賈亞楠， 李汝佳， 王可可， 雷 洪， 哈艷平， 王思思， 廖曉敏， 揭 偉， 申志華△

(廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1病理生理教研室， 2病理學(xué)系， 廣東 湛江 524023； 3廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理診斷與研究中心， 廣東 湛江 524001)

受體酪氨酸激酶Axl高表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌臨床進(jìn)展*

賈亞楠1， 李汝佳2, 3▲， 王可可2, 3， 雷 洪2,3， 哈艷平2, 3， 王思思2, 3， 廖曉敏2, 3， 揭 偉2, 3， 申志華1△

(廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1病理生理教研室，2病理學(xué)系， 廣東 湛江 524023；3廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理診斷與研究中心， 廣東 湛江 524001)

目的： 探討受體酪氨酸激酶anexelekto (Axl)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)中的表達(dá)及意義。方法: 采用免疫組化法檢測(cè)78例NPC和32例鼻咽黏膜慢性炎中Axl的表達(dá)，分析Axl蛋白表達(dá)與NPC患者臨床參數(shù)的相關(guān)性。常規(guī)培養(yǎng)NPC細(xì)胞，免疫熒光法檢測(cè)不同分化NPC細(xì)胞系CNE1、CNE2Z及C666-1中Axl的蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用Axl特異性抑制劑TP-0903處理CNE1和C666-1細(xì)胞，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布，qPCR檢測(cè)Axl和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)Axl及p-Axl蛋白的表達(dá)。結(jié)果: Axl蛋白定位于胞膜和胞質(zhì)。NPC中Axl高表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于鼻咽黏膜慢性炎(P<0.01)。Axl高表達(dá)與患者年齡、性別及M分期無(wú)關(guān)，與臨床分期、T分期和N分期呈正相關(guān)(P<0.05)。Axl在高分化CNE1細(xì)胞中低表達(dá)，在低分化CNE2Z細(xì)胞和未分化C666-1細(xì)胞中表達(dá)水平明顯增高。TP-0903呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制NPC細(xì)胞的活性，2 nmol/L TP-0903即具有顯著抑制效應(yīng)，能阻滯細(xì)胞周期于G0期，在降低Axl活性的同時(shí)也顯著抑制PCNA的表達(dá)。結(jié)論: Axl高表達(dá)可促進(jìn)NPC的臨床進(jìn)展；TP-0903顯著抑制NPC細(xì)胞的增殖，提示Axl可能在NPC靶向治療中具有一定的價(jià)值。

鼻咽癌； Anexelekto； TP-0903； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞周期

材 料 和 方 法

1 主要抗體及試劑

兔抗人Axl和p-Axl (Tyr698+Tyr702+Tyr703)的 I 抗(北京博奧森)；鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)及GAPDH的I 抗(Cell signaling)；HRP-、FITC-、PE-標(biāo)記的II抗(武漢三鷹)；免疫組化PV9000試劑盒及DAB試劑盒(北京中杉金橋)；TP-0903(純度>98%；MCE)；RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Roche)；qPCR引物由上海生工公司合成；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購(gòu)自Hyclone；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、RNaseA及DAPI染液(Sigma)；蛋白酶及磷酸酶抑制劑、RIPA緩沖液、BCA及CCK-8試劑盒(碧云天)；ECL發(fā)光劑及PVDF膜(Thermo Scientific)。

2 臨床標(biāo)本

78例NPC及32例鼻咽黏膜慢性炎(nasopharyngeal chronic inflammation，NPI)患者的石蠟包埋組織來(lái)自2014～2015年廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理中心保存的標(biāo)本。所有NPC患者均為首次就診，未接受任何治療，組織學(xué)類(lèi)型均為非角型未分化性癌，采用pTNM系統(tǒng)(AJCC/UICC 2002)進(jìn)行分類(lèi)。78例NPC中，男性42例，女性36例，中位年齡46歲。32例NPI為同期標(biāo)本，其中男性18例，女性14例，中位年齡44歲。臨床人體標(biāo)本的使用符合廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院有關(guān)倫理學(xué)規(guī)定(批件編號(hào)為PJ2014028)。

