孫 杰， 付立芳

(1山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中醫(yī)學(xué)教研室， 2臨沂市中醫(yī)醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 山東 臨沂 276000)

Dickkopf-1沉默通過下調(diào)β-catenin水平抑制胃癌細(xì)胞侵襲及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化*

孫 杰1△， 付立芳2

(1山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中醫(yī)學(xué)教研室，2臨沂市中醫(yī)醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 山東 臨沂 276000)

目的： 探討分泌蛋白Dickkopf-1 (DKK1)在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響。方法: 以real-time PCR和Western blot法檢測(cè)DKK1在人胃黏膜細(xì)胞(GES-1)和胃癌細(xì)胞(MKN-45和SGC-7901)中的表達(dá)水平；以RNA干擾法沉默DKK1，沉默效果以real-time PCR、Western blot及ELISA法驗(yàn)證；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，以絲裂霉素C抑制細(xì)胞增殖；real-time PCR及Western blot法檢測(cè)細(xì)胞E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)及β-連環(huán)蛋白(β-catenin)水平。結(jié)果: DKK1在MKN-45和SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于GES-1細(xì)胞，表明DKK1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)顯著升高；DKK1在MKN-45和SGC-7901細(xì)胞中被成功沉默后，細(xì)胞侵襲能力顯著下降，并具有時(shí)間依賴性，同時(shí)伴隨E-cadherin表達(dá)增高及N-cadhe-rin和vimentin表達(dá)下降，表明DKK1沉默能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)；經(jīng)外源性重組DKK1(rDKK1)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，進(jìn)一步證實(shí)DKK1具有促胃癌細(xì)胞侵襲的作用，并可促進(jìn)EMT進(jìn)程；DKK1沉默通過下調(diào)β-catenin水平來實(shí)現(xiàn)其對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲及EMT的抑制作用。結(jié)論: DKK1在人胃癌細(xì)胞中表達(dá)顯著增高，且DKK1沉默能夠通過下調(diào)β-catenin水平抑制胃癌細(xì)胞侵襲及EMT過程。

Dickkopf-1； 胃癌； 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化； 細(xì)胞侵襲； β-連環(huán)蛋白

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1-2]?；谖赴┰缙诘驮\斷率的特點(diǎn)，越來越多的研究致力于尋找胃癌特異性血清腫瘤標(biāo)志分子[3]。Dickkopf (DKK)是一組分泌型糖蛋白，通常由225～350個(gè)氨基酸殘基組成，能夠負(fù)性調(diào)控Wnt信號(hào)通路下游基因活性從而發(fā)揮促癌或抑癌作用[4-5]。目前，DKK1是DKK家族中被研究最多的蛋白，其被報(bào)道廣泛參與調(diào)控多種癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。研究表明，DKK1在肝癌、肺癌、食管癌及膽管癌中發(fā)揮促侵襲作用，但在口腔鱗狀細(xì)胞癌及黑色素瘤中作用則相反[4, 6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，DKK1在胃癌患者血清及組織中顯著高表達(dá)[7-8]，但其對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的影響尚不明確。本研究旨在探討人胃癌細(xì)胞中DKK1的表達(dá)，及其對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的影響及作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和主要試劑

