王詠梅 賈新轉(zhuǎn)

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050011)

巨噬細(xì)胞表達(dá)分泌的抗菌肽在卵巢癌發(fā)展中的作用及調(diào)控機制

王詠梅 賈新轉(zhuǎn)1

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050011)

目的 探討巨噬細(xì)胞表達(dá)分泌的抗菌肽Hcap18/LL37在卵巢癌發(fā)展中的作用及調(diào)控機制。方法 構(gòu)建卵巢癌細(xì)胞株OVCAR- 3與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模型，采用Matrigel小室檢測巨噬細(xì)胞對OVCAR- 3侵襲力的影響；Western印跡法和qRT- PCR檢測Hcap18/LL37和VersicanV1蛋白和mRNA的表達(dá)水平。使用干擾質(zhì)粒抑制OVCAR- 3細(xì)胞中VersicanV1的表達(dá)，分析巨噬細(xì)胞中Hcap18/LL37表達(dá)和OVCAR- 3細(xì)胞的侵襲力。結(jié)果 共培養(yǎng)組侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于OVCAR- 3單獨培養(yǎng)組(P<0.05)；Hcap18/LL37抗體共培養(yǎng)組侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對照IgG共培養(yǎng)組(P<0.05)。共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞中Hcap18/LL37 蛋白和mRNA相對表達(dá)量高于單獨培養(yǎng)(P<0.01)；OVCAR- 3細(xì)胞中Hcap18/LL37蛋白和mRNA相對表達(dá)量與單獨培養(yǎng)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。VersicanV1轉(zhuǎn)染卵巢OVCAR- 3細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，VersicanV1蛋白相對表達(dá)量高于OVCAR- 3細(xì)胞單獨培養(yǎng)時(P<0.01)。巨噬細(xì)胞與VersicanV1沉默OVCAR- 3細(xì)胞共培養(yǎng)組侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)低于VersicanV1高表達(dá)OVCAR- 3細(xì)胞共培養(yǎng)組(P<0.01)。結(jié)論 卵巢癌內(nèi)環(huán)境中巨噬細(xì)胞分泌的抗菌肽Hcap18/LL37促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲，其表達(dá)受腫瘤細(xì)胞分泌的VersicanV1蛋白調(diào)控。

巨噬細(xì)胞；抗菌肽；卵巢癌；Versican V1

抗菌肽Hcap18/LL37最初被認(rèn)為是一種先天性免疫細(xì)胞分泌的宿主防御肽，可清除微生物。相關(guān)研究顯示，Hcap18/LL37還具有抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成等多樣的生物學(xué)功能〔1〕。最新研究發(fā)現(xiàn)，Hcap18/LL37也可促進(jìn)肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種癌細(xì)胞增殖〔2〕。但其在腫瘤微環(huán)境中對癌細(xì)胞組間作用和表達(dá)調(diào)控機制仍未明確。本研究通過構(gòu)建卵巢癌細(xì)胞株OVCAR- 3與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模型，模擬體內(nèi)卵巢癌內(nèi)環(huán)境，探討Hcap18/LL37在卵巢癌細(xì)胞發(fā)展中的作用及表達(dá)調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR- 3購于上海邦景實業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購于北京方程生物科技有限公司；巨噬細(xì)胞集落刺激因子購于上海貝基生物科技有限公司；兔抗人Hcap18/LL37抗體、兔抗人VersicanV1抗體、鼠抗人β- actin抗體購于上海研生生化試劑有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鼠抗體購于上海研盟生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) ①人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR- 3培養(yǎng)：將細(xì)胞株接種到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放入CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。②外周血單個核細(xì)胞(PBMC)衍生的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)：使用單個核細(xì)胞分離液，密度梯度離心法分離PBMC，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)離心洗滌后，加入含50 ng/ml的巨噬細(xì)胞集落刺激因子的DMEM培養(yǎng)液孵育7 d，誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞。③人卵巢癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)：人卵巢癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞等比例分別培養(yǎng)在6孔板和Transwell培養(yǎng)皿，之后將Transwell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，共培養(yǎng)到說明書指定時間后檢測Hcap18/LL37表達(dá)情況。

