王玉超，李保全＊ ，胡東方，古金元，陳同煜，彭 濤，劉思當，肖一紅

(山東農(nóng)業(yè)大學，山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，山東 泰安 271000）

一例典型豬瘟病例的綜合診斷

王玉超，李保全＊ ，胡東方，古金元，陳同煜，彭 濤，劉思當，肖一紅

(山東農(nóng)業(yè)大學，山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，山東 泰安 271000）

2016年12月山東泰安某養(yǎng)殖戶的70頭育肥豬，部分豬出現(xiàn)了高燒不退、弓背喜臥、眼角分泌物增多、糞便干結、全身皮膚點狀出血等疑似豬瘟癥狀；病理剖檢可見全身皮膚、漿膜、腎、胃腸黏膜、肺等器官組織廣泛性滲出性出血；采集病豬病料，提取RNA，用豬瘟病毒基因特異性引物進行RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，病料呈豬瘟病毒核酸陽性，確診該病例為豬瘟病毒的急性感染。

豬瘟；剖檢；組織病理學；RT-PCR檢測

豬瘟又稱經(jīng)典豬瘟或古典豬瘟（Classical swine fever，CSF或hog cholera），是豬的一種高度傳染性疾病。在我國俗稱爛腸瘟。為世界動物衛(wèi)生組織所列的A類16種法定傳染病之一。豬是自然條件下對豬瘟病毒唯一易感的動物，傳播途徑主要通過直接接觸，或由于接觸污染的媒介物而發(fā)病。消化道、鼻腔黏膜和破損的皮膚均為感染途徑。一年四季都可發(fā)生，以春夏多雨季節(jié)多發(fā)。是目前威脅我國養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。自然感染的潛伏期常為3～6 d，也有延長至24 d的。根據(jù)病程長短、臨床癥狀和特征的不同，常將本病分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型等4種類型。最急性型較少見，病豬體溫升高，常無其他癥狀，1～2 d內(nèi)死亡。急性型最常見，體溫可上升到41 ℃以上，食欲減退或消失，可發(fā)生眼結膜炎并有膿性分泌物，鼻腔也常流出膿性黏液，間有嘔吐，有時排泄物中帶血液，甚至便血。初期耳根、腹部、股內(nèi)側的皮膚常有許多點狀出血或較大紅點。病程一般為1～2周，最后絕大多數(shù)死亡。亞急性型常見于本病流行地區(qū)，病程可延至2～3周；有的轉為慢性，常拖延1～2個月。表現(xiàn)黏膜蒼白，眼瞼有出血點。皮膚出現(xiàn)紫斑，病豬極度消瘦。死亡以仔豬為多，成年豬有的可以耐過。非典型病豬臨診癥狀不明顯，呈慢性，常見于“架子豬”。2016年12月，我國山東泰安某養(yǎng)殖戶所飼養(yǎng)的70頭育肥豬中先后出現(xiàn)了高燒不退、弓背喜臥、被毛粗亂、糞便干結、眼角分泌物增多，隨后腹部及四肢內(nèi)側出現(xiàn)出血斑點等疑似豬瘟癥狀，豬群沒有免疫豬瘟疫苗，經(jīng)病理剖檢和RTPCR診斷確診為豬瘟病毒急性感染。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

病例來自山東泰安某農(nóng)戶飼養(yǎng)的育肥豬群發(fā)病豬，病豬剖檢，采集淋巴結和腎臟等病變組織。病料處理：取病死豬扁桃體、淋巴結、脾臟等組織，剪碎，添加3倍滅菌生理鹽水，用勻漿機研磨制成懸液；反復凍融3次；9 000 r/ min離心3 min取上清液；分子生物學試劑：RNA提取試劑盒采用北京全式金Easy Pure Viral RNA/DNA Kit（批號：K10314）。PCR相關試劑為北京全式金相關產(chǎn)品。根據(jù)Genbank公布的序列設計豬瘟病毒的特異性引物，擴增目標片段大小約為600bp，其序列分別為：

