陶英歌 付高潔 國(guó)向東 劉 磊

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157000)

前列腺素E2激活YAP正反饋回路促進(jìn)小鼠結(jié)腸炎后結(jié)腸再生及癌變的分子機(jī)制

陶英歌 付高潔 國(guó)向東 劉 磊

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157000)

目的 研究前列腺素(PGE2)激活Yes信號(hào)通路相關(guān)蛋白(YAP)正反饋回路促進(jìn)小鼠結(jié)腸炎后結(jié)腸再生及癌變的分子機(jī)制。方法 將DLD1結(jié)腸癌細(xì)胞株或基因穩(wěn)定敲除細(xì)胞株，在有/無信號(hào)通路特異性抑制劑的條件下，采用重組PGE2或PBS孵育，采用免疫印跡法、免疫熒光法、定量PCR、轉(zhuǎn)錄和增殖法進(jìn)行比較分析。采用DSS法誘導(dǎo)C57/BL6小鼠結(jié)腸炎模型(對(duì)照鼠)，同時(shí)構(gòu)建羥基前列腺素脫氫酶基因敲除鼠(15- PGFH- KO)、YAP基因敲除鼠(YAP- KO)、和雙基因敲除(DKO)小鼠，采用吲哚美辛抑制PGE2合成信號(hào)通路，檢測(cè)下游基因表達(dá)及結(jié)腸再生和癌變功能。結(jié)果 PGE2處理結(jié)腸癌細(xì)胞株導(dǎo)致YAP mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平升高，15- PGDH- KO組鼠結(jié)腸組織中PGE2的表達(dá)水平較對(duì)照敲除細(xì)胞(WT)組增長(zhǎng)了2.5倍，吲哚美辛處理后15- PGDH- KO組鼠YAP的表達(dá)水平及下游靶基因水平均較WT鼠顯著升高。吲哚美辛處理顯著降低PG過氧化物合成酶(COX)- 2及PGE受體4基因(EP4)的轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)染YAP持續(xù)激活突變體(5SA)可顯著增加 COX- 2和EP4的蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平，敲除YAP后上述現(xiàn)象消失。對(duì)照鼠口服葡聚糖硫酸鈉(DSS)導(dǎo)致結(jié)腸炎，注射PGE2促進(jìn)小鼠發(fā)生結(jié)腸再生；YAP敲除鼠并未發(fā)生結(jié)腸再生，同時(shí)口服DSS后迅速死亡；15- PGFH敲除鼠結(jié)腸組織再生比對(duì)照鼠更快，且體重恢復(fù)更快、結(jié)腸長(zhǎng)度和結(jié)腸炎組織學(xué)得分更高。上述現(xiàn)象可以被注射吲哚美辛逆轉(zhuǎn)。YAP敲除鼠或15- PGFH敲除鼠誘導(dǎo)結(jié)腸炎后未發(fā)現(xiàn)自發(fā)性腫瘤，YAP/15- PGDH雙基因敲除鼠出現(xiàn)息肉并最終發(fā)展成原位癌。口服吲哚美辛可有效防止雙敲除鼠自發(fā)性腫瘤的形成。結(jié)論 PGE2可增加YAP的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn) COX- 2及EP4的表達(dá)水平增加，這一信號(hào)回路可促進(jìn)擴(kuò)散的結(jié)腸癌細(xì)胞系增殖和結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織再生，持續(xù)性激活進(jìn)一步可導(dǎo)致息肉和小鼠結(jié)腸腫瘤的形成。

