)酒精含量達到一定濃度后則會對其自身產(chǎn)生毒害作用，當酒精度為4%vol時，便會使一些酵母菌株對糖、離子及氨基酸的吸收率降到50%[1]，只有當發(fā)酵醪液中酒精度＜3.8%vol時，酒精對酵母菌株的抑制作用才能夠忽略不計[2]。隨著進一步發(fā)酵，酒精濃度的升高，酵母菌的增殖速度及存活率逐漸受到抑制，發(fā)酵也隨之終止，導致原料利用率與酒精產(chǎn)量均較低，大大增加了生產(chǎn)成本。

目前，人們常常采用自然選育、誘變育種、基因工程育種、全局轉(zhuǎn)錄工程及基因組重排育種等技術手段來選育耐酒精的酵母菌株[3]，但關于酵母菌乙醇耐受機理尚不明朗，研究表明，酵母耐酒精應答過程極其復雜，涉及到細胞壁、熱休克蛋白、貯藏性糖類[4]及膜蛋白氨基酸組分[5]等，酵母乙醇耐受作用機制仍有待進一步探究。本研究采用自然選育的方法，篩選出一株耐高酒精的酵母菌株，對其生物學及發(fā)酵特性進行研究，以期在其發(fā)酵過程中可以保持良好的細胞活性和發(fā)酵性能，達到提高乙醇產(chǎn)品產(chǎn)量與質(zhì)量的目的，在降低企業(yè)生產(chǎn)成本、緩解能源短缺及環(huán)境污染等方面作用十分重大。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

200株酵母菌種：分離自內(nèi)蒙古各旗縣果園的果實和土壤中；大豆蛋白胨、酵母浸膏：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖：上海山浦化工有限公司；瓊脂：北京奧博星生物技術有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）、無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；硫酸銨、磷酸二氫鉀、亞硫酸：天津化學試劑三廠；硫酸鎂：天津市致遠化學試劑有限公司；以上實驗所用試劑均為分析純。

TTC上層培養(yǎng)基[6]：TTC 0.05g、葡萄糖0.5g、瓊脂1.5 g、水100m L、煮沸2min滅菌；

TTC下層培養(yǎng)基[6]：酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastpeptone dextrose，YPD）瓊脂培養(yǎng)基；

YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、大豆蛋白胨10 g、酵母浸膏10 g、水1 000m L、pH=6.0、115℃滅菌20min；

YPD固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、大豆蛋白胨10 g、酵母浸膏10g、瓊脂20g、水1000m L、pH=6.0、115℃滅菌20m in；

發(fā)酵培養(yǎng)基[7]：葡萄糖200 g、酵母浸膏10 g、大豆蛋白胨20 g、硫酸銨1 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂1g、水1 000m L、pH=2.5、115℃滅菌20m in。

1.2 儀器與設備

PB-10賽多利斯pH酸度計：德國賽多利斯公司；SE602F電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司；HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實驗設備廠；752紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；PAL-1糖度儀：日本ATAGO公司；WZB數(shù)顯折光儀：上海儀電物理光學儀器有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺：濟南來保醫(yī)療器械有限公司；SPX-160BF-2生化培養(yǎng)箱：上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化

將試驗所用菌株接種到YPD液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)48 h后，按照2%的接種量，將其接到空白YPD液體培養(yǎng)基中，并28℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)上述操作再次進行傳代，將三代菌懸液作為以下試驗所用菌種的種子培養(yǎng)物。

1.3.2 耐高酒精酵母菌株的篩選

（1）一級篩選（TTC產(chǎn)酒精試驗）：將200株酵母菌株采用劃線的方法接種于TTC下層培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，在TTC下層培養(yǎng)基上覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基[8]，并于28℃恒溫培養(yǎng)3 h，觀察培養(yǎng)平皿中的顯色情況，比較各菌株之間的產(chǎn)酒精能力，顯色情況越明顯，顏色越深的菌株則為產(chǎn)酒精能力相對較強的菌株[9]。

（2）二級篩選（杜氏小管產(chǎn)氣試驗）：將經(jīng)一級篩選挑選出的產(chǎn)酒精能力相對較強的酵母菌株，按照5%的接種量分別接種于帶有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基中，排盡小管中的氣體，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h，觀察并記錄杜氏小管中的產(chǎn)氣情況[10]。

