趙珍東 夏 黎 張現(xiàn)濤 方春生 馬建榮 汪小根
(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院中藥學(xué)院,廣東 廣州 510520)
銀杏葉內(nèi)酯N對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
趙珍東 夏 黎 張現(xiàn)濤1方春生 馬建榮 汪小根
(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院中藥學(xué)院,廣東 廣州 510520)
目的 探討銀杏內(nèi)酯N對(duì)過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法 用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷,刺激其凋亡,給予不同劑量的受試藥物干預(yù)。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率;用吖啶橙染色檢測(cè)銀杏內(nèi)酯N對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的作用;用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)銀杏內(nèi)酯N對(duì)PC12細(xì)胞活性氧(ROS)的影響,熒光定量RT- PCR法、Western印跡法分別檢測(cè)Bcl- 2、Bax mRNA和相應(yīng)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 銀杏內(nèi)酯N可對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的PC12損傷,提高存活率和抑制凋亡,降低PC12細(xì)胞ROS水平,與模型組比較均有顯著差異(P<0.05);Bcl- 2 蛋白及mRNA 表達(dá)量升高,而Bax mRNA和Bax蛋白及表達(dá)量降低,與模型組比較均有顯著差異(P<0.05),且呈一定的量效關(guān)系。結(jié)論 銀杏內(nèi)酯N可對(duì)抗H2O2的神經(jīng)毒性,其機(jī)制與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)有關(guān)。
銀杏內(nèi)酯N;PC12細(xì)胞;過氧化氫;凋亡
銀杏葉提取物具有神經(jīng)保護(hù)、改善認(rèn)知功能,擴(kuò)張血管,改善微循環(huán),抗血小活化因子,抗氧化,抗細(xì)胞凋亡等作用,能保護(hù)腦缺血損傷,對(duì)老年性癡呆具有防治作用〔1~4〕,其活性成分主要有黃酮類、萜內(nèi)酯類等,其中萜內(nèi)酯類——銀杏內(nèi)酯是銀杏葉提取物中的主要活性成分之一。銀杏總內(nèi)酯中目前研究較多的是銀杏內(nèi)酯B(GB),具有抗神經(jīng)損傷、抗腦缺血等作用。本課題組從銀杏粗提物中分離得到新化合物銀杏內(nèi)酯N(GN),結(jié)構(gòu)類似GB,水溶性優(yōu)于GB,其藥理活性可能比GB更強(qiáng)〔5,6〕。為了探討GN對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,本研究擬以大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株(PC12)為研究對(duì)象,用過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡,用吖啶橙染色觀察藥物抗細(xì)胞凋亡作用,流式細(xì)胞儀測(cè)定 PC12 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)濃度,熒光定量RT- PCR法及Western印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá),以探討其抗凋亡的作用機(jī)制。
1.1 試藥試劑與儀器 GN(自制,純度為97%〔7〕)、GB(四川維克奇生物科技公司,批號(hào):20140610),用二甲基亞砜配制成10 mmol/L的貯存液,均置于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)前用1640完全培養(yǎng)基稀釋至所需不同濃度。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、吖啶橙染色試劑盒,購(gòu)自北京斯百匯生物科技有限責(zé)任公司;ROS檢測(cè)試劑盒(DCFH- DA,2′,7′- 二氯熒光黃雙乙酸鹽),購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所;熒光定量RT- PCR檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自TAKARA公司;Bcl- 2、Bax 和β- actin 抗體,購(gòu)自Bioworld 公司;胎牛血清、馬血清購(gòu)自杭州四季青公司;1640培養(yǎng)基,購(gòu)自Gibco公司;其他試劑均為分析純。多功能酶標(biāo)儀(MK3型)、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(CT14RD)、超凈工作臺(tái)(MSC1.2)、CO2培養(yǎng)箱(Model 311),美國(guó)Thermo Forma公司;倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡,德國(guó)萊卡公司;流式細(xì)胞儀(Epics- XL),美國(guó)Beckman公司;熒光定量PCR儀LightCycler?480 Ⅱ,Roche公司;垂直凝膠電泳、電轉(zhuǎn)系統(tǒng),美國(guó)Bio- Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC12 細(xì)胞株,半分化,引自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。細(xì)胞復(fù)蘇后,加入含10%的馬血清,5%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37℃,5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。傳3~4代待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將傳3~4代 PC12 細(xì)胞以104/孔接種于96孔培養(yǎng)板,細(xì)胞貼壁過夜。實(shí)驗(yàn)分為6組:正常組(完全培養(yǎng)基中正常培養(yǎng),24 h后換培養(yǎng)液培養(yǎng))、模型組(細(xì)胞培養(yǎng)24 h后與0.2 mmol/L H2O2共培養(yǎng)24 h)、GN低、中、高劑量處理組(細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h后分別加入終濃度為2、4、8 μmol/L的 GN 2 h后,加入0.2 mmol/L H2O2作用24 h,GB終濃度為10 μmol/L)。