F-TRACCAYGCAYATGWCAGAAGTACC

R-AGTCGACTTCCCTGGTTTCACTTG

1.2 實驗方法

1.2.1 臨床診斷與剖檢

觀察和記錄病豬臨床癥狀，剖檢死亡豬只，檢查大體病變，并采集具有典型病變的器官組織，-80 ℃冷凍備用。

1.2.2 總RNA 提取

按照全式金Easy Pure Viral RNA/ DNA Kit 說明書進行操作：加入20 μL Proteinase K于一個無菌的1.5 mL離心管中。在高心管中加入200 μL樣品。加入200 μLBB5 (包含5.6 μg CarrierRNA) ，渦旋混合15秒。56 ℃孵育15 min。加入250 μL無水乙醇(此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀) ，渦旋混合15 s，室溫放置5 min。將溶液和沉淀一起加入離心柱中，12 000 r/min離心1 min，棄掉流出液。加入500 μL WB5， 12 000 r/ min離心1 min，棄掉流出液。再加入500 μL WB5， 12 000 r/min離心1 min，棄掉流出液。室溫12 000 r/ min離心1 min，徹底去除殘留的乙醇，在室溫靜置數(shù)分鐘徹底晾干離心柱。將離心柱轉入一個新1.5 mL RNase-free離心管中， 并向離心柱中加20～50 μLRNase-free Water， 室溫靜置1 min。室溫12 000 r/min離心1 min，洗脫RNA。將RNA置于-80 ℃保存。

1.2.3 RT-PCR 反應及電泳

RT-PCR反應采取20 uL體系，反應條件為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

送檢病豬臨床主要表現(xiàn)為極度的精神沉郁，食欲廢絕，被毛粗亂，扎堆，發(fā)燒，體溫在40～41℃，腹部及四肢內(nèi)側皮膚可見出血點及出血斑。

2.2 剖檢病變

對死亡的豬只進行剖檢，腎臟表面密布針尖大出血點（圖1-A）；切面皮質部也見有點狀出血（圖1-B）；全身淋巴結腫大出血（圖1-C）；胃黏膜散在紐扣狀潰瘍灶（圖1-D）；病豬脾臟邊緣有明顯的出血性梗死灶（圖1-E）；大腦膜血管充血、出血（圖1-F）。

圖1 病豬剖檢病變

圖2 病豬的組織病理學變化

圖3 1%的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 病理組織學檢查

將采集的組織器官病料經(jīng)常規(guī)石蠟切片、HE染色后鏡檢，可見典型的病毒性腦炎病變，大腦血管周圍有大量的淋巴細胞和單核細胞浸潤形成“腦血管袖套現(xiàn)象”（圖2-A）；腎小球體積增大，充血、出血（圖2-B），腎小管上皮細胞變性、壞死，腎間質及腎髓質區(qū)充血、出血（圖2-C）；脾臟出血性梗死區(qū)充滿紅細胞（圖2-D）；淋巴結淋巴細胞崩解壞死，胞核濃縮深染、崩解破碎、溶解消失（圖2-E）。

2.4 RT-PCR 結果

提取病變淋巴結和腎臟組織總RNA，用參照已發(fā)表的豬瘟病毒序列設計合成的豬瘟特異性引物，進行豬瘟病毒核酸RT-PCR檢測，結果擴增了約600 bp的條帶，顯示病料呈豬瘟核酸陽性。

3 防治措施

1）隔離病豬。對保育舍發(fā)病豬只立即進行隔離，對發(fā)病嚴重、無治療價值的病豬立即撲殺，減少病豬的排毒；禁止病豬舍飼養(yǎng)人員隨意串舍，進出豬舍必須嚴格消毒。

2）嚴格消毒。發(fā)病豬舍立即進行帶豬消毒，使用碘制劑等對豬刺激小但是效果好的消毒劑噴霧消毒，同時對豬圈及飼喂器具進行徹底消毒。

3）緊急免疫。對保育舍健康豬及假定健康豬使用豬瘟弱毒疫苗實行緊急免疫，劑量為正常免疫的2～4倍，并且保證一豬一針頭，防止交叉感染，對發(fā)病豬單獨進行緊急免疫，劑量為正常免疫的8～10倍，隨時觀察豬群情況，出現(xiàn)病情加重的豬只立即撲殺，無害化處理，防止散毒。

4）加強飼養(yǎng)管理。立即停止豬場豬只的買賣，減少豬群應激反應，保持豬圈干燥，及時清理糞污，加強通風換氣，降低飼養(yǎng)密度。

5）調(diào)整免疫程序。對豬場種豬群（公豬、后備母豬及經(jīng)產(chǎn)母豬）立即進行1次豬瘟疫苗普免；仔豬首免日齡改為25日齡，并且55～60日齡進行第2次免疫。

2017-02-16）

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目“豬重要疫病免疫防控新技術研究”子課題“規(guī)?；i場科學合理的免疫程序的研究（2017YFD0500605）”支持；山東省“雙一流”獎補資助。

李保全