人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1購(gòu)自ATCC；人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MKN-45購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液、BCA試劑盒、PVDF膜、胰蛋白酶、LipofectamineTM2000、絲裂霉素C(mi-tomycin C，MMC)及結(jié)晶紫均購(gòu)自Sigma；Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen；ECL顯色試劑購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司；Transwell小室購(gòu)自Corning；DKK1-siRNA及相應(yīng)scramble-siRNA、β-catenin-siRNA及相應(yīng)scramble-siRNA購(gòu)自Thermo；重組人DKK1蛋白(recombinant DKK1，rDKK1)及其ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) GES-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清、1.5×105U/L青霉素及50 mg/L鏈霉素[9]。MKN-45細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素[10]。SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素[11-12]。所有細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2相對(duì)飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞總RNA以Trizol試劑盒進(jìn)行提取，操作按照說明書進(jìn)行。以反轉(zhuǎn)錄試劑將5 μg RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，β-actin為內(nèi)參照。擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s， 56 ℃ 45 s， 72 ℃ 50 s，循環(huán)40次[13]。反應(yīng)結(jié)果以ABI 7500系統(tǒng)檢測(cè)，并采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，詳細(xì)序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 以RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。蛋白濃度以BCA法測(cè)定。取40 μg總蛋白并以10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)分離，將分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜[14]。PVDF膜經(jīng)PBS清洗后，與目的蛋白 I 抗于4 ℃孵育過夜，清洗后，繼續(xù)與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的IgG II 抗孵育1.5 h，ECL顯影液顯影，β-actin為內(nèi)參照[15]?？贵w為兔抗人DKK1多克隆抗體(稀釋度：1∶2 000)、兔抗人E-鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體(稀釋度：1∶2 500)、兔抗人N-鈣黏蛋白(N-cadherin)多克隆抗體(稀釋度：1∶1 500)、兔抗人波形蛋白(vimentin)單克隆抗體(稀釋度：1∶2 000)、兔抗人β-連環(huán)蛋白(β-catenin)單克隆抗體(稀釋度：1∶1 500)、兔抗人β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)多克隆抗體(稀釋度：1∶2 500)，及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG II 抗(稀釋度：1∶4 000)。所有抗體均購(gòu)自Abcam。利用Gel-Pro 4.0軟件對(duì)Western blot的條帶進(jìn)行量化分析。

2.4 RNA干擾法沉默DKK1表達(dá) 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，并制備成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞以每孔1×106個(gè)接種于6孔板后，置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)80%。2 nmol/L DKK1-siRNA和scramble-siRNA分別以LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至上述細(xì)胞中，并設(shè)置相應(yīng)空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48 h后，分別以real-time PCR法和Western blot法驗(yàn)證DKK1基因沉默效果，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，real-time PCR法和Western blot法檢測(cè)目的基因及蛋白水平。

2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，分別重懸于無血清培養(yǎng)基中。選取24孔板(濾膜直徑6.5 mm, 孔徑8.0 μm)的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。小室上層以1 g/L Matrigel預(yù)包被后，接種5×104個(gè)細(xì)胞(約800 μL)，加入MMC抑制細(xì)胞增殖。下層加入600 μL DMEM或RPMI-1640全培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)24、48及72 h后，以棉拭子擦掉上層未侵襲細(xì)胞，侵襲細(xì)胞以0.1% 結(jié)晶紫染色30 min，PBS漂洗3次，于倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞[16-17]。

為了驗(yàn)證DKK1對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用，將終濃度為0、20、40和60 μg/L 的人rDKK1蛋白依次分別加入內(nèi)含MKN-45細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞的Transwell小室或6孔板中。rDKK1處理48 h后，檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。

β-catenin-siRNA及其scramble-siRNA分別以LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至2種胃癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后驗(yàn)證β-catenin基因沉默效果。收集細(xì)胞進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，加入終濃度為60 μg/L的人rDKK1蛋白處理48 h，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)對(duì)照組，并檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DKK1在人胃癌細(xì)胞中表達(dá)顯著升高

Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DKK1在低分化胃癌細(xì)胞MKN-45和中分化胃癌細(xì)胞SGC-7901中的相對(duì)mRNA水平均顯著高于GES-1細(xì)胞(P<0.05)。Western blot結(jié)果表明，DKK1在MKN-45細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞中的相對(duì)蛋白水平同樣均顯著高于GES-1細(xì)胞(P<0.05)。此外，DKK1在SGC-7901細(xì)胞中的mRNA和蛋白水平明顯高于MKN-45細(xì)胞 (P<0.05)。本部分結(jié)果證實(shí)，DKK1在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，并隨癌細(xì)胞分化而加強(qiáng)，見圖1。

Figure 1.The mRNA (A) and protein (B) levels of DKK1 in human gastric carcinoma cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsGES-1;#P<0.05vsMKN-45.