前列腺素E2；信號(hào)通路；結(jié)腸炎；結(jié)腸再生；腫瘤形成

結(jié)腸癌(CRC)全球發(fā)病率極高，尤其老年CRC患者往往難以耐受化療不良反應(yīng)〔1〕。目前研究表明，前列腺素(PG)E2和Yes信號(hào)通路相關(guān)蛋白(YAP)信號(hào)通路與CRC形成高度相關(guān)，而PGE2通過環(huán)氧合酶(COX)- 2合成，成為機(jī)體組織再生的重要炎性介質(zhì)〔2〕，但其持續(xù)的激活已與癌變有關(guān)〔3〕，但這一信號(hào)通路如何促進(jìn)腫瘤新生及其下游效應(yīng)物尚未研究清楚，對(duì)這一信號(hào)通路的深入研究有助于結(jié)腸癌的預(yù)防和治療，延長(zhǎng)老年患者的生存期，提高其生活質(zhì)量。研究表明，YAP可參與組織再生的調(diào)節(jié)，與PGE2表型高度類似，因此兩者之間是否存在相互作用也亟待研究〔4〕。本研究通過分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究，闡明PGE2和YAP的相互作用對(duì)小鼠結(jié)腸炎后結(jié)腸再生及癌變的分子機(jī)制的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 DLD1結(jié)腸癌細(xì)胞株采用含10%FBS的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)加入藥物處理。PGE2，CAY10598，葡聚糖硫酸鈉(DSS)，GW627368X和AZD6244(Selumetinib)購(gòu)自Pierce，F(xiàn)R- 180204購(gòu)自Selleck，LY294002，IKK16和維替泊芬(Verteporfin)購(gòu)自Sigma Aldrich。6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)自黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證SYXK(黑)2016- 0014。

1.2 基因敲除細(xì)胞株(小鼠)的構(gòu)建 將15- PGDH、YAP(5SA)、YAP(5SA- S94A基因克隆進(jìn)pMSCV- puro載體中，同時(shí)將YAP shRNA cDNA構(gòu)建到pSuperRetro- puro載體中，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收取病毒上清，用于感染DLD- 1結(jié)腸癌細(xì)胞，并采用嘌呤霉素(5 μg/ml)篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，同時(shí)采用隨機(jī)序列對(duì)照敲除質(zhì)粒Vector shRNA構(gòu)建對(duì)照敲除細(xì)胞株(WT細(xì)胞)。

羥基前列腺素脫氫酶基因敲除鼠(15- PGFH敲除鼠)、YAP基因敲除鼠(YAP敲除鼠)、雙基因敲除鼠(DKO)及對(duì)照敲除鼠(WT鼠)的構(gòu)建由吉瑪公司制備并驗(yàn)證。正常培養(yǎng)上述小鼠1年，并觀察是否存在息肉、自發(fā)腫瘤的發(fā)生。

1.3 免疫熒光法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD- 1細(xì)胞，接種于24孔板中，分為兩組，實(shí)驗(yàn)組采用PGE2處理，對(duì)照組采用磷酸鹽緩沖液(PBS)處理，各組細(xì)胞處理8 h后，采用4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，PBS清洗3次；然后用0.5% TritonX- 100破膜10 min，加入山羊血清室溫封閉1 h；加入1∶500稀釋鼠抗人YAP多克隆抗體，4℃孵育過夜；再加入1∶100稀釋的山羊抗鼠熒光二抗4℃避光孵育30 min；經(jīng)DAPI染色洗滌后，用萊卡臺(tái)式激光共聚焦熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.4 CCK- 8檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD- 1細(xì)胞，接種于96孔板中，分為兩組，實(shí)驗(yàn)組采用PGE2處理，對(duì)照組采用PBS處理，各組細(xì)胞處理8 h后，每孔加入100 μl CCK- 8，37℃繼續(xù)孵育2 h，用Bio- Red多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔的D值，比較細(xì)胞增殖情況。

1.5 DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型 取30只C57/BL6小鼠，自由飲用無菌水溶解的5% DSS，每24 h更換一次，培養(yǎng)7 d，第8天評(píng)價(jià)結(jié)腸炎造模情況，并給藥處理小鼠。造模后每天觀察小鼠毛色變化、活動(dòng)情況、大便性狀及出血等情況。

1.6 DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎組織學(xué)評(píng)價(jià) 取小鼠結(jié)腸并沿腸系膜縱軸緣剪開腸腔，生理鹽水沖洗后取炎癥最明顯處長(zhǎng)約1 cm的組織，10%中性甲醛固定后石蠟包埋切片。結(jié)腸炎的組織學(xué)評(píng)價(jià)采用蘇木精- 伊紅的組織切片染色，測(cè)定潰瘍和糜爛的數(shù)量和面積。黏膜隱窩損傷的程度(隱窩炎評(píng)分從0～4分：0級(jí)，無損傷；1級(jí)，1/3的基底層損傷；2級(jí)，基底層2/3的損傷；隱窩受損且暴露上皮層表面；4級(jí)，整個(gè)隱窩受損且表面上皮層全部暴露。對(duì)樣本同時(shí)測(cè)量相同區(qū)域，并根據(jù)其損傷程度從0～4級(jí)評(píng)分，最終得分通過損傷分級(jí)乘以整個(gè)結(jié)腸隱窩損傷面積得到。

