李春雨， 王 琪， 申 珅， 蘇瑋蓮， 李經(jīng)秀， 李國(guó)霞

(1天津醫(yī)科大學(xué)國(guó)際醫(yī)學(xué)院， 天津 300070； 2同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院腫瘤科， 上海 200433)

冬凌草甲素對(duì)人肝癌MHCC-97H細(xì)胞系侵襲和遷移的作用*

李春雨1△， 王 琪2， 申 珅1， 蘇瑋蓮1， 李經(jīng)秀1， 李國(guó)霞1

(1天津醫(yī)科大學(xué)國(guó)際醫(yī)學(xué)院， 天津 300070；2同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院腫瘤科， 上海 200433)

目的： 探討冬凌草甲素(oridonin)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及其機(jī)制。方法: 采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)人肝細(xì)胞癌MHCC-97H細(xì)胞，用不同濃度的冬凌草甲素處理肝癌細(xì)胞，采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力；Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的侵襲能力；黏附實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞的黏附能力；Western blot法檢測(cè)LIM激酶1(LIMK-1)、絲切蛋白(cofilin)和磷酸化cofilin(p-cofilin)蛋白水平的改變。結(jié)果: 冬凌草甲素可明顯降低肝癌細(xì)胞的體外侵襲、遷移及黏附能力(P<0.05)，且在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯的量效關(guān)系。冬凌草甲素干預(yù)處理細(xì)胞后，cofilin的蛋白水平無明顯變化，LIMK-1和p-cofilin的蛋白水平明顯下調(diào)。結(jié)論: 冬凌草甲素體外具有抑制肝癌MHCC-97H細(xì)胞侵襲和遷移的作用，其機(jī)制可能與調(diào)控LIMK-1/cofilin信號(hào)通路有關(guān)。

冬凌草甲素； 肝細(xì)胞癌； 細(xì)胞侵襲； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞黏附

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是發(fā)病率居全球第5位的惡性腫瘤，死亡率居全球第3位[1]。全世界一半以上的HCC發(fā)生在我國(guó)，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類健康[2]。侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致HCC患者不能長(zhǎng)期生存的主要原因[3]。因此，研發(fā)低毒、高效抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的一項(xiàng)迫切任務(wù)。冬凌草甲素(oridonin)是清熱解毒中藥冬凌草的主要有效成分，近年其抗腫瘤潛力受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[4-5]，研究報(bào)道冬凌草甲素對(duì)胃癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用[6]。但關(guān)于冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用研究較少，本文探討冬凌草甲素抗肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供參考。

材 料 和 方 法

1 材料、試劑及儀器

MHCC-97H細(xì)胞來源于美國(guó)模式細(xì)胞培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection，ATCC)，由本實(shí)驗(yàn)室保存；冬凌草甲素(純度≥98%)購(gòu)自Aladdin；MTT和二甲基亞砜購(gòu)自Sigma；Matrigel購(gòu)自BD；抗LIM激酶1(LIM kinase-1,LIMK-1)、絲切蛋白(cofilin)和磷酸化cofilin(phosphorylated cofilin，p-cofilin)抗體購(gòu)自Santa Cruz；全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、Western blot檢測(cè)試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；CO2培養(yǎng)箱(SANYO)；IX71熒光倒置顯微鏡(Olympus)；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)(G:BOX)。

2 方法

2.1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MHCC-97H細(xì)胞的遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC-97H細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×108/L，鋪于35 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)24 h，設(shè)冬凌草甲素低、中、高劑量及溶媒對(duì)照組，分組后加入不同濃度的冬凌草甲素(5、10、20 μmol/L)及溶媒進(jìn)行干預(yù)，24 h后用10 μL槍頭在培養(yǎng)皿底部中央劃出均勻劃痕，換液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于不同時(shí)間(0、3、6、9、12、24 h)在倒置顯微鏡下拍照，記錄劃痕寬度變化，分析MHCC-97H細(xì)胞遷移能力的變化。

2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MHCC-97H細(xì)胞的侵襲能力 Matrigel用PBS稀釋成1 g/L，以每孔50 μL鋪于Transwell小室聚碳酸酯膜，Transwell下室每孔加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，上室加入MHCC-97H細(xì)胞，細(xì)胞濃度為5×108/L，每孔50 μL；設(shè)冬凌草甲素低、中、高劑量及溶媒對(duì)照組，分組后加入不同濃度的冬凌草甲素(5、10、20 μmol/L)及溶媒對(duì)上室細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，37 ℃孵育24 h后，棄上室液體，棉簽擦去上膜未穿過膜的細(xì)胞，蘇木精染色，倒置顯微鏡觀察穿過膜的細(xì)胞，每張膜隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過微孔的細(xì)胞數(shù)，分析細(xì)胞侵襲能力的變化。