1.2.2 細(xì)胞侵襲能力檢測 使用Matrigel小室進(jìn)行檢測，人卵巢癌細(xì)胞以1×104/孔的密度接種到上室，巨噬細(xì)胞以1×104/孔的密度接種到下室。培養(yǎng)3 d后將進(jìn)入小室濾膜下表面的細(xì)胞取出后離心，重懸于100 μl的PBS，甩片。細(xì)胞涂片干燥后染色，熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)量。實驗組加入3 μg/ml的Hcap18/LL37抗體，對照組加入等濃度的免疫球蛋白(Ig)G。

1.2.3 Western印跡檢測 離心收集細(xì)胞，抽提總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量，取40 μg總蛋白行10%十二烷基聚丙烯酰胺凝膠(SDS- PAGE)電泳。細(xì)胞單獨或共培養(yǎng)36 h，將上清液濃縮至原體積的10%，行Nu- PAGE梯度電泳，轉(zhuǎn)膜。室溫環(huán)境下孵育60 min，洗膜后ECL顯影。一抗為兔抗人Hcap18/LL37(1∶1 000)、VersicanV1(1∶500)和鼠抗人β- actin(1∶5 000)；二抗為HRP標(biāo)記的兔抗鼠抗體(1∶5 000)。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期OVCAR- 3細(xì)胞，以1×108/孔的密度接種至2 ml電轉(zhuǎn)緩沖液中，與10 μg VersicanV1感染質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)?；旌?，電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染。再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到DMEM培養(yǎng)液中，CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，更換含10 μg/mL的嘌呤霉素新鮮培養(yǎng)液，每5 d換液1次。培養(yǎng)28 d后Western印跡法鑒定細(xì)胞中VersicanV1表達(dá)情況，有限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞。

1.2.5 qRT- PCR檢測 收集細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行qRT- PCR檢測，反應(yīng)體系20 μl(cDNA 1 μl、Taq酶0.5 μl、dNTP 2 μl、上游和下游引物各1 μl、緩沖液5 μl、雙蒸水10.5 μl)；反應(yīng)條件：94℃ 5 min、94℃ 30 s、60℃ 45 s、70℃ 60 s，共30個循環(huán)，β- actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 Hcap18/LL37對人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR- 3侵襲能力的影響 OVCAR- 3單獨培養(yǎng)組、共培養(yǎng)組(OVCAR- 3與巨噬細(xì)胞)、Hcap18/LL37抗體共培養(yǎng)組(Hcap18/LL37抗體、OVCAR- 3、巨噬細(xì)胞)、對照IgG共培養(yǎng)組(IgG、OVCAR- 3、巨噬細(xì)胞)、OVCAR- 3對照IgG培養(yǎng)組(OVCAR- 3單獨培養(yǎng)、IgG)的侵襲穿膜細(xì)胞分別為(7.85±2.10)個、(108.59±25.82)個、(23.35±6.82)個、(99.60±19.53)個、(7.59±2.37)個。共培養(yǎng)組侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于OVCAR- 3單獨培養(yǎng)組(P<0.05)；Hcap18/LL37抗體共培養(yǎng)組侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對照IgG共培養(yǎng)組(P<0.05)。見圖1。

圖1 巨噬細(xì)胞及Hcap18/LL37抗體對OVCAR- 3細(xì)胞侵襲力影響(×200)

2.2 OVCAR- 3誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)Hcap18/LL37情況 OVCAR- 3與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞中Hcap18/LL37蛋白表達(dá)量隨培養(yǎng)時間延長而增加；OVCAR- 3細(xì)胞中Hcap18/LL37蛋白表達(dá)量共培養(yǎng)后無明顯變化。共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞中Hcap18/LL37 mRNA相對表達(dá)量(14.65±2.38)明顯高于單獨培養(yǎng)時(1.39±0.41)(P<0.01)；OVCAR- 3細(xì)胞中Hcap18/LL37 mRNA相對表達(dá)量(2.51±0.82)與單獨培養(yǎng)時(2.43±0.60)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 共培養(yǎng)不同時間巨噬細(xì)胞和OVCAR- 3細(xì)胞中Hcap18/LL37蛋白表達(dá)情況