圖1 DKK1在人胃癌細(xì)胞中的水平

2DKK1基因沉默效果的驗(yàn)證

驗(yàn)證結(jié)果表明，DKK1的mRNA水平在DKK1-siRNA組中顯著低于scramble-siRNA組和空白對(duì)照組，類似結(jié)果也體現(xiàn)于其蛋白表達(dá)水平上(P<0.05)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以ELISA試劑盒檢測(cè)DKK1蛋白水平，結(jié)果與DKK1 mRNA及 Western blot結(jié)果一致。本部分結(jié)果表明，2種胃癌細(xì)胞中DKK1基因沉默效果良好，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，見圖2。

3DKK1基因沉默抑制胃癌細(xì)胞侵襲

2種DKK1沉默細(xì)胞(DKK1-siRNA組)的侵襲力均顯著低于DKK1未沉默細(xì)胞(scramble-siRNA組和空白對(duì)照組)，且具有時(shí)間依賴性。72 h時(shí)，不同組MKN-45細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞侵襲的原始圖片見圖3。本部分結(jié)果顯示，DKK1水平下調(diào)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的侵襲，反映出其具有促胃癌細(xì)胞侵襲的作用。

Figure 2.The expression of DKK1 at mRNA and protein levels. A: the relative mRNA level of DKK1 in the cells; B: the relative protein level of DKK1 in the cells; C: the protein concentration of DKK1 in the cell supernatant. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsscramble-siRNA group.

圖2 DKK1 mRNA及蛋白水平

4DKK1基因沉默調(diào)節(jié)細(xì)胞EMT過程

Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DKK1沉默后，2種胃癌細(xì)胞中E-cadherin的mRNA水平顯著升高，N-cadherin及vimentin的mRNA水平顯著下降。類似變化也出現(xiàn)在相應(yīng)分子蛋白表達(dá)水平上。本部分結(jié)果證實(shí)，DKK1基因沉默能夠顯著抑制細(xì)胞的EMT過程，見圖4。

5 外源性DKK1促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲及EMT過程

MKN-45和SGC-7901細(xì)胞侵襲力隨rDKK1劑量增加而增強(qiáng)；同時(shí)，伴隨劑量依賴性的E-cadherin的mRNA水平下降，及N-cadherin和vimentin的mRNA水平上升。此外，SGC-7901細(xì)胞在40 μg/L rDKK1和60 μg/L rDKK1作用下侵襲力顯著強(qiáng)于MKN-45細(xì)胞(P<0.05)。以不同濃度rDKK1處理兩種細(xì)胞48 h后，MKN-45細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞侵襲的圖片見圖5。本部分結(jié)果驗(yàn)證，DKK1具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲及EMT轉(zhuǎn)化的作用。

6DKK1沉默通過降低β-catenin水平發(fā)揮抑制侵襲作用

為了探討DKK1沉默是否通過下調(diào)β-catenin水平影響了胃癌細(xì)胞的侵襲力，本研究繼續(xù)檢測(cè)了MKN-45細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞中β-catenin水平。DKK1沉默后，β-catenin的mRNA及蛋白水平在2種細(xì)胞中均顯著下調(diào)(P<0.05)，表明DKK1沉默抑制了胃癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)。

另外，β-catenin沉默后MKN-45細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞的侵襲力顯著低于未沉默組(P<0.05)；同時(shí)在60 μg/L rDKK1作用下細(xì)胞侵襲力在β-catenin沉默的細(xì)胞中顯著低于β-catenin未沉默的細(xì)胞(P<0.05)。類似結(jié)果也體現(xiàn)于EMT過程中。以上結(jié)果表明，DKK1沉默是通過下調(diào)β-catenin水平抑制了胃癌細(xì)胞的侵襲及EMT過程，見圖6。

Figure 3.The cell invasion ability detected by Transwell assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsscramber-siRNA group.

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲力

Figure 4.The changes of the mRNA (A) and protein (B) levels of EMT-related molecules. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsscramble-siRNA group.

圖4 EMT相關(guān)分子mRNA及蛋白水平

Figure 5.The influences of human rDKK1 on the invasion (A) and EMT (B) of gastric carcinoma cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 μg/L rDKK1；#P<0.05，##P<0.01vsSGC-7901.

