尚春香 付宏偉 南 征 馬吉成 李 葉

(青海省第五人民醫(yī)院腫瘤科，青海 西寧 810007)

Notch1表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

尚春香 付宏偉1南 征 馬吉成 李 葉

(青海省第五人民醫(yī)院腫瘤科，青海 西寧 810007)

目的 探討Notch1表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法 通過(guò)Western印跡檢測(cè)Notch1在人正常腎小管上皮細(xì)胞HK- 2，人腎癌細(xì)胞786- O，Caki- 1，769- P，GRC- 1及ACHN中的表達(dá)；siRNA Notch1及siRNA NC轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞48 h后，Western印跡及RT- PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況，MTT法及Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞活力及凋亡情況，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力，Western印跡檢測(cè)Bax，Bcl- 2，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2，MMP9蛋白表達(dá)。結(jié)果 HK- 2細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)量顯著低于5株腎癌細(xì)胞786- O，769- P，GRC- 1，Caki- 1及ACHN，且在Caki- 1中Notch1表達(dá)量最高，因此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株。siRNA Notch1及siRNA NC轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞48 h后，與siRNA NC組比較，siRNA Notch1組Notch1蛋白及mRNA表達(dá)量下調(diào)，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率提高，細(xì)胞侵襲數(shù)目減少，Bax表達(dá)量上調(diào)，Bcl- 2、MMP2及MMP9表達(dá)量下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論 Notch1低表達(dá)能顯著抑制腎癌細(xì)胞Caki- 1的惡性生物學(xué)行為，可能與調(diào)控細(xì)胞凋亡蛋白及下調(diào)MMPs表達(dá)有關(guān)。

Notch1；腎癌細(xì)胞；增殖；凋亡；侵襲

腎癌又稱為腎細(xì)胞癌，發(fā)病隱匿，一旦確診常處于晚期，且主要治療方式為手術(shù)根治性切除，但預(yù)后差〔1〕。Notch信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、遷移發(fā)揮著類似于干細(xì)胞自我更新的作用，且研究顯示此信號(hào)通路是一種獨(dú)立的小腦視網(wǎng)膜多發(fā)毛細(xì)血管瘤(VHL)/缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)途徑，與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔2〕。Notch有4種常見的受體(Notch1～Notch4)，其中Notch1研究最為廣泛。Notch1在包括腎癌在內(nèi)的多種腫瘤組織高度表達(dá)〔3〕。研究還顯示小分子RNA干擾Notch1能顯著抑制Caki- 1細(xì)胞增殖〔4〕；而過(guò)度活化的Notch1對(duì)于Caki- 1細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用〔5〕，但具體的作用機(jī)制未知。本研究將繼續(xù)探討Notch1對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人正常腎小管上皮細(xì)胞HK- 2，人腎癌細(xì)胞786- O、Caki- 1、769- P、GRC- 1及ACHN均購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑及儀器 四唑鹽試劑(MTT)，結(jié)晶紫(美國(guó)sigma公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒，Hoechst 33258染色試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)；LipofectamineTM2000，Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；兔抗人Bax，Bcl- 2，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2，MMP9，甘油醛- 3- 磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國(guó)Epitmics公司)；Transwell 小室(美國(guó)Corning 公司)；siRNA Notch1，Notch1 NC(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)。DMI4000倒置熒光顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)；DYCZ- 25D型雙垂直電泳儀，DYCZ- 25D型轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂公司)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到50%的時(shí)候，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將siRNA Notch1，Notch1 NC轉(zhuǎn)染到腎癌細(xì)胞，6 h后換成含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，Western印跡及RT- PCR檢測(cè)細(xì)胞中Notch1蛋白及mRNA的表達(dá)。

1.4 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力 將5×103個(gè)腎癌細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，按1.3轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入20 μl的MTT(終濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μl的二甲基亞砜，使沉淀物溶解，10 min后，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定OD值，OD值即代表細(xì)胞活力。每組平行3個(gè)實(shí)驗(yàn)。

1.5 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將1×104個(gè)腎癌細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按1.3轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，將Hoechst染色液加入6孔板，在室溫條件下避光染色15 min，并在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞發(fā)白發(fā)亮說(shuō)明細(xì)胞呈凋亡狀態(tài)。每組平行3個(gè)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲 在實(shí)驗(yàn)前Transwell小室微膜上均勻鋪上Matigel膠備用。腎癌細(xì)胞按1.3轉(zhuǎn)染后，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來(lái)，接種到Transwell的上室，而下室不接種細(xì)胞，僅加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將小室取出來(lái)，用多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌3次，結(jié)晶紫染色5 min，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，并對(duì)Transwell的下室中隨機(jī)5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取平均值，即為細(xì)胞的侵襲數(shù)目。每組平行3個(gè)實(shí)驗(yàn)。