1.2.3 細(xì)胞存活率檢測(cè) 將PC12細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,并設(shè)空白孔(不加細(xì)胞和藥物)。24 h后,正常組加入100 μl新完全培養(yǎng)基,模型組加入含有H2O2的RPMI1640培養(yǎng)基,GN低、中、高劑量組在H2O2加入前2 h分別加入相應(yīng)濃度的GN或GB,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml),繼續(xù)孵育4 h,去上清加入DMSO 150 μl/孔,水平搖床振蕩,酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)讀取各孔吸光度值,讀取OD值。根據(jù)公式:細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照OD值)/(對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD值)×100%。
1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察 將PC12細(xì)胞按4×105個(gè)接種于12孔板,培養(yǎng)24 h后,按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)后,在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.2.5 吖啶橙染色 將PC12細(xì)胞按4×105個(gè)接種于12孔板,培養(yǎng)24 h后,按實(shí)驗(yàn)分組給以不同處理后,每孔加入10 μl 吖啶橙染色液(30 mg/L),避光染5 min,在熒光顯微鏡下觀察并拍照。
1.2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 將PC12細(xì)胞約8×105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板,處理同前,培養(yǎng)12 h后,胰酶消化,離心收集細(xì)胞,加入新鮮配制含有DCFH- DA(1∶1 000)的無血清培養(yǎng)基中,混勻后37℃避光孵育30 min,5 min間隔顛倒混勻,無血清培養(yǎng)基洗滌,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
1.2.7 熒光定量PCR法檢查Bcl- 2、Bax mRNA的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,收集各組細(xì)胞,按照Trizol一步法抽取細(xì)胞總RNA,定量后取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃15 min,85℃ 5 s。以β- actin為內(nèi)參照,上下游引物由生工生物工程(上海)公司合成。Bcl- 2 上游引物:5′- CCTTGTCAGCACTTGGAATG- 3′;下游引物:5′- CTTCATTCTTCAACTTGGGCG- 3′;Bax上游引物:5′- TGCTACAGGGTTTCATCCAGG- 3′;下游引物:5′- TCTGCCGTTGAAGTTACCCAG- 3′;β- actin上游引物:5′- AGAGGGAAATCGTGCGTGAC- 3′;下游引物:5′- TGGCACTTTTCTACTGGGTC- 3′。熒光定量PCR 擴(kuò)增:擴(kuò)增反應(yīng)條件如下,預(yù)變性:95℃ 30 s;40個(gè)循環(huán)(95℃ 5 s,60℃ 30 s);解離:95 ℃ 15 s,60℃ 60 s;溶解曲線:65℃ 30 s。溫度設(shè)置:起始溫度為65℃,結(jié)束溫度設(shè)為95℃,溫度變化設(shè)為0.5℃,重復(fù)次數(shù)61。熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后,采用ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值,ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt,基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。
1.2.8 Western印跡檢測(cè)Bcl- 2、Bax蛋白表達(dá)的變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,冰浴裂解細(xì)胞,高速4℃離心20 min,收集上清。經(jīng)Bio- Rad 法進(jìn)行蛋白定量后,電泳,轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉2 h,4℃一抗(1∶1 000)過夜。PBST洗膜3次,每次10 min。加二抗稀釋液(1∶5 000)孵育2 h,PBST 洗滌3次,每次10 min。加入ECL試劑,曝光,顯影,定影,掃描拍照。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。
2.1 GN對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷存活率的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選取0.2 mmol/L的H2O2濃度作為損傷濃度。0.2 mmol/L H2O2作用于PC12細(xì)胞24 h后,模型組細(xì)胞損傷明顯,存活率下降〔(52.07±2.72)%〕,與正常組相比差異顯著〔(99.91±1.0)%,P<0.01〕。給予低、中、高劑量GN干預(yù)后,細(xì)胞存活率明顯上升〔(62.86±1.95)%、(73.45±4.75)%、(80.16±3.19)%〕,與模型組有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。這表明GN能抑制H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞損傷,GN在2~8 μmol/L劑量范圍內(nèi),其保護(hù)作用呈量效關(guān)系,活性比GB〔(78.56±2.48)%〕強(qiáng)。