2.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MHCC-97H細(xì)胞的黏附能力 蓋玻片用10 mg/L fibronectin包被，4 ℃過夜，風(fēng)干后置于35 mm培養(yǎng)皿中；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC-97H細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×108/L，加入35 mm培養(yǎng)皿中每皿1.5 mL，設(shè)冬凌草甲素低、中、高劑量及溶媒對(duì)照組，加入不同濃度的冬凌草甲素(5、10、20 μmol/L)及溶媒進(jìn)行干預(yù)，37 ℃孵育24 h后，加入表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF； 10 μg/L，每皿200 μL)或無血清培養(yǎng)基后，分別在5、15、30 min時(shí)，加入冰PBS終止反應(yīng)，4%多聚甲醛固定，倒置顯微鏡觀察每個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞黏附數(shù)，計(jì)算5個(gè)隨機(jī)視野數(shù)目總和，分析細(xì)胞黏附能力的變化。

2.4 Western blot法檢測(cè)LIMK-1、p-cofilin及cofilin的蛋白水平 胰酶消化收集經(jīng)不同濃度的冬凌草甲素(5、10、20 μmol/L)干預(yù)48 h后的細(xì)胞，SDS細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加入鼠抗人LIMK-1、p-cofilin、cofilin及β-actin抗體，室溫孵育2 h，洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體，室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光，凝膠成像系統(tǒng)分析拍照并對(duì)凝膠條帶信號(hào)強(qiáng)度半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，并用單因素方差分析法(one-way ANOVA)進(jìn)行組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 冬凌草甲素對(duì)人肝癌MHCC-97H細(xì)胞體外遷移能力的影響

腫瘤細(xì)胞的遷移能力與侵襲轉(zhuǎn)移之間呈正相關(guān)。細(xì)胞劃痕24 h后與溶媒對(duì)照組比較，不同濃度的冬凌草甲素處理的MHCC-97H細(xì)胞組劃痕距離明顯大于溶媒對(duì)照組(P<0.05)，表明冬凌草甲素可抑制人肝癌MHCC-97H細(xì)胞的遷移，該作用呈量效關(guān)系，見圖1。

2 冬凌草甲素對(duì)人肝癌MHCC-97H細(xì)胞體外侵襲能力的影響

本研究中引入了Matrigel，旨在模擬癌細(xì)胞在體內(nèi)侵襲環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)，考察冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響[7]。經(jīng)不同濃度的冬凌草甲素處理的MHCC-97H細(xì)胞體外侵襲能力明顯下降(P<0.05)，冬凌草甲素顯示出顯著的抗癌細(xì)胞侵襲作用，該作用呈量效關(guān)系，見圖2。

3 冬凌草甲素對(duì)人肝癌MHCC-97H細(xì)胞體外黏附能力的影響

惡性腫瘤細(xì)胞在侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，與宿主組織成分發(fā)生多次黏附。黏附與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。經(jīng)不同濃度的冬凌草甲素處理的MHCC-97H細(xì)胞體外黏附能力明顯下降(P<0.05)，冬凌草甲素顯示出顯著的抗癌細(xì)胞黏附的作用，該作用呈量效關(guān)系，見圖3。

Figure 1.Treatment with oridonin inhibited the migration ability of hepatocellular carcinoma MHCC-97H cells. A: microscopic pictures of MHCC-97H cells at 0 h and 24 h after treatment were shown (scale bar=100 μm); B: the results of wound healing assay in the MHCC-97H cells with various treatments for 3, 6, 9, 12 and 24 h. The migration distance was measured by a software-based method. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖1 冬凌草甲素對(duì)人肝癌MHCC-97H細(xì)胞體外遷移能力的影響

Figure 2.Treatment with oridonin inhibited the invasion ability of hepatocellular carcinoma MHCC-97H cells. A: the microscopic images of MHCC-97H cells at 24 h after treatment were shown (scale bar=100 μm); B: the results of Transwell assay in the MHCC-97H cells with various treatments for 24 h were showed. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖2 冬凌草甲素對(duì)人肝癌MHCC-97H細(xì)胞體外侵襲能力的影響

4 冬凌草甲素對(duì)LIMK-1/cofilin信號(hào)通路的調(diào)控作用

LIMK-1/cofilin信號(hào)通路在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。經(jīng)不同濃度冬凌草甲素干預(yù)處理人肝癌MHCC-97H細(xì)胞后，cofilin蛋白表達(dá)水平無明顯變化，而LIMK-1和p-cofilin的蛋白水平明顯下調(diào)(P<0.05)，且具有量效關(guān)系，見圖4。

Figure 3.Treatment with oridonin inhibited the adhesion ability of hepatocellular carcinoma MHCC-97H cells. Adhesion assay results in MHCC-97H cells at 5, 15 and 30 min after treatment were shown. Cell numbers in five fields were counted for each coverslip under the microscope with ×200 magnification. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖3 冬凌草甲素對(duì)人肝癌MHCC-97H細(xì)胞體外黏附能力的影響

