劉楠楠 王立英 姜 晶 董志恒 李 才
(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室,吉林 吉林 132013)
苯那普利對糖尿病腎病大鼠腎臟結(jié)締組織生長因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用
劉楠楠 王立英1姜 晶2董志恒 李 才3
(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室,吉林 吉林 132013)
目的 研究苯那普利對糖尿病腎病(DN)大鼠腎臟結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)的調(diào)節(jié)。方法 Wistar大鼠34只,隨機(jī)分為:對照組、DN、苯那普利組。DN組及苯那普利組大鼠經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立DN模型。于實驗第12周末處死大鼠測量大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、腎功能、尿白蛋白排泄率(UAER)及24 h尿總蛋白。應(yīng)用免疫組化方法檢測腎臟CTGF蛋白表達(dá),并進(jìn)行半定量分析。結(jié)果 與對照組相比,DN組大鼠空腹血糖、血尿素氮、血清肌酐、UAER 及24h尿總蛋白顯著升高(P<0.05或P<0.01);腎臟CTGF表達(dá)增加(P<0.05)。DN大鼠苯那普利組各項檢測指標(biāo)均較模型組顯著改善(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 苯那普利可下調(diào)DN苯那普利腎組織CTGF的表達(dá),降低蛋白尿,保護(hù)腎功能。
腎組織;苯那普利;結(jié)締組織生長因子;糖尿病腎病
糖尿病腎病(DN)是最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥,其主要病理特征為腎小球系膜基質(zhì)積聚、腎小球和腎小管基底膜增厚及腎間質(zhì)纖維化,已成為終末期腎衰竭和糖尿病患者死亡的主要病因〔1〕。在DN導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的過程中,結(jié)締組織生長因子(CTGF)是關(guān)鍵性細(xì)胞因子之一,參與纖維化過程〔2〕。本研究建立鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的DN大鼠模型,觀察苯那普利對DN大鼠腎組織CTGF表達(dá)的影響。
1.1 動物 Wistar大鼠34只,體重197~255 g,雌雄各半,健康狀態(tài)良好,血糖正常,購自吉林省藥品檢驗實驗動物科。實驗期間所有動物自由飲水進(jìn)食,保持室內(nèi)通風(fēng)、墊料干燥。
1.2 儀器、試劑及藥品 LD5- 2A醫(yī)用離心機(jī),北京醫(yī)用離心機(jī)廠制造;日立7150型自動生化分析儀,日本生產(chǎn);T1000電子天平,常熟雙杰測試儀器廠;血糖測定儀,三諾公司;Olympus 顯微鏡,日本。STZ購自美國Sigma公司;苯那普利,購自北京諾華公司;兔抗人CTGF多克隆抗體,購自上海穎心實驗設(shè)備有限公司;尿白蛋白酶免疫法試劑盒,購自上海德波生物技術(shù)公司;血糖高靈敏度試劑盒,購自匯力生物工程技術(shù)有限公司;尿葡萄糖檢測試紙片,購自桂林中輝生物技術(shù)有限公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 分組與DN模型制備 Wistar大鼠34只,隨機(jī)分為對照組(n=10)、DN模型組(n=12)、苯那普利組(n=12)。給DN組及苯那普利組大鼠腹腔一次性注射STZ 60 mg/kg。給對照組腹腔注射不含STZ的同等體積的緩沖液。72 h后由尾尖靜脈采血測量空腹血糖,當(dāng)空腹血糖≥16.7 mmol/L,3 w后檢測24 h尿蛋白定量,當(dāng)其>30 mg時,為DN模型建立成功。隨后將造模成功的大鼠分為DN組及苯那普利組。穩(wěn)定1 w后,給DN組大鼠每日灌服苯那普利10 mg·kg-1·d-1。對照組及DN組給予等量生理鹽水灌服,連續(xù)灌服12 w。實驗期間所有大鼠未給胰島素及其他降糖藥物。給實驗大鼠腹腔注射STZ后,其多飲、多食及多尿表現(xiàn)顯明。但DN組有4只死亡,而苯那普利組有3只死亡。
1.3.2 標(biāo)本留取 實驗第12周時,給各組大鼠稱重,并經(jīng)尾靜脈采血測量空腹血糖,并用代謝籠收集大鼠24 h尿樣,記錄尿量,離心除掉沉渣,-20℃保存待測尿白蛋白。給所有動物乙醚麻醉,處死動物,眶后靜脈采血,肝素抗凝,分離血清(2 000 r/min,10 min),保存于-74℃冰箱。剖開腹腔,取出腎臟,用生理鹽水清洗,去掉包膜,使用精密天平稱重,經(jīng)腎門冠狀面取腎組織,置入10%中性福爾馬林液固定待作免疫組化檢查。
1.3.3 生化指標(biāo)測定 尿白蛋白排泄率(UAER)、尿素氮、空腹血糖、血肌酐采用全自動生化分析儀測定。尿總白蛋白采用雙縮脲法測定。
1.3.4 免疫組化測定 將已用10%福爾馬林液固定的腎組織,石蠟包埋,制片4 μm厚,二甲苯脫蠟,酒精脫水,滴加3%甲醛H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,滴加兔抗人CTGF多克隆抗體(1∶100)工作液,室溫孵育60 min,此后加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG,室溫孵育20 min,再加入鏈霉素生物素辣根過氧化物酶工作液,室溫孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水,透明,樹膠封片,磷酸鹽緩沖液(PBS)替代Ⅰ抗作陰性對照。對圖像進(jìn)行分析應(yīng)用Image- pro plus圖像分析系統(tǒng),隨機(jī)選取8個不重疊視野(×400),測定陽性染色部位的積分光密度值為半定量分析值。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗。
