高煒城 王 森 白 亮 鄭祥光 羅 力 李 峻

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510080)

自噬在腎臟結(jié)石大鼠發(fā)病中的作用機(jī)制

高煒城 王 森 白 亮 鄭祥光 羅 力 李 峻

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510080)

目的 探討自噬在腎臟結(jié)石發(fā)病中的作用機(jī)制。方法 建立腺嘌呤攝入過(guò)量引發(fā)的腎結(jié)石小鼠模型，通過(guò)對(duì)小鼠血液、尿液、腎臟組織樣本收集，運(yùn)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)小鼠血液中肌苷酸含量、小鼠體重、腎比重、一晝夜尿液量、小鼠尿液中微量蛋白含量及腎臟組織自噬基因mRNA和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，并運(yùn)用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行數(shù)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果 腺嘌呤模型小鼠體重下降，腎比重和一晝夜排尿量比對(duì)照組較高，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)結(jié)果顯示腺嘌呤模型小鼠血液中肌苷酸的含量，尿液中微量蛋白的含量與對(duì)照組相比升高，同時(shí)PCR及蛋白免疫印跡結(jié)果證明自噬相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)量的變化，自噬抑制劑處理小鼠后，腎結(jié)石癥狀稍有緩解，自噬相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)量的也發(fā)生調(diào)整。結(jié)論 證明2，8二羥基腺嘌呤結(jié)石的積累可以引起腎組織自噬發(fā)生，導(dǎo)致腎結(jié)石相關(guān)癥狀。

腺嘌呤；腎結(jié)石；自噬

腎結(jié)石是尿路最常見疾病之一，臨床表現(xiàn)癥狀為腰痛和血尿，嚴(yán)重影響腎結(jié)石患者的生活質(zhì)量〔1〕。腎結(jié)石與慢性腎病密切相關(guān)，已成為慢性腎病進(jìn)展為終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)因子〔2〕。研究表明在已報(bào)道的慢性腎病中(如腎炎，腎臟纖維化，腎癌等)有自噬發(fā)生〔3〕，自噬相關(guān)基因mRNA、蛋白表達(dá)量也發(fā)生變化。近期研究報(bào)道，小鼠中腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的缺失和口服腺嘌呤的攝入過(guò)多〔4〕，導(dǎo)致8- 二羥腺嘌呤不溶性結(jié)晶在腎小管中大量積累，進(jìn)一步導(dǎo)致腎組織纖維化和腎功能紊亂。然而，8- 二羥腺嘌呤誘導(dǎo)腎臟纖維化和腎臟結(jié)石中精確的調(diào)控機(jī)制并不完全明確。目前的研究顯示，腺嘌呤小鼠可能是由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞參與纖維化的過(guò)程引起的〔5〕。腺嘌呤喂食7 d后，尿結(jié)石在小管沉積產(chǎn)生。隨著時(shí)間推移，腺嘌呤喂養(yǎng)的小鼠血清中肌酐水平升高和體重降低，暗示腺嘌呤喂養(yǎng)引發(fā)典型的腎臟功能障礙。同時(shí)在腎組織中發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)水平升高。本文主要以腺嘌呤誘導(dǎo)腎結(jié)石模型，研究自噬抑制劑對(duì)腎結(jié)石的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 細(xì)胞內(nèi)RNA抽提試劑TRIzol、M- MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(R&D Systems公司)，PVDF膜(Millipore公司)，麗春紅、三氯乙酸和磺基水楊酸、腺嘌呤、3- 甲基腺嘌呤(3- MA，Sigma公司)，蛋白印跡化學(xué)發(fā)光試劑(Thermo Scientific公司)，X- Omat光片購(gòu)自(Kodak公司)，4℃或-20℃冰箱(海爾)，微量移液器(Eppendorf公司)，垂直電泳槽、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀和配套電源(Bio- Rad或Amersham Biosciences公司)，冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)，高速離心機(jī)(Beckman公司)，PCR儀(東勝創(chuàng)新公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems公司)，精密天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 雄性野生型C57BL/6小鼠購(gòu)自上海拜力生物科技公司。腺嘌呤過(guò)量攝入構(gòu)建腎結(jié)石小鼠模型：6周齡小鼠分成4組，一組按實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)正常進(jìn)食，另一組食物添加0.25%的腺嘌呤，第3組小鼠每周腹腔注射一次50 μl 3- MA，第4組食物中添加0.25%的腺嘌呤的同時(shí)每周腹腔注射一次50 μl 3- MA〔6〕。在7、14、2、28 d時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行安樂死處理、然后收集小鼠血液和腎臟。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前24 h，把小鼠放進(jìn)代謝籠，禁食不禁水，收集實(shí)驗(yàn)前24 h小鼠尿液。動(dòng)物房保持溫度22℃±3℃，濕度(35±5)%，12 h晝夜周期(早上6：30亮燈)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作方法和程序都得到我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 蛋白提取 50 mg左右的組織或貼壁細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍并吸盡殘余的PBS，加適量體積的混有蛋白酶抑制劑和磷脂酶抑制劑的變性RIPA裂解液〔150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris pH7.2，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，1% Triton X- 100，1% Deoxycholate，5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)〕，冰上充分裂解后轉(zhuǎn)移至EP 管。4℃，12 000 r/min離心20 min，取上清，用Pierce公司的BCA Kit測(cè)蛋白濃度。測(cè)完濃度后，加4×SDS loading buffer(200 mmol/L Tris- HCl，pH6.8，8% SDS，0.4%溴酚藍(lán)，40%甘油，400 mM DTT)，100℃煮10 min，立即上樣進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)或-20℃貯存。