1.7 RT- PCR檢測(cè)Notch1 mRNA在腎癌細(xì)胞株中的表達(dá) 根據(jù)Trizol試劑盒提取細(xì)胞總的RNA，并檢測(cè)總RNA的純度。接著利用一步法RT- PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增的產(chǎn)物。Notch1上游引物：5′- CCTTTGTGCTTCTGTTCTTCG- 3′，下游引物：5′- CCACTCATTCTGGTTGTCGTC- 3′。 GAPDH作為內(nèi)參，上游引物：5′- AGCCACATCGCTCAGACA- 3′，下游引物5′- TGGACTCCACGACGTACT- 3′。

1.8 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中Bax，Bcl- 2，MMP2，MMP9的表達(dá) 將1×104個(gè)腎癌細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按1.3進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在冰浴條件下將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞刮下來(lái)，離心收集細(xì)胞，并用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞30 min，4℃離心得到的上清液就是總蛋白。蛋白濃度根據(jù)BCA試劑盒來(lái)測(cè)定，測(cè)定后將蛋白煮沸10 min，使蛋白變性，然后上樣，上樣量大約30 ng左右，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，接著濕法轉(zhuǎn)膜30～40 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜置于2%的胎牛血清(BSA)中于室溫條件下封閉1 h。接著將膜放入一抗溶液(兔抗人Bax，Bcl- 2，MMP2，MMP9，GAPDH單克隆抗體，稀釋度1∶100)中孵育，4℃過(guò)夜；第2天將膜取出，放入二抗溶液在室溫條件下孵育1～2 h。凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Quantity one軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Notch1在人正常腎小管上皮細(xì)胞HK- 2及5株腎癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況 Notch1在人正常腎小管上皮細(xì)胞HK- 2，人腎癌細(xì)胞786- O，769- P，GRC- 1，Caki- 1及ACHN中的表達(dá)，結(jié)果表明HK- 2細(xì)胞(0.18±0.02)中Notch1蛋白表達(dá)量顯著低于5株腎癌細(xì)胞(0.35±0.03，0.48±0.05，1.23±0.12，1.37±0.13，0.38±0.04)，且在Caki- 1中Notch1表達(dá)量最高，因此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株。見圖1。

2.2 siRNA Notch1在Caki- 1細(xì)胞中的表達(dá) siRNA Notch1及Notch1 NC在Caki- 1細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，二者蛋白及mRNA表達(dá)量分別為〔(0.83±0.08 vs 0.16±0.01)及(1.01±0.10 vs 0.19±0.02)，P<0.01〕。見圖2。

2.3 siRNA Notch1對(duì)Caki- 1細(xì)胞活力及凋亡的影響 見圖3。

A：HK- 2；B：786- O；C：769- P；D：GRC- 1；E：Caki- 1；F：ACHN圖1 Notch1在人正常腎小管上皮細(xì)胞HK- 2及5株腎癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況

A：Notch1 NC組；B：siRNA Notch1組圖2 siRNA Notch1在Caki- 1細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 siRNA Notch1對(duì)Caki- 1細(xì)胞凋亡的影響

siRNA Notch1組(0.34±0.03)細(xì)胞活力顯著低于Notch1 NC組(0.76±0.07)(P<0.01)。通過(guò)Hoechst染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，siRNA Notch1組(38.45±3.80)%細(xì)胞凋亡率顯著高于Notch1 NC組(5.70±0.57)%(P<0.01)。

2.4 siRNA Notch1對(duì)Caki- 1細(xì)胞侵襲能力的影響 Caki- 1細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA Notch1組(43.21±4.30)細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著低于Notch1 NC組(145.38±14.98,P<0.01)。見圖4。

圖4 siRNA Notch1對(duì)Caki- 1細(xì)胞侵襲能力的影響(×200)

2.5 siRNA Notch1對(duì)Caki- 1細(xì)胞中Bax及Bcl- 2表達(dá)量的影響 Caki- 1細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，與Notch1 NC組比較，siRNA Notch1組Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl- 2表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。見圖5，表1。

