周 鵬

(濟(jì)源市人民醫(yī)院肝膽外科，河南 濟(jì)源 454650)

肝硬化患者血清miR- 122的表達(dá)及與Child- Pugh分級(jí)的關(guān)系

周 鵬

(濟(jì)源市人民醫(yī)院肝膽外科，河南 濟(jì)源 454650)

目的 探討肝硬化患者血清MicroRNA(miR)- 122的表達(dá)水平與肝硬化Child- Pugh分級(jí)及并發(fā)癥的關(guān)系。方法 肝硬化患者87例，采用PCR實(shí)時(shí)熒光定量法測(cè)定患者血清miR- 122水平，根據(jù)Child- Pugh分級(jí)對(duì)肝硬化患者進(jìn)行分級(jí)，分析血清miR- 122與肝硬化分級(jí)的關(guān)系。結(jié)果 并發(fā)肝硬化腹水、消化道出血、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎及失代償期患者血清miR- 122表達(dá)水平均高于未發(fā)生患者(P<0.05)；不同肝硬化 Child- Pugh分級(jí)血清中 miR- 122水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，A級(jí)與B 級(jí)肝硬化患者血清miR- 122水平無顯著差異(P>0.05)，A級(jí)和B級(jí)患者水平均顯著低于C級(jí)(P<0.05)。多變量線性相關(guān)性顯示，血清miR- 122與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ- 谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)呈正相關(guān)(P<0.05)；與國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)及肌酐(Cr)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 血清miR- 122 水平上升提示肝硬化已經(jīng)失代償，并與腹水、消化道出血、肝腎衰竭有關(guān)。因此，血清 miR- 122可作為評(píng)價(jià)肝硬化患者肝臟功能及預(yù)后的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

肝硬化；miR- 122；Child- Pugh分級(jí)

我國慢性肝炎病毒感染是導(dǎo)致原發(fā)性肝癌或肝硬化的主要病因。MicroRNA(miR)是內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，能夠選擇性與mRNA結(jié)合，抑制mRNA翻譯，并促進(jìn)其降解，抑制靶基因表達(dá)〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，miR在機(jī)體細(xì)胞分化、增殖、凋亡及組織器官發(fā)育等過程均具有重要的調(diào)控作用，其在多種疾病發(fā)生過程中均具有一定的作用。由于miRNA結(jié)構(gòu)較小且相對(duì)穩(wěn)定，因此被廣泛應(yīng)用于疾病分型、診斷、預(yù)后及個(gè)性化診療〔3〕。目前，miR與肝炎病毒感染后疾病進(jìn)展的關(guān)系尚未完全明確，動(dòng)物模型顯示〔4〕，感染肝炎病毒后動(dòng)物體內(nèi)血清miR的水平會(huì)明顯升高。有研究提出miRNA與肝炎病毒復(fù)制、肝硬化、慢性肝病及肝癌的發(fā)生、發(fā)展均具有密切關(guān)系〔5〕。本研究旨在探究肝硬化患者血清miR- 122的表達(dá)水平與肝硬化分級(jí)及并發(fā)癥的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年6月至2016年3月濟(jì)源市人民醫(yī)院收治的87例肝硬化患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合患者病史、臨床標(biāo)準(zhǔn)、肝活檢及影像學(xué)進(jìn)行綜合診斷確診〔6〕；②行病理學(xué)檢查；③研究前1個(gè)月均未服用保肝類藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等嚴(yán)重疾病者；②不配合及中途退出者。其中男66例，女21例；年齡41～74〔平均(56.32±6.93)〕歲。采用Child- Pugh對(duì)肝硬化患者進(jìn)行分級(jí)〔7〕，Child- Pugh得分5～6分為A級(jí)，7～9分為B級(jí)，≥10分為C級(jí)；其中A級(jí)33例，B級(jí)31例，C級(jí)23例。

1.2 儀器和試劑 熒光定量ViiATM7、PCR儀與TC- 48/T/H PCR擴(kuò)增儀均購于Applied Biosustems公司；美國Invitrogen公司提供患者總RNA提取的試劑盒。Taq Man Universal PC Rmastermix，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Taq Manmi RNA，特異探針miR- 122均購于美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 肝腎功能指標(biāo)檢測(cè) 患者于首次入院后第1天在清晨空腹采集靜脈血3 ml，2 h 內(nèi)分離血清，由本院檢驗(yàn)中心DXC- 800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ- 谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)及肌酐(Cr)水平、血清總蛋白(TP)及膽紅素。