2.2 GN對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察,H2O2作用PC12細(xì)胞24 h后,可見細(xì)胞損傷明顯,細(xì)胞變圓,細(xì)胞間連接稀疏,少部分細(xì)胞脫落。給予不同劑量的GN后,細(xì)胞損傷減輕,與模型組相比,貼壁細(xì)胞數(shù)目增多,隨著GN劑量的增加,細(xì)胞間連接越緊密,可見具有抗損傷作用。見圖1。
圖1 GN對(duì)H2O2致PC12損傷形態(tài)的影響(×200)
2.3 GN對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的作用 鏡下可見,細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色后,正常組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,綠色均勻,細(xì)胞間連接緊密;模型組可見細(xì)胞變圓,部分細(xì)胞核染色質(zhì)濃染,碎裂,脫落;給予GN不同劑量干預(yù)后,出現(xiàn)核濃染的細(xì)胞少,細(xì)胞形態(tài)大部分正常,細(xì)胞損傷程度比模型組明顯減輕。見圖2。
圖2 GN對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12凋亡的影響(吖啶橙熒光染色,×200)
2.4 GN對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ROS升高的影響 正常組平均熒光強(qiáng)度值為(0.85±0.20),模型組平均熒光強(qiáng)度值為(5.05±0.47),與正常組比較,具有顯著差異(P<0.01),顯示細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高顯著;給予低、中、高劑量的GN處理后,其平均熒光強(qiáng)度值則分別為(4.06±0.18)、(3.18±0.20)和(2.13±0.25),與模型組比較,均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。而10 μmol/L的GB組ROS熒光強(qiáng)度值為(2.09±0.16),表明GN可拮抗H2O2刺激的PC12損傷時(shí)ROS水平的升高。
2.5 GN對(duì)H2O2刺激PC12細(xì)胞Bcl- 2、Bax mRNA表達(dá)的影響 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bcl- 2 mRNA表達(dá)降低(P<0.01),Bax mRNA表達(dá)升高(P<0.01),給予不同劑量的GN后,可逆轉(zhuǎn)上述基因的表達(dá)??梢?,GN可拮抗H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。見表1。
2.6 GN對(duì)H2O2刺激PCl2細(xì)胞Bcl- 2、Bax蛋白表達(dá)的影響 H2O2作用PC12細(xì)胞24 h后,細(xì)胞Bcl- 2表達(dá)下降(P<0.01),而Bax蛋白表達(dá)增加(P<0.01)。給予不同劑量的GN干預(yù)后,可逆轉(zhuǎn)上述蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。這表明GN可抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡。見圖3,表2。
表1 GN對(duì)H2O2刺激PC12細(xì)胞Bcl- 2、Bax mRNA表達(dá)的影響
與模型組比較:1)P<0.05,2)P<0.01,下表同
1~6:正常組、模型組、低劑量GN組、中劑量GN組、高劑量GN組、GB組圖3 GN對(duì)H2O2刺激PC12細(xì)胞Bcl- 2和Bax蛋白表達(dá)的影響
組別Bcl-2/β-actinBax/β-actin正常組1.289±0.0642)1.037±0.0652)模型組0.808±0.0771.319±0.091低劑量GN組1.139±0.0942)1.143±0.0361)中劑量GN組1.065±0.0582)1.066±0.0612)高劑量GN組1.114±0.0982)1.078±0.0842)GB組0.96±0.0601)1.012±0.0792)
PC12 細(xì)胞來源于腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系,具有神經(jīng)細(xì)胞的一般特征,可傳代,有利于量化評(píng)估藥效,因此常用作神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)研究,是比較理想的細(xì)胞模型〔8〕。H2O2作為機(jī)體自由基產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié),在細(xì)胞培養(yǎng)體系中,可進(jìn)一步分解為羥自由基和氧自由基,而自由基可直接攻擊細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝出現(xiàn)障礙、損傷膜的離子依賴性 ATP 酶及谷氨酸載體,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔9〕。研究證實(shí),ROS包括超氧離子、羥自由基等,是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的重要因素之一。ROS 可通過氧化損傷,導(dǎo)致DNA、膜脂和蛋白質(zhì)等多種生物分子損傷,細(xì)胞功能障礙,甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死〔10,11〕。H2O2參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程,能使細(xì)胞內(nèi)活性氧成分堆積,引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。檢測(cè) ROS 的生成水平,可直接反映細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平〔12〕。細(xì)胞凋亡過程中,Bcl 家族是體內(nèi)重要的凋亡調(diào)控基因,包括抗凋亡基因和促凋亡基因兩大類。其中抗凋亡基因Bcl- 2是目前最受關(guān)注的凋亡相關(guān)基因之一,通過編碼 Bcl- 2 蛋白而發(fā)揮抗凋亡作用。促凋亡基因如 Bax,通過與 Bcl- 2 形成異源二聚體來阻斷 Bcl- 2 的抗凋亡作用,從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。此外,Bcl- 2 還具有神經(jīng)保護(hù)功能,可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧自由基以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的損傷〔13,14〕。