1.4 免疫印跡 根據(jù)蛋白分子量的不同，選用適合濃度的不連續(xù)變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS- PAGE)進(jìn)行垂直電泳，一般為10%。開始以80 V的電壓進(jìn)行電泳，待染料前沿進(jìn)入分離膠后將電壓提高到120 V繼續(xù)電泳，直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部；然后按照陽(yáng)極- 海綿- 濾紙- 聚偏氟乙烯(PVDF)膜- 膠- 濾紙- 海綿- 陰極的順序安置好，放入轉(zhuǎn)膜容器中，4℃，380 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)分子量不同而不同，一般為1.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，標(biāo)好方向和marker，按需裁剪。用10%脫脂牛奶室溫封閉1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3次，每次5 min。進(jìn)行一抗反應(yīng)，抗體配置在1×TBST+5% BSA中，室溫1～2 h或4℃過(guò)夜，回收抗體，4℃保存。PVDF膜接下來(lái)繼續(xù)用TBST洗3次，每次5 min，進(jìn)行二抗反應(yīng)，室溫1 h后TBST洗膜3次，每次5 min。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，暗房壓片。

1.5 RNA提取及實(shí)時(shí)定量熒光PCR 細(xì)胞或組織樣品RNA利用Invitrogen公司的TRIzol試劑來(lái)提?。杭?xì)胞或組織加0.5 ml TRIzol破碎后室溫孵育5 min，再加入0.2 ml氯仿，用力搖晃15 s后室溫孵育5 min。4℃，12 000 r/min離心15 min，將上層的水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5 ml離心管中，加入等體積異丙醇進(jìn)行沉淀，室溫孵育15 min。然后，4℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清，底部的RNA沉淀用75%乙醇洗滌，4℃，7 500 r/min離心5 min后棄上清。室溫?fù)]發(fā)完殘余乙醇后，將RNA沉淀溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過(guò)的雙氧水(ddH2O)。用Takara公司的RNase- free DNase I處理除去可能的DNA污染后，對(duì)RNA進(jìn)行定量。取1 g RNA反轉(zhuǎn)，得到cDNA。按照Takara公司逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)提供的說(shuō)明書，選用random primers和oligo T primer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)條件為：37℃15 min，85℃15 s，4℃冷卻。整個(gè)操作過(guò)程中嚴(yán)格避免RNA酶的污染。應(yīng)用美國(guó)Applied Biosystems公司的SYBR Green I Master Mix試劑和ABI 7500或7900系統(tǒng)，對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增定量檢測(cè)。

1.6 血液中肌苷酸水平測(cè)量 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。

1.7 尿液微量蛋白水平檢測(cè) 小鼠尿液樣本離心，然后按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、one- way ANOVA及Student- Newman- Keuls檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 自噬抑制劑對(duì)腎結(jié)石小鼠血液中肌苷酸水平影響 隨著時(shí)間的推移，腺嘌呤過(guò)量攝入的腎結(jié)石模型小鼠血液中肌苷酸水平明顯高于對(duì)照組，但腺嘌呤攝入同時(shí)自噬抑制劑3- MA處理的小鼠，血液肌苷酸水平下降，顯著低于腺嘌呤攝入腎結(jié)石模型組，說(shuō)明自噬抑制劑對(duì)腎結(jié)引起的高水平血液肌苷酸有降低作用。見圖1。

1)P<0.05，2)P<0.01；下圖同圖1 自噬抑制劑對(duì)腎結(jié)石小鼠血液中肌苷酸水平影響

2.2 自噬抑制對(duì)腎結(jié)石小鼠體重和腎比重影響 隨著時(shí)間推移，腺嘌呤過(guò)量攝入的腎結(jié)石模型小鼠的體重與對(duì)照組小鼠體重相比明顯下降，但腺嘌呤攝入同時(shí)自噬抑制劑3- MA處理的小鼠體重基本恢復(fù)。隨著時(shí)間推移，腺嘌呤過(guò)量攝入的腎結(jié)石模型小鼠的腎比重明顯高于對(duì)照組小鼠腎比重，同時(shí)自噬抑制劑3- MA處理的小鼠腎比重下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，腺嘌呤過(guò)量攝入腎臟確實(shí)發(fā)生變化，并且自噬抑制劑參與其中。見圖2。