圖5 人重組DKK1對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲及EMT轉(zhuǎn)化的影響

討 論

DKK1是一種有力的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑，其一方面能在細(xì)胞外與Wnt競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LRP5/LRP6輔助受體抑制Wnt信號(hào)[6]，另一方面能與LRP5/LRP6、Kremen 1/2聚合為三聚體，通過快速誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞以減少胞膜上的LRP5/LRP而阻斷Wnt信號(hào)向胞內(nèi)傳遞[7]。Wnt信號(hào)通路在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，因此DKK1與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，DKK1 在多數(shù)癌癥如肝癌、肺癌及食管癌中發(fā)揮促侵襲作用，但在口腔鱗狀細(xì)胞癌及黑色素瘤中則發(fā)揮相反作用[4]，然而其在胃癌侵襲中的作用尚不明確。

Lee等[18]評(píng)估了153例胃癌患者和173例健康志愿者血清中DKK1的濃度，發(fā)現(xiàn)其在胃癌患者血清中的濃度顯著高于健康志愿者。本研究表明，胃癌細(xì)胞中DKK1表達(dá)水平顯著高于胃正常細(xì)胞，與其在血清中的檢測(cè)結(jié)果一致，這也預(yù)示著DKK1可能與胃癌的發(fā)展進(jìn)程有一定的相關(guān)性。深入研究發(fā)現(xiàn)，DKK1沉默顯著抑制了胃癌細(xì)胞侵襲及EMT過程，表明DKK1能夠促進(jìn)胃癌的侵襲，在胃癌的發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用。

在腫瘤侵襲過程中，EMT是除腫瘤轉(zhuǎn)移基因、血管生成及細(xì)胞外基質(zhì)降解外的另一重要影響因素[19]。該過程新形成的細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和轉(zhuǎn)移特性，能夠誘使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲[20]。本文研究發(fā)現(xiàn)， 外源性DKK1促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲的作用與EMT過程密切相關(guān)。Yao[21]等研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)中，DKK1促進(jìn)的血管生成擬態(tài)也與EMT過程有緊密關(guān)聯(lián)。

β-catenin是由位于染色體3p21-22的CTNNB1基因編碼的，具有介導(dǎo)細(xì)胞間黏附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多重功能的重要分子[22]。β-catenin在多種癌癥細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，例如其能削弱骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力[23]，加強(qiáng)肺癌細(xì)胞的增殖能力等[24]。報(bào)道指出，β-catenin基因沉默的胃癌細(xì)胞表現(xiàn)出較弱的侵襲能力[25]。研究發(fā)現(xiàn)，DKK1和β-catenin在胃癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)[26-27]，但兩者在胃癌中是否存在調(diào)控關(guān)系尚不明確。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，β-catenin在DKK1沉默的胃癌細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，明確了DKK1對(duì)β-catenin的正調(diào)控作用。應(yīng)用β-catenin-siRNA或/和rDKK1聯(lián)合處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，rDKK1誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲力的增強(qiáng)并未在β-catenin沉默的細(xì)胞中檢測(cè)到，表明DKK1是通過調(diào)控β-catenin表達(dá)影響了胃癌細(xì)胞的侵襲力。此外，本研究也檢測(cè)到β-catenin沉默胃癌細(xì)胞侵襲力的整體下降，與潘安萍[25]的研究結(jié)果一致。

Figure 6.Influences of human rDKK1 on the invasion and EMT of β-catenin-silencing gastric carcinoma cells. A: the mRNA and protein levels of β-catenin inDKK1-silencing cells; B: the protein level of β-catenin in β-catenin-silencing cells; C: the effects of rDKK1 (60 μg/L) on invasive ability of MKN-45 and SGC-7901 cells; D: the effects of rDKK1 on the mRNA levels of EMT-related genes in the MKN-45 cells; E: the effects of rDKK1 on the mRNA levels of EMT-related genes in the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsscramble-siRNA;△P<0.05vsscramble-siRNA+rDKK1.