3 主要方法

3.1 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組化PV9000試劑盒檢測(cè)臨床人體標(biāo)本中Axl蛋白的表達(dá)。4 μm厚石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)熱抗原修復(fù)后滴加0.3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育20 min，PBS洗3 min、3次；滴加3% BSA-PBS封閉非特異性位點(diǎn)，室溫孵育30 min；滴加抗Axl抗體(1∶50稀釋)，4 °C冰箱孵育過(guò)夜，PBS洗2 min、3次；滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，PBS洗2 min、3次；滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔/鼠IgG，室溫孵育30 min，PBS洗2 min、3次；DAB顯色，蘇木精復(fù)染胞核；結(jié)果由2名獨(dú)立病理學(xué)專(zhuān)家判斷。顯微鏡下充分閱讀完整張切片，選擇切片上、中、下(左、右各3)共6個(gè)典型視野進(jìn)行結(jié)果判斷(Axl蛋白定位于胞膜和胞質(zhì))，按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，<10%為1分，≥10%但<50%為2分，≥50%為3分；按顯色程度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分?？偡?jǐn)?shù) = 染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分，總分?jǐn)?shù)≥4分定義為Axl高表達(dá)。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 高分化CNE1細(xì)胞、低分化CNE2Z細(xì)胞及未分化C666-1細(xì)胞由我室保存并參照既往方法進(jìn)行體外培養(yǎng)[11-14]。簡(jiǎn)言之，NPC細(xì)胞接種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，用含10% FBS、1×105U/L青霉素及0.1 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)，隔日換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

小偷又接連刺了她幾刀，刀刀見(jiàn)血。她倒下了，小偷奪門(mén)而逃。他傻了一般，站在那兒一動(dòng)不動(dòng)。老半天，他才好像突然清醒了。他跑過(guò)去抱起她，搖晃著她的身子喊，我不是人，為什么替我擋刀??！

3.3 免疫熒光染色 將CNE1細(xì)胞、CNE2Z細(xì)胞及C666-1細(xì)胞接種于無(wú)菌玻璃蓋片制備細(xì)胞爬片。取出細(xì)胞爬片，參考既往采用的間接免疫熒光法[15]檢測(cè)3種細(xì)胞中Axl蛋白的表達(dá)。Axl抗原定位以FITC-標(biāo)記的IgG顯示，DAPI復(fù)染胞核，激光共聚焦顯微鏡(TCS SP5 II；Leica)下觀(guān)察并拍照。

3.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 分別將Axl低表達(dá)CNE1細(xì)胞和Axl高表達(dá)的C666-1細(xì)胞接種于96孔板(每孔3 000個(gè))，貼壁過(guò)夜后通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TP-0903處理前后細(xì)胞的活力。細(xì)胞分為正常對(duì)照(control)組(正常細(xì)胞加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng))、TP-0903組[完全培養(yǎng)液中加TP-0903(DMSO溶解，終濃度為1、2、5 nmol/L)]和DMSO組[完全培養(yǎng)液中加DMSO(體積分?jǐn)?shù)<0.3%)]。于培養(yǎng)時(shí)點(diǎn)0 h、24 h、48 h用酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度(A)值，分析細(xì)胞活力。每組做6個(gè)復(fù)孔。

3.5 qPCR檢測(cè)細(xì)胞Axl及PCNA的mRNA表達(dá) CNE1細(xì)胞和C666-1細(xì)胞接種于6孔板，分為T(mén)P-0903(2 nmol/L)及DMSO組，48 h后收獲細(xì)胞并提取總RNA，取500 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR反應(yīng)引物序列如下：Axl(NM_021913.4)正義鏈為5’-GCT GCC TGT GTC CTC ATC TT-3’，反義鏈為5’-CAG CTC TTC ACT GAT GCC CA-3’；PCNA(NM_002592.2)正義鏈為5’-CTG ACA AAT GCT TGC TGA CC-3’，反義鏈為5’-CTA GCT GGT TTC GGC TTC AG-3’；β-actin正義鏈為5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，反義鏈為5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。采用LightCycler480 PCR儀(Roche)進(jìn)行PCR循環(huán)，總反應(yīng)體系20 μL，包括10 μL SYBR Green I PCR Master Mix, 0.4 μL 正義鏈引物 (10 μmol/L), 0.4 μL 反義鏈引物 (10 μmol/L), 2 μL cDNA 和 7.2 μL dH2O。PCR 擴(kuò)增條件為95 °C 5 min；95 °C 15 s、60 °C 60 s，50個(gè)循環(huán)。目標(biāo)基因的表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。