2.1 體質(zhì)量、腎質(zhì)量及腎質(zhì)量/體質(zhì)量狀況 實驗前各組大鼠體質(zhì)量均無明顯不同。成模后在實驗第12周時,DN組及苯那普利組大鼠體質(zhì)量減輕,與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)。苯那普利組成模后至12 w末時體質(zhì)量較DN組明顯增加(P<0.05)。但苯那普利組腎質(zhì)量/體質(zhì)量與DN組比較顯著降低(P<0.01),見表1。
2.2 生化指標(biāo) 實驗前各組大鼠血糖比較均無明顯差異。12 w末時,苯那普利組與DN組空腹血糖較對照組顯著增高(P<0.01),苯那普利組與DN組顯著降低(P<0.01)。腎功能指標(biāo),DN組大鼠UAER、尿總蛋白、尿素氮、血肌酐較對照組顯著升高(P<0.01),與DN組比較,苯那普利組UAER、尿總蛋白、血肌酐及尿素氮均明顯下降(P<0.01),見表2。
2.3 腎組織CTGF的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示,CTGF在腎小球系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞及系膜區(qū)的陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒。CTGF在對照組大鼠腎小球內(nèi)表達(dá)微弱(呈輕微著色,僅見少量淺淡黃色顆粒);DN組大鼠CTGF表達(dá)明顯增強(qiáng)(著色加深,呈棕黃色);苯那普利組大鼠CTGF表達(dá)較DN組減輕(著色變淺,呈淺黃色)。見圖1。半定量結(jié)果表明,DN組(0.50±0.09)較對照組(0.31±0.05,P<0.05)顯著增強(qiáng);苯那普利組(0.38±0.07)較DN組顯著降低(P<0.05)。
表1 各組大鼠體質(zhì)量、腎質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量比較
與對照組比較:1)P<0.01,2)P<0.05;與DN組比較:3)P<0.05,4)P<0.01
表2 各組相關(guān)指標(biāo)比較
與對照組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.01
圖1 腎組織CTGF免疫組化染色結(jié)果(DAB,×400)
DN的明確發(fā)病機(jī)制并不十分清楚,目前認(rèn)為多種因素可能與DN的發(fā)生有關(guān)。但在DN機(jī)制中CTGF的作用越來越受到廣泛關(guān)注。CTGF屬于即刻早期基因CCN家族成員之一。近年研究發(fā)現(xiàn),CTGF與包括血管、心臟、腎臟、胰腺、肺及肝臟等在內(nèi)的許多組織器官纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3~5〕。正常情況下,體內(nèi)的CTGF表達(dá)很低或無表達(dá),但在腎等器官病理狀態(tài)下,便會出現(xiàn)CTGF過度表達(dá)〔6〕。初步研究表明,在腎臟疾病時,CTGF主要表達(dá)于腎臟中起源于中胚層的固有細(xì)胞,如臟層上皮細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞〔7〕。Ren等〔8〕在研究中發(fā)現(xiàn),在糖尿病狀態(tài)下,腎臟分泌或產(chǎn)生更多的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF- β),進(jìn)而促進(jìn)CTGF等細(xì)胞因子的作用。但從DN早期開始系膜細(xì)胞與腎小球足細(xì)胞的CTGF表達(dá)呈顯著升高〔9〕。
正常狀態(tài)下,CTGF的含量很低,高血糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及機(jī)械應(yīng)力等作用可以使CTGF過度表達(dá),結(jié)果引起細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分,如纖維連接蛋白(FN),膠原等的增多,并參與DN發(fā)生〔10〕。研究提示,CTGF可能是TGF- β1促纖維化活性的下游信號介質(zhì),在刺激細(xì)胞增殖及ECM的形成、促進(jìn)組織器官纖維化方面起重要作用〔11〕。AGEs是高血糖環(huán)境中糖與蛋白質(zhì)上的游離氨基酸、脂肪及核酸之間反應(yīng)形成,當(dāng)AGEs同特異受體結(jié)合影響生長因子及細(xì)胞因子如CTGF與TGF- β的表達(dá),導(dǎo)致ECM的合成和降解失衡,引發(fā)腎纖維〔12〕。高血糖狀態(tài)下,腎組織CTGF產(chǎn)生增多,可能是由于糖尿病糖代謝紊亂所致。因此控制高血糖,減少AGEs的形成,也是防止糖尿病發(fā)展為DN的重要措施。
本研究結(jié)果提示,應(yīng)用苯那普利對DN大鼠進(jìn)行干預(yù),可明顯減輕其腎臟的病理性損傷,其作用機(jī)制很可能與苯那普利下調(diào)DN大鼠腎組織中CTGF的表達(dá)有關(guān)。已有研究證實,在DN早期即有血、尿及腎組織中CTGF水平增高〔13〕。尿中CTGF濃度與DN的嚴(yán)重程度,即UAER和腎小球濾過率呈正相關(guān)〔10〕。尿蛋白增多不僅是DN損害的表現(xiàn),而且也是腎病和心血管病進(jìn)展的重要因素〔14〕,說明腎組織中CTGF表達(dá)水平的變化通常與DN的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本實驗結(jié)果提示,苯那普利通過抑制DN大鼠腎組織中CTGF的表達(dá),而發(fā)揮其保護(hù)腎功能的作用機(jī)制。
1 Dronavalli S,Duka I,Bakris GL.The pathogenesis of diabetic nephropathy 〔J〕.Nat Clin Pract Endocrinol Met,2008;4(8):444- 52.