1.7 qPCR分析轉(zhuǎn)錄情況 使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)從培養(yǎng)的細(xì)胞和結(jié)腸組織中分離總RNA，取1～2 μg用Gene Amp RNA PCR Core Kit(Applied Biosystems)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用2倍SYBR Green Pre- mix(Elpisbio)在7500 Fast Real- Time PCR machine(Applied Biosystems)定量PCR儀上進(jìn)行qPCR分析。靶基因的Ct值通過β- actin或GAPDH進(jìn)行均一化。qPCR引物序列如下：β- actin：5′- TCCTGTGGCATCCACGAAACT- 3′，5′- GAAGCATTTGCGGTGGACGAT- 3′；GAPDH:5′- ATCCTGCACCACCAACTGCT- 3，5′- GGGCCATCCACAGTCTTCTG- 3;YAP:5′- TGGGAGATGGCAAAGACATCTTCTG- 3′,5′- ACACTGGATTTTGAGTCCCACCATC- 3′;COX- 2:5′- GAATCATTCACCAGGCAAATTG- 3′,5′- TCTGTACTGCGGGTGGAACA- 3′;EP4:5′- GACCTGTTGGGCACTTTGTT- 3,5′- AGGTAGCGCTCGACACTCAT- 3′;CTGF:5′- AAAAGTGCATCCGTACTCCCA- 3′,5′- CCGTCGGTACATACTCCACAG- 3′。

1.8 免疫印跡檢測(cè) SDS- PAGE膠的配制和電泳檢測(cè)細(xì)胞(組織)中提取蛋白及電泳、PAGE膠轉(zhuǎn)印、封閉、一抗孵育、二抗孵育及曝光后，采用Image J對(duì)膠片灰度進(jìn)行定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 PGE2正向調(diào)控YAP信號(hào)通路 采用免疫印跡和免疫熒光法檢測(cè)人結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD- 1中PGE2對(duì)YAP信號(hào)通路的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)饑餓處理的細(xì)胞經(jīng)過PGE2處理后，YAP的表達(dá)水平顯著增加(圖1A，1B)。通過對(duì)YAP mRNA和YAP下游調(diào)控蛋白(CTGF，CYR61和ANKRD1)水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PGE2可顯著增強(qiáng)YAP轉(zhuǎn)錄水平和下游信號(hào)通路(圖1C)。

為了檢測(cè)PGE2是否在體內(nèi)同樣能調(diào)節(jié)YAP信號(hào)通路，檢測(cè)了吲哚美辛預(yù)處理15- PGDH- KO組和WT組鼠PGE2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，15- PGDH- KO組鼠結(jié)腸組織中PGE2的表達(dá)水平較WT組增長(zhǎng)了2.5倍，吲哚美辛處理10 d后，兩組鼠結(jié)腸組織中PGE2表達(dá)水平幾乎均無法檢測(cè)出(圖1B，1D)。15- PGDH- KO組鼠YAP的表達(dá)水平及下游靶基因水平均較WT鼠顯著升高，采用吲哚美辛處理后均顯著降低(圖1E,1F)，表明PGE2在體內(nèi)和體外均可以正向調(diào)控YAP的表達(dá)水平。

2.2 YAP通過上調(diào)EP4和 COX- 2形成正向反饋回路 通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染YAP持續(xù)激活突變體(5SA)和對(duì)照質(zhì)粒(WT)的結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD- 1，發(fā)現(xiàn)了持續(xù)性激活YAP可顯著增加 COX- 2和EP4的蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平(圖2A，2B)。采用shRNA敲除YAP導(dǎo)致 COX- 2和EP4的蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(圖2C)，同時(shí)敲除YAP也阻止PGE2處理上調(diào) COX- 2和EP4的表達(dá)(圖2D)。

圖1 PGE2正向調(diào)控YAP信號(hào)通路

2.3 YAP調(diào)控PGE2介導(dǎo)的結(jié)腸再生 PGE2是前列腺腫瘤細(xì)胞最常見的促細(xì)胞分裂素，通過shRNA敲除前列腺癌細(xì)胞系DLD- 1的YAP基因(圖3A)，檢測(cè)了PGE2處理前后細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGE2處理可促進(jìn)對(duì)照敲除組細(xì)胞的增殖，對(duì)YAP敲除細(xì)胞系則無顯著影響(圖3B)。通過構(gòu)建不同15- PGDH和YAP表達(dá)水平的小鼠，并采用DSS處理構(gòu)建結(jié)腸炎小鼠模型，發(fā)現(xiàn)15- PGDH- KO組鼠的結(jié)腸再生較對(duì)照組增多，且體重恢復(fù)更快、結(jié)腸長(zhǎng)度和結(jié)腸炎組織學(xué)得分更高。進(jìn)一步對(duì)15- PGDH- KO組鼠敲除YAP異源基因(YAP- Het)，同樣產(chǎn)生了與WT鼠相似的結(jié)腸再生情況(圖3D，3E，3F)。