3.6 Western blot檢測(cè)Axl及p-Axl的水平 CNE1細(xì)胞和C666-1細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，分組同3.4，48 h后用含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的冷PBS洗滌細(xì)胞，RIPA緩沖液裂解收獲總蛋白，BCA法定量后取50 μg蛋白用于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)脫脂奶粉封閉后分別加入Ⅰ抗(Axl，1∶200; p-Axl，1∶200；GAPDH，1∶500)4 °C過(guò)夜孵育，TBST洗滌，羊抗兔HRP-標(biāo)記的IgG II抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光后獲得目的蛋白的條帶，膠片經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照。以GAPDH為內(nèi)參照，分析Axl及p-Axl的水平變化，以p-Axl/Axl代表Axl蛋白活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.7 細(xì)胞周期分析 CNE1細(xì)胞和C666-1細(xì)胞接種于6孔板，分組同3.4，48 h后上述各組細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化、PBS洗滌、75%冷乙醇過(guò)夜固定，離心棄去固定液，PBS 洗滌1 次后收集細(xì)胞于流式管，每管細(xì)胞樣品中加入1 mL PI染色液(含有100 mg/L RNase A 和5 mg/L PI)，緩慢并充分重懸細(xì)胞，避光室溫孵育30 min，隨后用流式細(xì)胞儀(BD FACS Canto II)在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下檢測(cè)紅色熒光和光散射情況，并用Flowjo 軟件分析細(xì)胞周期分布。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

臨床計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用GraphPad Prism 6軟件行單因素方差分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls 檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NPC臨床標(biāo)本中Axl蛋白的免疫組化檢測(cè)結(jié)果

典型的Axl高表達(dá)為腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜呈現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性信號(hào)。78例NPC中Axl高表達(dá)46例(59.0%)，顯著高于NPI組(12.5%)(P<0.01)。進(jìn)一步分層研究顯示，NPC中Axl高表達(dá)與患者年齡及性別無(wú)關(guān)，但與臨床分期、T分期和N分期均呈正相關(guān)(P<0.05)。本組NPC樣本M1期中Axl高表達(dá)為12例(70.6%)，但與M0期(55.7%)相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1、表1。

Figure 1.The expression of Axl protein in clinical samples. The method of mmunohistochemistry was used to detect Axl protein expression in the patients with NPC and NPI, Axl protein antigens were colorized by DAB(×200). A: the Axl protein in the NPI was negative expression; B: low level of Axl protein in NPC； C: high level of Axl protein in NPC； D: blank control.

圖1 免疫組化檢測(cè)臨床標(biāo)本中Axl蛋白的表達(dá)

表1 臨床標(biāo)本中Axl蛋白的表達(dá)及與患者臨床參數(shù)的相關(guān)性

NPC: nasopharyngeal carcinoma; NPI: nasopharyngeal chronic inflammation.

2 Axl表達(dá)與NPC細(xì)胞分化呈負(fù)相關(guān)

采用免疫熒光法檢測(cè)不同分化狀態(tài)NPC細(xì)胞中Axl的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，高分化CNE1細(xì)胞中Axl呈低水平表達(dá)，低分化CNE2Z細(xì)胞及未分化C666-1細(xì)胞中Axl表達(dá)水平較高，以C666-1細(xì)胞染色強(qiáng)度最強(qiáng)(圖2)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇CNE1和C666-1為T(mén)P-0903干預(yù)對(duì)象。