2 王 俏,杜 勤,雷 鏡.糖尿病腎病大鼠CTGF異常表達(dá)及藥物干預(yù)研究〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2008;28(5):536- 9.
3 Kiran G,Nandini CD,Ramesh HP,etal.Progression of early phase diabetic nephropathy in streptozotocin- induced diabetic rats:evaluation of various kidney- related parameters 〔J〕.Indian J Exp Biol,2012;50(2):133- 40.
4 Tundemir M,Oztürk M,Histochem A.The effects of angiotensin- Ⅱ receptor blockers on podocyte damage and glomerular apoptosis in a rat model of experimental streptozotocin- induced diabetic nephropathy 〔J〕.Acta Histochem,2011;113(8):826- 32.
5 Yao L,Wang J,Mao Y,etal.Different expressions of protein kinase C- alpha,beta Ⅰ and beta Ⅱ in glomeruli of diabetic nephropathy patients〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2006;26(6):651- 3.
6 Kapoor M,Liu S,Huh K,etal.Connective tissue growth factor promoter activity in normal and wounded skin〔J〕.Fibrogenesis Tissue Repair,2008;1(1):3- 11.
7 Ruiz- Ortega M,Rupérez M,Esteban V,etal.Angiotensin Ⅱ:a key factor in the inflammatory and fibrotic response in kidney diseases 〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2006;21(1):16- 20.
8 Ren X,Guan G,Liu G,etal.Irbesartan ameliorates diabetic nephropathy by reducing the expression of connective tissue growth factor and alpha- smooth- muscle actin in the tubulointerstitium of diabetic rats〔J〕.Pharmacology,2009;83(2):80- 7.
9 Wahab NA,Schaefer L,Weston BS,etal.Glomerular expression of thrombospondin- 1,transforming growth factor beta and connective tissue growth factor at different stages of diabetic nephropathy and their interdependent roles in mesangial response to diabetic stimuli〔J〕.Diabetologia,2005;48(12):2650- 60.
10 Nguyen TQ,Tarnow L,Andersen S,etal.Urinary connective tissue growth factor excretion correlates with clinical markers of renal disease in a large population of type 1 diabetic patients with diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes Care,2006;29(1):83- 8.
11 聶 興,劉 暢,宛 月.厄貝沙坦對糖尿病腎病大鼠腎臟結(jié)締組織生長因子及纖維連接蛋白表達(dá)的影響〔J〕.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013;30(4):526- 30.
12 董 明,王秋月.結(jié)締組織生長因子:糖尿病腎病治療的新靶點(diǎn)〔J〕.國際內(nèi)科學(xué)雜志,2008;35(8):456- 9.
13 Roestenberg P,van Nieuwenhoven FA,Joles JA,etal.Temporal expression profile and distribution pattern indicate a role of connective tissue growth factor (CTGF/CCN- 2) in diabetic nephropathy in mice 〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2006;290(6):F1344- 54.
14 Jefferson JA,Shankland SJ,Pichler RH.Proteinuria in diabetic kidney disease:a mechanistic viewpoint 〔J〕.Kidney Int,2008;74(1):22- 36.
〔2016- 01- 28修回〕
(編輯 苑云杰/曹夢園)
劉楠楠 (1976- ),女,醫(yī)學(xué)博士,副教授, 主要從事糖尿病腎病及腫瘤分子病理研究。
R587.2
A
1005- 9202(2017)15- 3659- 03;
10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.008
1 北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室 2 北華大學(xué)附屬醫(yī)院病理科 3 吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所