討 論

我國(guó)是一個(gè)HCC發(fā)病大國(guó)，且發(fā)病率和死亡率呈不斷上升趨勢(shì)，大多數(shù)HCC患者確診后的中位生存期是6～9個(gè)月，侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致HCC患者不能長(zhǎng)期生存的主要原因[8]。雖然目前臨床上可以對(duì)HCC轉(zhuǎn)移采取一些干預(yù)措施，如栓塞化療、術(shù)前經(jīng)皮穿刺肝動(dòng)脈栓塞及生物治療等，但整體效果仍十分有限[9]。侵襲和轉(zhuǎn)移已成為影響手術(shù)效果和病人生存期的瓶頸，控制轉(zhuǎn)移是決定患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。因此，研發(fā)低毒、高效抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物具有重要臨床意義。

冬凌草為清熱解毒類中藥，具有清熱解毒、消炎止痛、抗腫瘤等功效[10]。臨床應(yīng)用廣泛，特別是上呼吸道感染、慢性肝炎、關(guān)節(jié)風(fēng)濕痛、食管癌等惡性腫瘤等方面取得了顯著療效[11]。冬凌草甲素是冬凌草的主要有效成分，近年其抗腫瘤潛力受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的矚目。現(xiàn)代研究證實(shí)，冬凌草甲素對(duì)胃癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且低毒并對(duì)骨髓、肝、腎等器官無明顯損傷[12]。近年有研究提示冬凌草甲素能明顯降低骨肉瘤MG-63細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)能力，機(jī)制與降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，抑制血管生成有關(guān)[13]；冬凌草甲素能抑制肺癌NCI-H460、A549和PC-9細(xì)胞的侵襲，機(jī)制與調(diào)控MMPs表達(dá)、降解細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)[14]，提示冬凌草甲素防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移具有良好前景，值得進(jìn)一步深入研究。

Figure 4.The effects of oridonin on the protein levels of LIMK-1, cofilin and p-cofilin in the MHCC-97H cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖4 冬凌草甲素對(duì)LIMK-1/cofilin信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

本研究采不同濃度冬凌草甲素干預(yù)處理人肝癌MHCC-97H細(xì)胞，進(jìn)行體外侵襲、遷移及黏附能力的考察，結(jié)果顯示冬凌草甲素可明顯降低MHCC-97H細(xì)胞的體外侵襲、遷移及黏附能力，且在一定濃度范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。

細(xì)胞骨架由微絲、微管及中間纖維組成。其中微絲是由肌動(dòng)蛋白(actin)組成的螺旋狀纖維，是細(xì)胞骨架的主要組成部分，在維持細(xì)胞形態(tài)、有絲分裂、細(xì)胞遷移、細(xì)胞極性等方面起重要作用。Cofilin作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，與肌動(dòng)蛋白的功能和結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)關(guān)系密切?；罨腸ofilin通過解聚多聚體的纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)為單體的球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)，保證actin快速聚合與解聚。Cofilin的磷酸化和去磷酸化對(duì)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架活性以及肌動(dòng)蛋白相關(guān)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。LIMK-1是cofilin磷酸化的主要激活物，并可介導(dǎo)其它多種因子誘導(dǎo)cofilin磷酸化，在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度冬凌草甲素干預(yù)處理人肝癌MHCC-97H細(xì)胞后，cofilin蛋白表達(dá)水平無明顯變化，LIMK-1和p-cofilin蛋白水平明顯下調(diào)，且具有量效關(guān)系，與體外侵襲、遷移及黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示冬凌草甲素可能通過調(diào)控LIMK-1/cofilin信號(hào)通路抑制人肝癌MHCC-97H細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究為冬凌草甲素防治HCC侵襲轉(zhuǎn)移提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要的臨床價(jià)值。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of oridonin on invasion and migration of human hepatocellular carcinoma MHCC-97H cells

LI Chun-yu1, WANG Qi2, SHEN Shen1, SU Wei-lian1, LI Jing-xiu1, LI Guo-xia1

(1InternationalMedicalSchool,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China;2OncologyDepartment,ShanghaiPulmonaryHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200433,China.E-mail:lichunyu@tmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of oridonin on the invasion and migration of hepatocelluar carcinoma cells. METHODS: Human hepatocelluar carcinoma MHCC-97H cells were cultured and treated with 5, 10 or 20 μmol/L oridonin. The migration ability was measured by wound healing assay. The invasion ability was examined by Transwell invasion assay. The adhesion capabilities were evaluated by adhesion assay. The protein levels of LIM kinase-1 (LIMK-1), cofilin and phosphorylated cofilin (p-cofilin) were determined by Western blot. RESULTS: Oridonin inhibited the migration, invasion and adhesion abilities of MHCC-97H cells in a dose-dependent manner (P<0.05). After oridonin treatment, the expression of cofilin had no obvious change, but the protein levels of LIMK-1 and p-cofilin decreased significantly. CONCLUSION: Oridonin inhibits the invasion and migration of MHCC-97H cells. The mechanism may be related with the regulatory effect of oridonin on LIMK-1/cofilin signal transduction pathway.

Oridonin; Hepatocellular carcinoma; Cell invasion; Cell migration; Cell adhesion

1000- 4718(2017)08- 1423- 05

2017- 04- 26

2017- 07- 04

中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No. 2016M591398)；天津醫(yī)科大學(xué)科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No. 2015KYZQ13)；天津醫(yī)科大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(No. 2016YD07)

R329.21； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.013

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