3 TP-0903抑制NPC細(xì)胞的增殖活性

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TP-0903呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制NPC細(xì)胞的活力，2 nmol/L TP-0903即具有顯著的細(xì)胞活力抑制作用(P<0.01)。qPCR結(jié)果顯示，2 nmol/L TP-0903能顯著抑制CNE1細(xì)胞和C666-1細(xì)胞中Axl和PCNA的mRNA水平(P<0.05)。進(jìn)一步的Western blot結(jié)果顯示，TP0903顯著降低了NPC細(xì)胞中Axl蛋白的活性，即p-Axl/Axl比值顯著降低，見(jiàn)圖3。

4 TP-0903對(duì)NPC細(xì)胞形態(tài)的影響

DMSO處理NPC細(xì)胞48 h，其形態(tài)學(xué)未見(jiàn)明顯異常改變。CNE1細(xì)胞以多角形為主，C666-1細(xì)胞以多角形及短梭形為主。而TP-0903處理48 h后，CNE1和C666-1細(xì)胞密度均明顯下降。CNE1和C666-1細(xì)胞中大部分殘存細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮?，偽足增多，?lèi)似上皮間葉樣轉(zhuǎn)化形態(tài)，部分細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，見(jiàn)圖4。

Figure 2.The method of immunofluorescent staining was used to observe Axl protein expression in well differentiated CNE1, poorly-differentiated CNE2Z and undifferentiated C666-1 cells. Axl protein antigens were colorized by FITC-coupled IgGs, and nuclei were stained by DAPI.

圖2 免疫熒光法檢測(cè)不同分化狀態(tài)NPC細(xì)胞中Axl蛋白的表達(dá)

5 TP-0903阻滯NPC細(xì)胞周期進(jìn)展

用Flowjo 軟件分析細(xì)胞周期變化，與DMSO組相比，無(wú)論是CNE1細(xì)胞還是C666-1細(xì)胞均表現(xiàn)為G1期比例升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，G2/M期與S 期細(xì)胞比例都明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05 )，見(jiàn)圖5。

Figure 3.TP-0903 suppressed Axl activity and inhibited the proliferation of NPC cells. A: well differentiated CNE1 cells and undifferentiated C666-1 cells were treated with TP-0903 (1, 2, 5 nmol/L) and DMSO for 0 h, 24 h and 48 h, and then CCK-8 assay was performed; B: PCR methods was used to examine the mRNA expression of Axl and PCNA in the CNE1 cells and C666-1 cells that treated with TP-0903 (2 nmol/L) and DMSO； C: Western blot was used to examine the total Axl and p-Axl expression in the CNE1 cells and C666-1 cells that treated with TP-0903 (2 nmol/L) and DMSO. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsDMSO group.

圖3 TP-0903抑制NPC細(xì)胞中的Axl活性及細(xì)胞增殖

Figure 4.The representative morphological images of the NPC cells exposed to TP-0903. Well differentiated CNE1 cells and undifferentiated C666-1 cells were planted onto 6-well plates at 5×104per well. After 1 night recovery, the media was changed into completed medium with TP-0903 (2 nmol/L) or DMSO (0.2%) for 48 h, then the cells were photographed under light field.

圖4 TP-0903處理NPC細(xì)胞后的形態(tài)變化

討 論

Axl為受體酪氨酸激酶TAM亞家族一員，已有的研究提示Axl高表達(dá)與多種人類(lèi)腫瘤的臨床進(jìn)展正相關(guān)，這在食管鱗癌[5]、結(jié)腸癌[16]、肺癌[6]、惡性胸膜間皮瘤[17]、腎癌[18]，乳腺癌[4]及骨肉瘤[2]等惡性腫瘤中均得到證實(shí)。Axl可能是腫瘤治療的一個(gè)潛在有價(jià)值的靶點(diǎn)，為此，針對(duì)Axl激酶抑制劑及單克隆抗體的研究正受到研究人員的重視[19-21]。