2.4 PGE2異常增加促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生 為了驗(yàn)證PGE2異常的回路是否可以導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和腫瘤的發(fā)生，構(gòu)建了15- PGDH- KO鼠、YAP- KO和DKO鼠。經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)1年的飼養(yǎng)和觀察，發(fā)現(xiàn)他們均未發(fā)生自發(fā)腫瘤，而DKO鼠在培養(yǎng)12～16 w時(shí)出現(xiàn)了息肉，并在培養(yǎng)6個(gè)月后進(jìn)展成為原位癌(圖4A，4B)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，DKO鼠結(jié)腸部位原位癌和較高的PGE2的表達(dá)水平可以顯著被YAP敲除或注射吲哚美辛干擾并消除(圖4C，4D)。進(jìn)一步對(duì)原位癌部位的YAP，COX- 2和EP4進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DKO鼠中上述基因的表達(dá)水平顯著高于YAP- KO，也顯著高于吲哚美辛處理的DKO鼠(圖4E)。

1.Con；2.YAP WT；3.YAP 5SA；4.YAP 5SA/S94A；5.shScrb；6.shYAP圖2 YAP通過上調(diào)EP4和 COX- 2形成正向反饋回路

圖3 YAP調(diào)控PGE2介導(dǎo)的結(jié)腸再生

圖4 PGE2異常增加促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生

3 討 論

PGE2是一種G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)配體，通過COX- 2的作用從花生四烯酸合成，并且作為關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞因子〔6〕，在結(jié)腸再生和腫瘤發(fā)生中起重要作用，因此，PGE2是再生醫(yī)學(xué)和癌癥預(yù)防的重要藥物靶標(biāo)〔7〕。例如，最近，15- PGDH抑制劑(SW033291)顯示通過增加PGE 2促進(jìn)組織再生〔8〕；另一方面，長(zhǎng)期使用降低PGE2的COX抑制劑降低PGE2水平，抑制結(jié)腸炎后的結(jié)腸再生，但可降低結(jié)腸直腸癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)〔9〕。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)EP4(PGE2受體拮抗劑)加劇DSS- 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，但可預(yù)防結(jié)腸腫瘤發(fā)生〔10〕。然而，PGE2介導(dǎo)的上述生物學(xué)功能的下游效應(yīng)物尚未被清楚了解。

Yes信號(hào)通路相關(guān)蛋白(YAP，Hippo通路的下游致癌基因)被證明參與組織再生的調(diào)節(jié)，特別是YAP對(duì)于在DSS介導(dǎo)的結(jié)腸損傷后的組織再生是必需的，同時(shí)高度活化YAP將導(dǎo)致腸癌的發(fā)生，與PGE2表型高度類似〔11〕。文獻(xiàn)報(bào)道YAP信號(hào)通路激活可上調(diào)PTGS2(PGE2合成關(guān)鍵酶，又稱 COX- 2)和PTGER4(編碼EP4)表達(dá)，因此推測(cè)YAP信號(hào)通路也可促進(jìn)促進(jìn)PGE2信號(hào)通路的激活，與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)直腸癌的形成與PGE2和YAP信號(hào)通路高度相關(guān)，且PGE2和YAP在腫瘤形成期間常被顯著上調(diào)〔5〕，

通過一系列的實(shí)驗(yàn)，依次推理和證明了PGE2正向調(diào)控YAP信號(hào)通路，而YAP通過上調(diào)EP4和 COX- 2形成正向反饋回路，同時(shí)YAP可調(diào)控PGE2介導(dǎo)的結(jié)腸再生，異常的PGE2信號(hào)激活可促進(jìn)息肉及結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究的結(jié)果清楚地顯示了PGE2通過激活YAP正反饋回路促進(jìn)小鼠結(jié)腸炎后結(jié)腸再生及癌變的分子機(jī)制，表明PGE2在結(jié)腸炎和腫瘤發(fā)生后的再生期間起到關(guān)鍵作用，有助于結(jié)腸炎后的組織再生和結(jié)腸直腸腫瘤發(fā)生過程的預(yù)防和臨床治療。