2.3 自噬抑制劑對(duì)腎結(jié)石小鼠尿液量和尿液中微量蛋白含量影響 14、28 d腺嘌呤過(guò)量攝入的腎結(jié)石模型小鼠一晝夜的排尿量及尿液中微量蛋白含量與對(duì)照組相比明顯升高，并且自噬抑制劑3- MA處理腎結(jié)石模型小鼠能使小鼠排尿量及尿液微蛋白含量趨于正常。上述結(jié)果表明，腺嘌呤過(guò)量攝入的腎結(jié)石模型建立成功，跟對(duì)照組相比表現(xiàn)出血液肌苷酸含量升高，體重下降，腎比重升高，排尿量尿液及尿液中微蛋白含量升高的腎結(jié)石表征。且自噬抑制劑3- MA對(duì)腺嘌呤過(guò)量攝入的腎結(jié)石模型有調(diào)節(jié)作用。見圖3。

2.4 自噬抑制劑對(duì)腎結(jié)石小鼠腎組織中自噬相關(guān)基因mRNA量的影響 14、28 d，腺嘌呤過(guò)量攝入的腎結(jié)石模型小鼠腎臟組織中，自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)量顯著變化，LC3b mRNA表達(dá)水平升高、mTOR mRNA表達(dá)水平下降。說(shuō)明腺嘌呤過(guò)量攝入的腎結(jié)石小鼠模型存在自噬的發(fā)生，且自噬抑制劑能控制腺嘌呤過(guò)量攝入的腎結(jié)石模型小鼠腎臟組織中自噬的表達(dá)。見圖4。

圖2 自噬抑制對(duì)腎結(jié)石小鼠體重和腎比重影響

圖3 自噬抑制劑對(duì)腎結(jié)石小鼠尿液量和尿液中微量蛋白含量影響

圖4 自噬抑制劑對(duì)腎結(jié)石小鼠腎組織中自噬相關(guān)基因mRNA量的影響

2.5 自噬抑制劑對(duì)腎結(jié)石小鼠腎組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響 為了驗(yàn)證圖4得出的結(jié)論，利用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)28 d腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組相比，腺嘌呤過(guò)量攝入的腎結(jié)石模型小鼠腎臟組織中LC3b 蛋白表達(dá)水平升高，mTOR mRNA表達(dá)水平下降。自噬抑制劑同樣能緩解腎臟組織中自噬情況，緩解腎結(jié)石的癥狀。見圖5。

圖5 自噬抑制劑對(duì)腎結(jié)石小鼠腎組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

3 討 論

大多數(shù)腎臟疾病能發(fā)展到晚期腎小球硬化癥或腎小管間質(zhì)化硬化癥，通常伴隨著進(jìn)行性腎臟功能紊亂〔7〕。類似的腎損傷通常與自噬相關(guān)，與白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組織和與相關(guān)趨化因子的表達(dá)增加及其受體有關(guān)。例如，巨噬細(xì)胞觀察不僅在腎小球間質(zhì)也區(qū)域在人類狼瘡腎炎等腎臟疾病，IgA腎病和糖尿病腎病，表明巨噬細(xì)胞也扮演重要的角色〔8〕。自噬作為細(xì)胞內(nèi)清理?yè)p傷細(xì)胞器的機(jī)制，與腎損傷、腎癌、腎炎、腎纖維化密切相關(guān)。

在哺乳動(dòng)物中，腺嘌呤作為內(nèi)源被聚胺通路的副產(chǎn)路，腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT EC 2.4.2.7)〔9〕。當(dāng)缺乏時(shí)，腺嘌呤成為黃嘌呤脫氫酶的主要底物(EC 1.2.3.2 XDH)，它把腺嘌呤氧化成2，8二羥基腺嘌呤(DHA)〔10〕。因?yàn)镈HA的溶解度很低，所以沉積在腎小管中，形成腎結(jié)石〔4〕。APRT缺乏的小鼠〔11〕，表現(xiàn)出腎結(jié)石癥狀，腎小管廣泛擴(kuò)張、炎癥，壞死、自噬和纖維化，同時(shí)伴有腎臟功能障礙，這在單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)模型中是看不到的〔12〕。長(zhǎng)期喂食腺嘌呤誘發(fā)DHA沉積在小鼠鼠腎小管中，導(dǎo)致腎功能紊亂〔13〕。本文發(fā)現(xiàn)腺嘌呤模型小鼠血液中肌苷酸的量升高，體重下降，腎比重，一晝夜排尿量，尿中微量蛋白含量與對(duì)照組相比有都有所升高，同時(shí)檢測(cè)到自噬相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)量的變化。自噬抑制劑處理小鼠后，腎結(jié)石癥狀稍有緩解，自噬相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)量的也發(fā)生調(diào)整。證明2，8二羥基腺嘌呤結(jié)石的積累，可以引起腎組織自噬發(fā)生，導(dǎo)致腎結(jié)石相關(guān)癥狀。同時(shí)，自噬抑制劑同樣能緩解腎臟組織中自噬情況，緩解腎結(jié)石的癥狀，但具體影響機(jī)制有待探究。

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〔2017- 03- 11修回〕

(編輯 袁左鳴)

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.B2012085)

王 森(1970- )，男，副主任醫(yī)師，主要從事泌尿系結(jié)石研究。

高煒城(1981- )，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事泌尿系結(jié)石研究。

R692.4

A

1005- 9202(2017)15- 3699- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.025