本實(shí)驗(yàn)顯示不同劑量的GN能抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷和凋亡,從基因、蛋白水平上調(diào)Bcl- 2,下調(diào) Bax表達(dá)水平,從而增高Bcl- 2/Bax兩蛋白之間的比值,抑制細(xì)胞凋亡,可能是GN 對(duì)抗因H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。
1 Shi C,Liu J,Wu FM.Ginkgo biloba extract in Alzheimer′s disease:from action mechanisms to medical practice〔J〕.Int J Mol Sci,2010;11:107- 23.
2 Wang N,Chen XM,Geng DQ,etal.Ginkgo biloba leaf extract improves the cognitive abilities of rats with D- galactose induced dementia〔J〕.J Biomed Res,2013;27(1):29- 36.
3 Li JJ,Li JS,Hui RC.Ginkgo biloba extract for dementia:a systematic review〔J〕.Shanghai Arch Psychiatry,2013;25(1):10- 21.
4 劉秀萍,臧恒昌,于洪利.銀杏葉提取物的研究進(jìn)展與應(yīng)用前景〔J〕.藥學(xué)研究,2014;33(12):721- 3.
5 Zhang X,Li Y,Zhang L,etal.A new ginkgolide from Ginkgo biloba〔J〕.J China Pharma Univ,2009;40(4):306- 9.
6 馬舒?zhèn)?,王麗艷,張文治,等.銀杏內(nèi)酯N對(duì)PC12細(xì)胞缺血性損傷的保護(hù)作用〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2012;27(9):2409- 12.
7 趙珍東,張雷紅,夏 黎,等.銀杏葉內(nèi)酯N對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的PC12損傷的保護(hù)作用〔J〕.中藥材,2015;30(8):144- 9.
8 Malekinejad H,Moradi M,F(xiàn)ink- Gremmels J.Cytochrome C and Caspase- 3/7 are involved in mycophenolic acid- induced apoptosis in genetically engineered PC12 neuronal cells expressing the p53 gene〔J〕.Iran J Pharm Res,2014;13(1):191- 8.
9 Piao YF,Shi Y,Gao PJ.Inhibitory effect of all- trans retinoic acid on human hepatocellular carcinoma cell proliferation〔J〕.World J Gastroent erol,2003;9(9):2117- 20.
10 Buonocore G,Perrone S,Tataranno ML.Oxygen toxicity:chemistry and biology of reactive oxygen species〔J〕.Semin Fetal Neonatal Med,2010;15(4):186- 90.
11 Circu ML,Aw TY.Reactive oxygen species,cellular redox systems and apoptosis〔J〕.Free Radic Biol Med,2010;48(6):749- 62.
12 Chang QZ,Zhang SL,Yin JB.Role of chloride channels in nitric oxide- induced rat hippocampal neuronal apoptosis in vitro〔J〕.Neural Regen Res,2010;5(9):690- 4.
13 王曉敏,席曉甜,劉海云,等.菟絲子總黃酮對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2015;35(10):5742- 4.
14 肖興花.粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠血腫周圍組織中Bax及Bcl- 2蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2015;35(6):2927- 9.
〔2016- 06- 19修回〕
(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)
廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(No.20121106);廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院院級(jí)項(xiàng)目(No.2011YZ001)
汪小根(1970- ),男,博士,教授,主要從事中藥制劑及藥物作用機(jī)制研究。
趙珍東(1976- ),男,博士,副教授,主要從事中藥抗神經(jīng)損傷、抗腫瘤作用及機(jī)制研究。
R285
A
1005- 9202(2017)15- 3656- 03;
10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.007
1 廣東省中藥研究所