本研究結(jié)果突出顯示了YAP在結(jié)腸再生過程中的重要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能，證明YAP的過度表達(dá)實(shí)際上是腫瘤發(fā)生的一個(gè)非常重要的風(fēng)險(xiǎn)因素，與文獻(xiàn)報(bào)道的YAP mRNA在人類結(jié)腸癌中增加相吻合〔12〕。以前的研究已經(jīng)證明長(zhǎng)期使用COX抑制劑可通過下調(diào)PGE2預(yù)防結(jié)腸直腸癌的發(fā)生和抑制結(jié)腸再生的風(fēng)險(xiǎn)〔13〕。本研究也發(fā)現(xiàn)，PGE2和YAP之間的正反饋回路是通過COX- 2作為橋接完成的，采用EP4受體拮抗劑可降低DSS介導(dǎo)的結(jié)腸炎后結(jié)腸再生，但可防止結(jié)腸腫瘤的發(fā)生，因此PGE2和YAP之間的正反饋回路在結(jié)腸再生和結(jié)腸直腸腫瘤發(fā)生中起著中心作用。

1 Wang D,Dubois RN.Eicosanoids and cancer〔J〕.Nat Rev Cancer,2010;10(1):181- 93.

2 Brown JR,DuBois RN.COX- 2:a molecular target for colorectal cancer prevention〔J〕.J Clin Oncol,2005;23(12):2840- 55.

3 Zhang Y,Desai A,Yang SY,etal.Tissue regeneration.Inhibition of the prostaglandin- degrading enzyme 15- PGDH potentiates tissue regeneration〔J〕.Science,2015;348(6240):aaa2340.

4 Kabashima K,Saji T,Murata T,etal.The prostaglandin receptor EP4 suppresses colitis,mucosal damage and CD4 cell activation in the gut〔J〕.J Clin Invest,2002;109(7):883- 93.

5 Johnson R,Halder G.The two faces of Hippo:targeting the Hippo pathway for regenerative medicine and cancer treatment〔J〕.Nat Rev Drug Discov,2014;13(1):63- 79.

6 Yu FX,Zhao B,Panupinthu N,etal.Regulation of the Hippo- YAP pathway by G- protein- coupled receptor signaling〔J〕.Cell,2012;150(4):780- 91.

7 Myung SJ,Rerko RM,Yan M,etal.15- Hydroxyprostaglandin dehydrogenase is an in vivo suppressor of colon tumorigenesis〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2006;103(32):12098- 102.

8 Coggins KG,Latour A,Nguyen MS,etal.Metabolism of PGE2 by prostaglandin dehydrogenase is essential for remodeling the ductus arteriosus〔J〕.Nat Med,2002;8(1):91- 2.

9 Castellone MD,Teramoto H,Williams BO,etal.Prostaglandin E2 promotes colon cancer cell growth through a Gs- axin- beta- catenin signaling axis〔J〕.Science,2005;310(5753):1504- 10.

10 Pugh S,Thomas GA.Patients with adenomatous polyps and carcinomas have increased colonic mucosal prostaglandin E2〔J〕.Gut,1994;35(5):675- 8.

11 Yang VW,Shields JM,Hamilton SR,etal.Size- dependent increase in prostanoid levels in adenomas of patients with familial adenomatous polyposis〔J〕.Cancer Res,1998;58(8):1750- 3.

12 Zeng Q,Hong W.The emerging role of the hippo pathway in cell contact inhibition,organ size control,and cancer development in mammals〔J〕.Cancer Cell,2008;13(3):188- 92.

13 Iglesias- Bartolome R,Torres D,Marone R,etal.Inactivation of a Gα(s)- PKA tumour suppressor pathway in skin stem cells initiates basal- cell carcinogenesis〔J〕.Nat Cell Biol,2015;17(6):793- 803.

〔2017- 01- 22修回〕

(編輯 李相軍)

付高潔(1983- )，女，主管護(hù)師，主要從事消化內(nèi)科疾病研究。

陶英歌(1979- )，女，主管護(hù)師，主要從事消化內(nèi)科疾病研究。

R57

A

1005- 9202(2017)15- 3681- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.017