NPC是一種具有地域分布特征的鼻咽黏膜上皮源性惡性腫瘤，在我國(guó)廣東省多發(fā)，其病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[22]。為分析Axl在NPC中的表達(dá)情況，本研究首先對(duì)78例臨床NPC及32例NPI對(duì)照組織樣本中進(jìn)行Axl蛋白的免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示，NPC中Axl高表達(dá)陽(yáng)性率為59.0%，顯著高于對(duì)照組的12.5%。進(jìn)一步分層研究顯示，NPC中Axl高表達(dá)與患者年齡及性別無(wú)明顯相關(guān)，但與臨床分期、T分期和N分期均呈正相關(guān)關(guān)系。盡管本組NPC樣本M1分期中Axl高表達(dá)陽(yáng)性率為70.6%，但與M0組相比較，差異卻無(wú)顯著性意義，這可能與NPC總體樣本數(shù)不大有關(guān)?？傮w上，本組NPC中Axl高表達(dá)與腫瘤的臨床進(jìn)展存在正相關(guān)性。陳廣理等[9]通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了一組小樣本NPC及對(duì)照組織中Axl mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NPC中Axl mRNA豐度大于對(duì)照組，提示Axl表達(dá)升高與NPC具有關(guān)聯(lián)性。Jiang等[10]亦檢測(cè)了一組NPC及對(duì)照組織中Axl mRNA及蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Axl高表達(dá)與NPC臨床進(jìn)展及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān)。本研究結(jié)論與上述兩組的報(bào)道相似，預(yù)示了靶向干預(yù)Axl在NPC治療中可能具有一定的價(jià)值。

Figure 5.The cell cycle distribution of the NPC cells after TP-0903 treatment. Well differentiated CNE1 cells and undifferentiated C666-1 cells were treated with TP-0903 (2 nmol/L) and DMSO (0.2%) for 48 h, and then the cells were harvested and subjected to cell cycle analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsDMSO.

圖5 TP-0903處理NPC細(xì)胞后細(xì)胞周期的變化

為探討靶向干預(yù)Axl對(duì)NPC細(xì)胞的影響，本研究進(jìn)一步體外對(duì)不同分化狀態(tài)NPC細(xì)胞系進(jìn)行Axl蛋白表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Axl蛋白表達(dá)與NPC分化狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)，即高分化CNE1細(xì)胞中低水平表達(dá)，而低分化CNE2Z細(xì)胞及未分化C666-1細(xì)胞中表達(dá)明顯升高。隨后，采用Axl特異性抑制劑TP-0903分別處理CNE1細(xì)胞和C666-1細(xì)胞，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)TP-0903以濃度和時(shí)間依賴(lài)方式顯著抑制NPC細(xì)胞的活力，提示基于TP-0903靶向抑制Axl對(duì)NPC增殖具有明顯的效果。當(dāng)前，針對(duì)Axl小分子抑制劑的研究正受到重視[7,19, 21]，一些抑制劑如4SC-203、S49072已進(jìn)入I期臨床實(shí)驗(yàn)，而一些抑制劑如R428、MGCD-265、gilteritinib等進(jìn)入II期臨床實(shí)驗(yàn)。TP-0903是一種新的嘧啶衍生物，目前僅在白血病治療中有1例臨床前研究的報(bào)道[8]，但其效果值得肯定。本研究首次將TP-0903應(yīng)用在NPC上。本研究發(fā)現(xiàn)，2 nmol/L TP-0903處理NPC細(xì)胞48 h，殘留的細(xì)胞即出現(xiàn)上皮間葉轉(zhuǎn)化樣形態(tài)改變，部分細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)空泡甚至出現(xiàn)細(xì)胞溶解，當(dāng)濃度大于10 nmol/L時(shí)NPC細(xì)胞全部溶解而死亡，初步顯示NPC中的IC50將顯著小于其推薦值(27 nmol/L)。至于TP-0903處理誘導(dǎo)NPC細(xì)胞出現(xiàn)上皮間葉樣轉(zhuǎn)化的機(jī)制及意義如何，有待于后續(xù)研究。我們注意到在2 nmol/L時(shí)，TP-0903不僅影響NPC中Axl mRNA豐度，也影響其蛋白的表達(dá)和活性，同時(shí)也顯著降低了PCNA的表達(dá)，這與CCK-8的結(jié)果是一致的。進(jìn)一步的細(xì)胞周期分布提示經(jīng)TP-0903處理后，表現(xiàn)為G2/M和S期比例下降，G1期比例升高，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制。本研究發(fā)現(xiàn)TP-0903不僅影響Axl的表達(dá)，也可抑制其蛋白活性(p-Axl的表達(dá))，這一點(diǎn)與既往的報(bào)道不一致[23]，其確切機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