2.3 VersicanV1蛋白在OVCAR- 3細(xì)胞中的表達(dá) VersicanV1轉(zhuǎn)染卵巢OVCAR- 3細(xì)胞后，Western印跡檢測VersicanV1蛋白相對表達(dá)量為(5.93±1.28)；與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后表達(dá)量為(18.92±3.05)，明顯高于OVCAR- 3細(xì)胞單獨培養(yǎng)時(P<0.01)。

2.4 干擾OVCAR- 3細(xì)胞VersicanV1表達(dá)對巨噬細(xì)胞Hcap18/LL37表達(dá)和侵襲力的影響 巨噬細(xì)胞單獨培養(yǎng)、VersicanV1沉默的OVCAR- 3細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)、VersicanV1高表達(dá)的OVCAR- 3細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞中Hcap18/LL37 蛋白表達(dá)水平分別為(3.05±0.42)、(3.89±0.76)、(17.92±4.50)；mRNA相對表達(dá)量分別為(0.87±0.06)、(1.10±0.14)、(10.38±3.38)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。巨噬細(xì)胞與VersicanV1沉默OVCAR- 3細(xì)胞共培養(yǎng)組侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(10.30±3.51)個，明顯低于與Versican V1高表達(dá)OVCAR- 3細(xì)胞共培養(yǎng)組〔(115.60±24.95)個，P<0.01〕。

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中炎性因子水平與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有明顯關(guān)系〔3〕。本研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞可有效提升OVCAR- 3細(xì)胞的侵襲力，加入Hcap18/LL37抗體共培養(yǎng)時明顯減弱了OVCAR- 3細(xì)胞的侵襲力，提示Hcap18/LL37是提升卵巢癌細(xì)胞侵襲力的主要因子之一。

相關(guān)研究顯示，感染和炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)Hcap18/LL37的表達(dá)與分泌，但在腫瘤微環(huán)境中其調(diào)控機制仍未明確〔4〕。本研究說明巨噬細(xì)胞是卵巢癌微環(huán)境中Hcap18/LL37表達(dá)與分泌的主要來源，而非腫瘤細(xì)胞本身。

本研究中卵巢癌細(xì)胞存在提升了巨噬細(xì)胞Hcap18/LL37的表達(dá)水平，可能與癌細(xì)胞分泌的某種因子介導(dǎo)有關(guān)。Versican V1屬于Lectiacn家族，表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，其可降低腫瘤細(xì)胞之間及與基質(zhì)之間的黏附力，提升腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲能力〔5〕。本研究結(jié)果提示在卵巢癌微環(huán)境中巨噬細(xì)胞Hcap18/LL37表達(dá)受腫瘤細(xì)胞分泌的VersicanV1調(diào)控，巨噬細(xì)胞可明顯提升卵巢癌細(xì)胞VersicanV1表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。卵巢癌微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞分泌的抗菌肽Hcap18/LL37可提升癌細(xì)胞侵襲力，腫瘤細(xì)胞分泌的Versican V1可調(diào)控巨噬細(xì)胞Hcap18/LL37的表達(dá)與分泌，二者形成一個正反饋環(huán)。通過抑制巨噬細(xì)胞Hcap18/LL37的表達(dá)或下調(diào)腫瘤細(xì)胞Versican V1的表達(dá)來抑制卵巢癌的發(fā)展有望成為一個新方法。

1 王素琴,安紅軍,徐勝東,等.P38MAPK通路在老年卵巢癌化療藥物耐藥性產(chǎn)生中的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2016;36(11):2601- 2.

2 張 彥,滿霞霞,劉曉燕,等.上皮性卵巢癌患者特征分析〔J〕.中國衛(wèi)生工程學(xué),2016;15(1):79- 80,83.

3 唐銳先,張 穎,張 巍,等.白藜蘆醇對卵巢癌細(xì)胞株SKOV- 3細(xì)胞周期的影響及誘導(dǎo)其凋亡的機制研究〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016;17(5):611- 5.

4 盧建軍,宋建東,張林燕,等.PIK3 CA、TIEG1在老年卵巢癌組織中的表達(dá)及意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2015;35(10):2719- 21.

5 李丹丹,樸金霞,王婷婷,等.臨床完全緩解卵巢上皮性癌CA125界值與預(yù)后相關(guān)性研究〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2015;16(4):468- 70.

〔2017- 03- 25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

河北省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研基金項目(No.zl20140305)

王詠梅(1970- )，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3670- 02；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.012

1 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科