1.3.2 血清miRNA提取 87例患者首次入院后第2天采集3 ml清晨空腹靜脈血，于20℃～25℃放置30 min左右，以4 000 r/min離心10 min，吸取上清于EP管保存分裝，最后將分裝后的EP管保存至-20℃的冰箱以備提取。按照MiRcute試劑提取試劑盒說明書提取血清miRNA。測(cè)定提取的RNA OD260/280的比值，比值介于1.8～2.0即可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) (1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配制：0.1 μl dNTPmix(100 mmol/L)，3 μl 5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，1.0 μl 50 U/μl MultiScribeTM反轉(zhuǎn)錄酶，1.8 μl MgCl2及4.1 μl無核酸酶的水。(2)將反應(yīng)體系混合溶液短暫離心，分裝9 μl/管，再依次加入5 μl RNA模板，3 μl primer，混勻、離心。miR- 122 PCR 正向引物序列為：5′- TGCGGATCAACAGACATTAATT- 3′。(3)設(shè)置反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。于預(yù)先設(shè)定好條件的PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。(4)反應(yīng)完成后將cDNA溶液置于-20℃低溫冰箱中保存，以備用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.3.4 PCR反應(yīng) 采用TaqmanHT7900熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃ 10 min；94℃ 10 s，60℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為10 μl反應(yīng)體系(Master Mix 5 μl，正反向引物各 0.2 μl，cDNA 1 μl，水3.60 μl)，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)及多變量線性相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同肝硬化并發(fā)癥中血清miR- 122的表達(dá)水平 并發(fā)肝硬化腹水、消化道出血、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎及失代償期患者血清miR- 122表達(dá)水平(38.1±3.3，37.2±4.5，38.5±4.3，36.2±3.1)均高于未發(fā)生患者(25.3±4.3，26.2±3.7，27.4±3.5，25.1±4.3；t=10.041，8.972，9.191，8.183；P=0.001，0.002，0.002，0.003)。

2.2 不同肝硬化分級(jí)患者血清miR- 122及肝功能指標(biāo)比較 不同肝硬化Child- Pugh分級(jí)血清中miR- 122水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)A級(jí)與B 級(jí)肝硬化患者表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.217；P=0.199)，A級(jí)和B級(jí)顯著低于C級(jí)(t=4.597，P=0.001；t=4.125，P=0.002)；不同肝硬化分級(jí)患者ALT、AST、GGT、ALP、INR及Cr水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而血清TP及膽紅素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 不同肝硬化分級(jí)患者血清miR- 122及肝功能指標(biāo)比較

與C級(jí)比較：1)P<0.05

2.3 血清miR- 122水平與肝腎功能指標(biāo)的關(guān)系 血清miR- 122表達(dá)水平與ALT、AST、GGT、ALP 呈正相關(guān)(r=0.514、0.672、0.578、0.711、P<0.05)，與INR及Cr水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.612、-0.417，P<0.05)，而與TP及膽紅素關(guān)系不明顯。

3 討 論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)miR- 122主要表達(dá)于肝臟細(xì)胞，參與肝臟細(xì)胞的分化生長(zhǎng)，對(duì)于肝臟發(fā)揮正常的生理功能具有重要作用，因此可以作為肝細(xì)胞損傷的一個(gè)重要潛在生物學(xué)指標(biāo)〔8〕。Child- Pugh分級(jí)是評(píng)價(jià)肝臟分解合成功能的重要評(píng)分指標(biāo)，其通過凝血酶原時(shí)間、膽紅素、白蛋白以及肝性腦病和腹水等評(píng)價(jià)指標(biāo)全面綜合反映肝臟的整個(gè)病變程度，可以作為肝臟預(yù)后的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

本研究結(jié)果提示患者血清miR- 122表達(dá)上升可能與并發(fā)肝硬化腹水、消化道出血、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎有關(guān)，或正處于失代償期，其原因可能與患者發(fā)生腹水導(dǎo)致血清 miR- 122進(jìn)入其他淋巴通道等第三間隙增多引起〔9〕。因此，對(duì)于肝硬化合并并發(fā)癥患者的評(píng)價(jià)來講，高表達(dá)的血清miR- 122表明預(yù)后恢復(fù)情況可能會(huì)越差。本研究結(jié)果提示血清中 miR- 122 的水平可作為肝硬化患者的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)，另外Child- Pugh分級(jí)對(duì)于肝臟功能評(píng)價(jià)具有重要意義。在肝硬化患者中，血清中 miR- 122水平與各種轉(zhuǎn)氨酶的水平均呈正相關(guān)，這表明肝臟細(xì)胞的損傷及壞死伴隨著血清中 miR- 122的水平增高，這可能由于壞死的肝細(xì)胞釋放部分miR- 122，同時(shí)由于細(xì)胞壞死導(dǎo)致肝細(xì)胞不能正常降解miR- 122〔10〕。肝硬化患者中血清 miR- 122 水平和INR呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系也說明了這一點(diǎn)。上述證據(jù)均顯示血清miR- 122水平可反映肝功能的損傷程度。本研究中低水平的血清miR- 122提示存在更高水平的Cr，表明腎功能的損害以及肝細(xì)胞增生能力的降低，這可能由于肝衰竭同時(shí)合并腎衰竭導(dǎo)致整個(gè)循環(huán)紊亂〔11〕。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)腎衰竭時(shí)部分miR的表達(dá)降低。此外，在本研究中血清miR- 122與其他代表腎功能損害的膽紅素以及血紅蛋白等并不相關(guān)，這可能由于肝硬化病人的腸道營養(yǎng)、藥物運(yùn)用導(dǎo)致這些指標(biāo)水平的相應(yīng)變化導(dǎo)致。血清miR- 122 水平上升提示肝硬化已經(jīng)失代償，并與腹水、消化道出血、肝腎衰竭有關(guān)。因此，血清 miR- 122可作為評(píng)價(jià)肝硬化患者肝臟功能及預(yù)后的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

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〔2017- 02- 18修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

周 鵬(1982- )，男，主治醫(yī)師，主要從事肝膽外科研究。

R657.3+1

A

1005- 9202(2017)15- 3802- 02；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.071