（3）三級篩選（試管發(fā)酵試驗）：將經(jīng)過一級和二級篩選最后所得菌株，按照5%的接種量分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃的條件下靜置培養(yǎng)3 d，測定各發(fā)酵液的二氧化碳失質(zhì)量及殘?zhí)橇?，以此來衡量酵母菌株的發(fā)酵性能[11]。

（4）四級篩選（酒精耐受試驗）：將經(jīng)過一級、二級和三級篩選最后所得菌株，按照5%的接種量分別接種于酒精度為6%vol、8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol、18%vol的YPD液體培養(yǎng)基中，并于28℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值），通過比較各菌懸液的吸光度值篩選出耐酒精性能較強的菌株。

1.3.3 耐酒精酵母菌株的生物學特性研究

（1）最適生長pH試驗：將所得的耐高酒精酵母菌株分別按照5%的接種量接種于不同pH值（1.5、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）的YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值）。

（2）耐SO2試驗：將亞硫酸添加到滅菌后的YPD液體培養(yǎng)基中，分別配制使SO2濃度為50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L的YPD液體培養(yǎng)基，分別將篩選所得耐高酒精酵母菌株按照5%的接種量接種于不同SO2質(zhì)量濃度（50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L）的YPD液體培養(yǎng)基中[12]，于28℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值）。

（3）最適生長溫度試驗：將篩選所得的耐高酒精酵母菌株分別按照5%的接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，分別于20℃、28℃、36℃、44℃、50℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值）。

（4）耐高滲試驗：采用劃線的方法將篩得的耐高酒精酵母菌株分別接種于不同濃度葡萄糖（10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%）的YPD固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)48 h后，觀察各耐高酒精酵母菌株的生長情況。

（5）生長曲線：將篩得的各耐高酒精酵母菌按照2%的接種量分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，并每間隔2h，在波長600 nm處測定其定吸光度值（OD600nm值），根據(jù)所測OD600nm值，繪制各耐高酒精酵母菌株的生長曲線圖[13]。

1.3.4 耐酒精酵母菌株的發(fā)酵特性研究

將篩選出的各耐高酒精酵母菌株，按照5%的接種量分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基[14]中，于28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每間隔24 h測定一次發(fā)酵液的二氧化碳失質(zhì)量，發(fā)酵5 d后測定發(fā)酵培養(yǎng)基中殘?zhí)橇?、總酸、還原糖、總酯、酒精度、揮發(fā)酸含量及發(fā)酵液的pH值[15]。

1.3.5 檢測方法

殘?zhí)橇浚翰捎帽銛y式PAL-1糖度儀測定；二氧化碳失質(zhì)量[16]：采用電子天平精稱的方法測定，每發(fā)酵24 h稱量發(fā)酵液質(zhì)量，與24 h前發(fā)酵液質(zhì)量的差值則為二氧化碳失質(zhì)量；總酸含量[17]：采用指示劑法，利用酸堿滴定原理根據(jù)堿標準溶液的用量測定總酸含量；揮發(fā)酸含量的測定方法參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；總酯含量[18]：利用回流皂化反應測定總酯含量；酒精度[17]：將發(fā)酵液蒸餾后采用酒精計法測定酒精度；pH：采用pH酸度計測定；還原糖含量[17]：采用直接滴定法，利用斐林試劑測定還原糖含量；糖醇轉(zhuǎn)化率[19]：按照公式S=（C/G）×100%進行計算，式中：S為糖醇轉(zhuǎn)化率，%；C為酒精度，%vol；G為消耗糖度，°Bx。

2 結果與分析

2.1 耐高酒精酵母的篩選

（1）一級篩選：通過觀察各培養(yǎng)平皿中的顯色情況，比較各菌株之間的產(chǎn)酒精能力，從200株酵母菌株中共篩出65株顏色較深、產(chǎn)酒精能力相對較強的菌株，并將其作為二級篩選的出發(fā)菌株。

（2）二級篩選：通過觀察一級篩選出的65株酵母菌在不同時刻下杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，在48 h后共篩出41株具有產(chǎn)氣性能較好的酵母菌株，其中有25株優(yōu)勢菌株在24h時杜氏小管已充滿氣體，將此25株酵母菌株作為三級篩選的出發(fā)菌株。

（3）三級篩選：將經(jīng)過二級篩選出的25株菌進行試管發(fā)酵試驗，直至發(fā)酵3d為止，測各發(fā)酵液的二氧化碳失質(zhì)量及殘?zhí)橇浚ǔ跏继橇繛?6.7°Bx），其檢測結果如表1所示。