關(guān)于Axl在腫瘤組織中激活的機(jī)制非常復(fù)雜，吳彥君等[24]總結(jié)為5種機(jī)制，其中通過(guò)配體結(jié)合如GAS6介導(dǎo)受體同源二聚化是其經(jīng)典活化機(jī)制。Axl 受體二聚體進(jìn)行自磷酸化，使其受體細(xì)胞內(nèi)激酶域酪氨酸殘基Y779、Y821 和Y866 磷酸化，繼而激活下游信號(hào)。NPC細(xì)胞中Axl如何激活尚不清楚。本研究納入3個(gè)NPC細(xì)胞系，C666-1細(xì)胞中Axl表達(dá)最高，考慮到C666-1細(xì)胞中EB病毒感染呈陽(yáng)性，后續(xù)將可能探討EB病毒的感染與Axl的激活存在關(guān)聯(lián)性。

總之，本研究結(jié)果提示Axl高表達(dá)促進(jìn)NPC的臨床進(jìn)展；TP-0903抑制Axl并明顯拮抗NPC細(xì)胞增殖，提示基于Axl靶點(diǎn)治療NPC具有潛在的臨床價(jià)值。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

High expression of Axl promotes clinical progression of nasopharyngeal carcinoma

JIA Ya-nan1, LI Ru-jia2, 3, WANG Ke-ke2, 3, LEI Hong2, 3, HA Yan-ping2, 3,Wang Si-si2, 3, LIAO Xiao-min2, 3, JIE Wei2, 3， SHEN Zhi-hua1

(1DepartmentofPathophysiology，2DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China;3PathologicalDiagnosisandResearchCentre,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China.E-mail:szh75@126.com)

AIM: To explore the expression and significance of receptor tyrosine kinase anexelekto (Axl) in nasopharyngeal carcinoma (NPC). METHODS: Immunohistochemistry was used to detect the Axl protein expression of 78 patients with NPC and 32 patients with nasopharyngeal chronic inflammation (NPI). The correlations between the Axl protein levels and the clinical parameters of NPC patients were analyzed. NPC cells were culturedinvitro, and the expression of Axl in well differentiated CNE1 cells, poorly-differentiated CNE2Z cells and undifferentiated C666-1 cells was detected by immunofluorescence staining. After treatment of the CNE1and C666-1 cells with Axl specific inhibitor TP-0903, CCK-8 assay was used to detect cell viability, flow cytometry was adopted to analyze the cell cycle distribution, qPCR was used to examine the mRNA levels of Axl and proliferating cell nuclear antigen (PCNA), and Western blot was used to examine the protein expression of Axl and p-Axl. RESULTS: Axl protein was localized in the cell membrane and cytoplasm. The rate of high expression of Axl in NPC was significantly higher than that in NPI (P<0.01). High Axl expression showed no correlations with NPC patients’ age, gender and M stage, while positively correlated with the clinical stage, T stage and N stage (P<0.05). Axl protein showed a low level in the CNE1 cells, but showed a high level in CNE2Z and C666-1 cells. TP-0903 inhibited cell viability in concentration and time dependent manners. TP-0903 at 2 nmol/L showed significant inhibitory effects, as evidenced by arresting the cell cycle at G0phase and reducing Axl activity and PCNA expression. CONCLUSION: High expression of Axl promotes the clinical progress of NPC.TP-0903 significantly inhibits the viability of NPC cells, suggesting that Axl may be a valuable target in the NPC treatment.

Nasopharyngeal carcinoma; Anexelekto; TP-0903; Cell proliferation; Cell cycle

1000- 4718(2017)08- 1386- 07

2016- 12- 01

2017- 04- 19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81402415)；廣東醫(yī)科大學(xué)科研基金(No. Z2013004； No. M2013032)；湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2013B01077)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.007

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