圖6 人重組DKK1對(duì)β-catenin沉默胃癌細(xì)胞侵襲及EMT的影響

E-cadherin與EMT過程密切相關(guān)，是上皮細(xì)胞黏連的主要分子，其通過α-catenin、β-catenin及γ-catenin組成的復(fù)合物錨定在細(xì)胞骨架；當(dāng)β-catenin積聚轉(zhuǎn)入核內(nèi)后，E-cadherin會(huì)失去錨定而活動(dòng)到其它區(qū)域，使細(xì)胞間失去相互黏附而移動(dòng)力增強(qiáng)，發(fā)生侵襲及EMT過程[28]。因此，rDKK1對(duì)胃癌細(xì)胞的促侵襲作用，除了與rDKK1對(duì)E-cadherin表達(dá)的負(fù)調(diào)控有關(guān)，還與DKK1對(duì)β-catenin表達(dá)的正調(diào)控有關(guān)，可能表現(xiàn)為DKK1使β-catenin水平增加并積聚而入核，導(dǎo)致E-cadherin失去錨定復(fù)合物，致使細(xì)胞間黏附減弱，加速了細(xì)胞侵襲及EMT過程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DKK1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)顯著上升。DKK1沉默能夠通過下調(diào)β-catenin表達(dá)水平來抑制胃癌細(xì)胞侵襲及EMT過程。

[1] 鄒文斌， 李兆申. 中國(guó)胃癌發(fā)病率及死亡率研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2014, 34(4):408-415.

[2] 陳淑芬， 侯婧瑛， 吳淑云， 等. IFN-γ上調(diào)人胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(11):1952-1956.

[3] 王 洋， 王 歡， 莫佳美， 等. 血清腫瘤標(biāo)志物在胃癌診斷中的價(jià)值[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2014, 22(4):883-885.

[4] 黃曉紅. DKK-1與腫瘤的研究進(jìn)展[J]. 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 9(3):366-369.

[5] 曾慶哲， 張浩清， 楊瑞青. Dickkopf-1在肺癌相關(guān)惡性胸腔積液中的表達(dá)和臨床意義[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2016, 13(8):108-111.

[6] 彭裕輝， 許鎰洧， 謝劍君. 血清DKK1在腫瘤臨床應(yīng)用的價(jià)值[J]. 癌變·畸變·突變, 2014, 26(1):79-81.

[7] 蔡靚羽， 尹衛(wèi)娟， 徐敏逸. 分泌蛋白 DKK1 (Dickkopf-1)在胃癌患者血清及組織中的表達(dá)及其意義[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24(6):1-8.

[8] 馬 剛， 戴偉杰， 嚴(yán) 偉， 等. Dickkopf-1在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 中華消化雜志, 2015, 35(12):846-848.

[9] 蔣 虹， 楊生璽， 張曉巖， 等. 不同程度低氧對(duì)體外培養(yǎng)人胃粘膜上皮細(xì)胞株[J]. 青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 33(3):175-178.

[10]桂牧微， 魏品康， 陸 燁， 等. 消痰散結(jié)方藥物血清對(duì)人胃癌 MKN-45 細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J]. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)， 2010, 8(3):250-255.

[11]李玉英， 趙淑娟， 白崇智， 等. 苦蕎異槲皮苷對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖及凋亡的影響[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(3):193-197.

[12]張偉麗， 陳 超.HOXB7基因沉默對(duì)人胃癌細(xì)胞活力、遷移和侵襲的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(10):1824-1829.

[13]曾 亞， 劉 瑋， 王 賽. 幽門螺桿菌誘導(dǎo)人胃黏膜細(xì)胞 GES-1過表達(dá) COX-2 的研究[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2012, 19(6):838-840.

[14]蘇 婷， 賴銘裕， 農(nóng)云翠. 慢病毒介導(dǎo)的GOLPH3基因沉默對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2014, 30(5):815-819.

[15]徐群芳， 談文龍， 趙 銳. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境改變促進(jìn)胃癌 NCI-N87 細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[J]. 國(guó)際藥學(xué)研究雜志, 2014, 41(6):686-692.

[16]王顯艷， 高 峰， 趙春明， 等. miR-140在人胃癌組織中的表達(dá)及對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞功能的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(4):651-657.

[17]劉 駿， 周建獎(jiǎng)， 趙 艷， 等. 胃泌素促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(4):730-733.

[18]Lee HS, Lee HE, Park DJ, et al. Clinical significance of serum and tissue Dickkopf-1 levels in patients with gastric cancer[J]. Clin Chim Acta, 2012, 413(21-22):1753-1760.

[19]伊日貴. 腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中華實(shí)用診斷與治療雜志, 2014, 28(10):937-939.

[20]馮和林， 鄭麗華. 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用癌癥雜志, 2013, 28(1):105-110.