2.6 siRNA Notch1對(duì)Caki- 1細(xì)胞中MMPs表達(dá)量的影響 Caki- 1細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，與Notch1 NC組比較，siRNA Notch1組MMP2及MMP9表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。見圖6，表1。

圖5 siRNA Notch1對(duì)Caki- 1細(xì)胞中Bax及Bcl- 2表達(dá)量的影響

圖6 siRNA Notch1對(duì)Caki- 1細(xì)胞中MMPs表達(dá)量的影響

組別Bcl-2/GADPHBax/GADPHMMP2/GADPHMMP9/GADPHNotch1NC組0.98±0.100.32±0.030.87±0.091.33±0.13siRNANotch1組0.38±0.031)1.12±0.101)0.20±0.021)0.46±0.041)

與Notch1 NC比較：1)P<0.01

3 討 論

Notch主要信號(hào)蛋白上的受體與配體結(jié)合，將信號(hào)傳遞給下一個(gè)受體并引起一系列分解過(guò)程，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖，分化，凋亡等過(guò)程〔6〕。因此，Notch信號(hào)通路在胚胎發(fā)育，神經(jīng)退行性疾病，免疫功能紊亂及腫瘤的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用〔2〕。Notch1于1991年從人類T淋巴細(xì)胞白血病中首次被鑒定出來(lái)，位于人類染色體9q34.3染色體上，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡等生命過(guò)程影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔7〕。研究顯示Notch1與Notch信號(hào)通路的其他蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織陽(yáng)性表達(dá)率高于正常腎組織，并與腫瘤的病理分級(jí)、大小等臨床參數(shù)密切相關(guān)，提示Notch1對(duì)于腎癌的診斷及預(yù)后具有顯著意義〔3〕。另外研究還表明Notch1在腎癌細(xì)胞Caki- 1及786- O中的表達(dá)量顯著高于正常腎小管上皮細(xì)胞HK- 2，且干擾Notch1表達(dá)能顯著降低Caki- 1細(xì)胞活力，但具體的作用機(jī)制尚未見報(bào)道〔4〕。張振等〔4〕研究結(jié)果所述，腎癌細(xì)胞中Notch1表達(dá)顯著高于HK- 2細(xì)胞，提示Notch1在腎癌組織中可能起著促癌作用。本研究結(jié)果表明腎癌細(xì)胞Caki- 1中Notch1表達(dá)下調(diào)后能顯著降低細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)，Transwll侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)siRNA Notch1能顯著抑制Caki- 1細(xì)胞侵襲能力，與siRNA Notch1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌〔8〕、乳腺癌〔9〕中的作用一致。

細(xì)胞的凋亡與增殖受凋亡相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控，其中最常見的是Bcl- 2家族。Bcl- 2是此家族中研究最廣泛的抑凋亡蛋白，能與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，進(jìn)而阻斷凋亡信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞存活。而Bax能自身形成二聚體，將凋亡信號(hào)傳遞給Caspase家族，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究已經(jīng)表明腎癌組織中Bcl- 2高表達(dá)，而Bax低表達(dá)甚至缺失〔10〕。另外，腫瘤細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵步驟之一是細(xì)胞外基質(zhì)降解，以便于腫瘤細(xì)胞快速進(jìn)出，而蛋白水解酶MMPs能夠降解大部分的細(xì)胞外基質(zhì)降解。其中MMP2具有雙重功能，既能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，還能夠誘導(dǎo)新生血管的生成，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遷移浸潤(rùn)。MMP9是分子量最大的MMPs，幾乎能夠降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分，且腎癌組織中MMP2及MMP9陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織〔11〕。有研究表明siRNA Notch1能顯著調(diào)控Bcl- 2家族蛋白表達(dá)，并下調(diào)MMPs表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲等生物學(xué)行為〔9〕。本研究結(jié)果表明siRNA Notch1能顯著下調(diào)Bcl- 2、MMP2及MMP9表達(dá)、上調(diào)Bax表達(dá)，提示siRNA Notch1能通過(guò)調(diào)控Bcl- 2家族蛋白及MMPs蛋白進(jìn)而抑制腎癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

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〔2017- 05- 21修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

付宏偉(1978- )，男，副主任醫(yī)師，主要從事脊柱、創(chuàng)傷研究。

尚春香(1976- )，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤化療研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3645- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.003

1 青海省第五人民醫(yī)院骨科