表1 三級篩選試驗結果Table 1 Resu lts of tertiary screening tests

由表1可知，菌株HJ-2、HJ-1、HJ-3、K1-3、K1-2相對于另20株酵母菌發(fā)酵液CO2失質(zhì)量均＞0.40g，殘?zhí)橇烤?°Bx。在這25株酵母菌株中菌株K1-2發(fā)酵液CO2失質(zhì)量最多為0.47g，菌株XM-2與XM 3-2發(fā)酵液CO2失質(zhì)量最少為0.14 g，較菌株K1-2相比CO2失質(zhì)量低0.33 g。菌株HJ-1發(fā)酵液殘?zhí)橇孔畹蜑?.6°Bx，其次為菌株HJ-2發(fā)酵液殘?zhí)橇繛?.7°Bx，發(fā)酵液殘?zhí)橇孔罡叩臑榫闤M-1，為14.3°Bx，表明菌株XM-1對糖的利用率最低。通過分析選擇酵母菌株HJ-2、HJ-1、HJ-3、K1-3、K1-2作為四級篩選出發(fā)菌株。

（4）四級篩選：將三級篩選后所得到的5株酵母菌進行四級酒精耐受性試驗，其結果如表2所示。

由表2可知，隨著培養(yǎng)基中酒精濃度的增加，5株酵母菌的OD600nm值逐漸減小，表明隨著培養(yǎng)基中酒精度的增加，菌株的酒精耐受性也隨之降低。其中菌株HJ-1、HJ-2、HJ-3與K1-2在酒精濃度為10%vol的條件下，生長開始受到了影響，而菌株K1-3在培養(yǎng)基酒精度為8%vol時其生長便受到了抑制。酒精耐受性最強的為菌株K1-2，在酒精度為16%vol的條件下仍可存活，其次為菌株HJ-2與K1-3，酒精耐受力為14%vol，菌株HJ-1與HJ-3的酒精耐受性最差為12%vol。通過將5株酵母菌株酒精耐受力的比較，將菌株K1-2作為實驗菌株，對其進行特性研究。

表2 5株酵母菌的酒精耐受試驗結果Tab le 2 Results of alcoho l tolerance tests of 5 yeast strians

2.2 耐酒精酵母菌株的生物學特性研究

2.2.1 菌株最適生長pH

酵母菌K1-2在不同pH條件下的生長情況，如圖1所示。

圖1 菌株K1-2在不同pH值下的生長狀況Fig.1 Grow th status of strain K1-2 at different pH values

由圖1可知，當培養(yǎng)基中pH在2.0～5.5之間時，菌液的OD600nm值隨pH的增大呈上升趨勢；當pH值為5.5時，菌液OD600nm值達到最大，表明酵母菌K1-2生長最好，繼續(xù)增大pH值，菌液OD600nm值開始呈下降態(tài)勢，因此，菌株K1-2最適生長pH值為5.5。

2.2.2 菌株SO2耐受性

酵母菌K1-2在不同質(zhì)量濃度SO2條件下的生長情況，如圖2所示。

由圖2可知，隨著SO2質(zhì)量濃度的增大，菌株K1-2菌液的OD600nm值逐漸變小，說明SO2質(zhì)量濃度越大，對菌株K1-2的抑制作用越強。當SO2質(zhì)量濃度為600mg/L時，菌株K1-2仍可存活，說明酵母菌K1-2具有較強的耐SO2能力。

圖2 菌株K1-2在不同SO2質(zhì)量濃度下的生長狀況Fig.2 Grow th status of strain K1-2 at different SO2concentration

2.2.3 菌株最適生長溫度

酵母菌K1-2在不同溫度下的生長情況，如圖3所示。

圖3 菌株K1-2在不同溫度下的生長狀況Fig.3 Grow th status of strain K1-2 at different tem perature

由圖3可知，隨著培養(yǎng)溫度的增加，菌株K1-2菌液的OD600nm值呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當培養(yǎng)溫度為28℃時，菌液OD600nm值達到最大；繼續(xù)升高培養(yǎng)溫度，菌液OD600nm值隨培養(yǎng)溫度的升高而逐漸減小，因此，菌株K1-2最適的生長溫度為28℃。