[21]Yao L, Zhang D, Zhao X, et al. Dickkopf-1-promoted vasculogenic mimicry in non-small cell lung cancer is associated with EMT and development of a cancer stem-like cell phenotype[J]. J Cell Mol Med, 2016, 20(9):1673-1685.

[22]韓 濤， 丁 勁， 王紅陽. β-catenin 信號(hào)分子的生物學(xué)功能及其在肝癌中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2011, 31(9):96-102.

[23]羅光金， 康 權(quán)， 畢 楊， 等. β-catenin 過表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞 TE85 遷移、侵襲及凋亡的影響[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2014, 34(11):1491-1496.

[24]劉樹立， 徐洪濤， 楊連赫， 等. Axin過表達(dá)下調(diào)β-catenin和TCF-4表達(dá)并抑制肺癌BE1細(xì)胞的增殖和侵襲[J]. 中國(guó)肺癌雜志, 2009, 12(4):277-282.

[25]潘安萍. 沉默β-catenin表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[D]. 南昌: 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 2014.

[26]路三軍， 楊學(xué)麗， 桂洪武， 等. 近端胃腺癌中DKK-1和β-catenin的表達(dá)及其相關(guān)性[J]. 中國(guó)腫瘤臨床, 2013, 40(17):1038-1041.

[27]楊學(xué)麗， 路三軍， 魏 娉， 等. GSK-3β、DKK-1、β-catenin 在近端胃癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2015, 24(24):2646-2658.

[28]王衛(wèi)杰， 周家華， 張麗華. 胃癌中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化路徑及相關(guān)因子的研究進(jìn)展[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2014, 30(2):193-196.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Dickkopf-1 silencing inhibits invasion and epithelial-mesenchymal transition in gastric carcinoma cells by down-regulating β-catenin

SUN Jie1, FU Li-fang2

(1DepartmentofTraditionalChineseMedicine,ShandongMedicalCollege，2DepartmentofRespiratoryMedicine,ChineseMedicineHospitalinLinyiCity,Linyi276000,China.E-mail:jsunsd@163.com)

AIM: To explore the expression of Dickkopf-1 (DKK1) in human gastric carcinoma cells, and the influences ofDKK1 gene silencing on cell invasion. METHODS: The levels of DKK1 in the human gastric mucosa cell line GES-1 and gastric carcinoma cell lines MKN-45 and SGC-7901 were detected by real-time PCR and Western blot.DKK1 gene was silenced by RNA interference, which was verified by real-time PCR, Western blot and ELISA. The cell invasion ability was determined by Transwell assay, and the cell proliferation was inhibited by mitomycin C. The levels of E-cadherin, N-cadherin, vimentin and β-catenin were determined by real-time PCR and Western blot. RESULTS: The expression of DKK1 was significantly higher in MKN-45 cells and SGC-7901 cells than that in GES-1 cells, indicating that DKK1 expression was obviously increased in gastric carcinoma cells. After successful silencing ofDKK1 gene in the MKN-45 cells and SGC-7901 cells, the cell invasion ability was markedly decreased in a time-dependent pattern with increased expression of E-cadherin and decreased expression of N-cadherin and vimentin, indicating thatDKK1 silencing dramatically inhibited gastric carcinoma cell invasion and epithelial-mesenchymal transition (EMT). The introduction of exogenous recombinant DKK1 (rDKK1) demonstrated the promoting effect of DKK1 on gastric carcinoma cell invasion and EMT. In addition, the inhibitory effects ofDKK1 silencing on gastric carcinoma cell invasion and EMT were fulfilled by down-regulating β-catenin. CONCLUSION: The expression of DKK1 is significantly increased in human gastric carcinoma cells. Silencing ofDKK1 markedly inhibits gastric carcinoma cell invasion and EMT by down-regulating β-catenin.

Dickkopf-1; Gastric carcinoma; Epithelial-mesenchymal transition; Cell invasion; β-catenin

1000- 4718(2017)08- 1428- 08

2016- 09- 30

2017- 05- 31

山東省教育廳課題(No. J13LK56)；臨沂市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No. 20151505)

R730.23； R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.014

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0539-8052575； E-mail: jsunsd@163.com