2.2.4 菌株耐高滲試驗

采用劃線的方法將菌株K1-2接種于不同含量葡萄糖的YPD固體培養(yǎng)基上，進行耐高滲試驗，結果如表3所示。

表3 菌株K1-2在不同葡萄糖濃度下的生長情況Table 3 Grow th status of strain K1-2 at different glucose concentrations

由表3可知，菌株K1-2在葡萄糖含量為10%～40%的YPD固體培養(yǎng)基上長勢均良好；當葡萄糖含量＞40%時，菌株K1-2的長勢開始下降，當葡萄糖含量為60%時，菌株K1-2長勢極差，菌落極小，但仍舊存活，由此可知，菌株K1-2具有較高的抗?jié)B透壓能力。

2.2.5 菌株K1-2的生長曲線

以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制酵母菌K1-2的生長曲線，結果見圖4。

圖4 菌株K1-2的生長曲線Fig.4 Grow th curve of strain K1-2

由圖4可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株K1-2菌液OD600nm值在培養(yǎng)2～22 h，菌株K1-2菌液的OD600nm值隨著培養(yǎng)時間而逐漸增大；當培養(yǎng)至22 h時，OD600nm值趨于平穩(wěn)，菌株K1-2開始處于穩(wěn)定期，28 h后菌液OD600nm值開始下降，菌株進入衰亡期。

2.3 耐酒精酵母菌株的發(fā)酵特性研究

將菌株K1-2按照5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃靜置發(fā)酵5 d后，測其殘?zhí)橇?、二氧化碳失質(zhì)量、總酸含量、還原糖含量、酒精含量、揮發(fā)酸含量及pH等，結果如表4所示。

表4 菌株K1-2發(fā)酵特性試驗結果Table 4 Results o f fermentation performances tests of strain K1-2

由表4可知，當發(fā)酵至5 d時，發(fā)酵液CO2失質(zhì)量為4.705 g，殘?zhí)橇繛?.35°Bx，還原糖含量為0.023 g/m L，發(fā)酵液pH由pH 6降為pH 4.43，酸性增強，其中總酸含量與揮發(fā)酸含量分別為4.368 g/L與0.296g/L。發(fā)酵5 d共產(chǎn)生6.4%vol的酒精，糖醇轉(zhuǎn)化率可達68.45%，較普通生產(chǎn)用酵母菌株的耐酒精性能10%vol及糖的利用率60%[20]均有顯著的提高，表明菌株K1-2對糖有著較高的利用率且具有良好的發(fā)酵性能。

3 結論

本研究通過四級篩選從內(nèi)蒙古各旗縣果園的果實和土壤中篩選出一株可耐受酒精度16%vol的酵母菌株K1-2，并對其生物學及發(fā)酵特性進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)，菌株K1-2具有較高的耐滲與耐SO2的能力，其最適生長pH值為5.5，最適培養(yǎng)溫度為28℃，靜置發(fā)酵5 d后可產(chǎn)酒精6.4%vol，在釀造行業(yè)有著巨大的潛在應用價值。

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Screening of wild yeaststrainw ith high alcohol tolerantand itsperformance study

YANG Xiaochong,CHEN Zhongjun*,ZHAO Jie,CAIJiamin,WANG Yixuan,HU Jiaxing
(College ofFood Science and Engineering,InnerMongolia AgriculturalUniversity,Hohhot010018,China)

Using the200 yeast strains isolated from the fruitand soilof each county orchard in InnerMongolia asoriginal strains,a strain K1-2which could tolerant16%volalcohol contentwas finally obtained by a four-stage screening,and the fermentation performance and biological performance of the strainwere studied.The resultsshowed that theoptimalgrow th pH valueand temperature of strain K1-2 were 5.5 and 28℃,respectively.The strain K1-2 could w ithstand up to 600mg/L SO2and grow in the condition of60%glucose concentration.After fermentation for5 d,the sugaralcohol conversion rate was 68.45%,alcohol contentwas 6.4%vol,which indicated strain K1-2 wasw ith good alcohol tolerance and fermentation performance,in addition to possessing high tolerance to SO2and sugar,ithad strong ability to producealcoholand had greatapplication value.

alcohol tolerant;yeast;performance;screening

TS261.1

0254-5071（2017）08-0067-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.015

2017-04-18

楊小沖（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物學。

*通訊作者：陳忠軍（1971-），女，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程與食品微生物學。