王紅鋼， 張優(yōu)敬， 皇甫超申， 王 軍， 吳東棟， 鐘培育， 王國(guó)英， 李彥章

(河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 河南 開(kāi)封 475004)

·短篇論著·

GYY4137對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解的影響*

王紅鋼， 張優(yōu)敬， 皇甫超申， 王 軍， 吳東棟， 鐘培育， 王國(guó)英， 李彥章△

(河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 河南 開(kāi)封 475004)

目的： 探討新合成的硫化氫(H2S)供體GYY4137對(duì)小鼠原代肝脂肪變性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解的影響。方法: 體外用油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型。采用兩步原位灌流法分離C57BL/6小鼠原代肝細(xì)胞并分為4組：對(duì)照組用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)54 h；模型組用含1.2 mmol/L油酸(溶于10% BSA)的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，再用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h； H2S組和DL-炔丙基甘氨酸(PAG；胱硫醚γ-裂解酶抑制劑，抑制H2S合成)組則用含有1.2 mmol/L油酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，再用無(wú)血清無(wú)酚紅的RPMI-1640培養(yǎng)液(分別給予含有1 mmol/L GYY4137和200 μmol/L PAG)培養(yǎng)6 h。測(cè)量細(xì)胞甘油釋放量及胞內(nèi)激素敏感性脂肪酶(HSL)的蛋白表達(dá)量。結(jié)果: 和模型組相比， H2S組培養(yǎng)液中甘油釋放量和磷酸化HSL(p-HSL)蛋白表達(dá)水平明顯降低，而PAG組又明顯升高。結(jié)論: 在小鼠原代脂肪變性肝細(xì)胞中，GYY4137可能通過(guò)抑制HSL的磷酸化水平而減少胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解。

硫化氫； 胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解； 肝細(xì)胞； 油酸

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種普遍的肝病，它主要由脂肪在肝細(xì)胞中過(guò)度聚集導(dǎo)致[1]。在肝細(xì)胞中，有2條甘油三酯分解途徑，一條是脂質(zhì)自嗜分解途徑，另一條是胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解途徑。肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解減弱是其脂肪變性的重要原因[2]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種重要的氣體信號(hào)分子，在脂代謝和心肌細(xì)胞損傷等生理病理過(guò)程起重要作用，它在哺乳動(dòng)物體內(nèi)以半胱氨酸為底物，在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)、胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase，CBS)及3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)的催化下產(chǎn)生[3-4]。激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)是脂肪分解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，它被蛋白激酶磷酸化后具有活性，催化脂肪分解[5]。GYY4137是一個(gè)新合成的H2S供體，能在生理溫度和pH下的溶液中緩慢持續(xù)地釋放H2S，可較好地模擬體內(nèi)H2S 釋放過(guò)程[6]。在正常生理?xiàng)l件下，外源性或內(nèi)源性H2S能影響脂質(zhì)代謝，其機(jī)制還未完全清楚[7]。研究顯示，抑制小鼠脂肪細(xì)胞中CSE/H2S系統(tǒng)可增強(qiáng)胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解作用，減輕脂肪堆積，而外源性H2S則會(huì)降低脂肪分解作用[8]，由此本課題組推測(cè)外源性H2S可能對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解具有調(diào)節(jié)作用。本文用GYY4137作為H2S的供體，用油酸(oleic acid，OA)誘導(dǎo)建立肝脂肪變性模型，在體外研究外源性H2S對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解的影響，為NAFLD的臨床藥物治療及H2S相關(guān)藥物研究提供一定的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)采用4～6周齡雄性C57BL/6小鼠(南京大學(xué)動(dòng)物模型中心)，18～22 g，毛發(fā)光亮無(wú)脫毛，四肢無(wú)缺陷，全身無(wú)畸形及腫塊，攝食、活動(dòng)度和精神狀態(tài)良好。

2 方法

2.1 細(xì)胞及其分組 按照Seglen的兩步灌流法[9]分離小鼠原代肝細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照(control)組(RPMI-1640培養(yǎng)液+10%BSA)、模型(model)組(RPMI-1640培養(yǎng)液+10%BSA+1.2 mmol/L OA)、H2S組和DL-炔丙基甘氨酸(DL-proparylglycine，PAG；CSE抑制劑，抑制H2S合成)組(用RPMI-1640培養(yǎng)液+10%BSA+1.2 mmol/L OA孵育原代肝細(xì)胞48 h后，分別給予1 mmol/L GYY4137和200 μmol/L PAG處理6 h)。

2.2 油紅染色 PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定10 min，37 ℃避光油紅染色20 min， 再用50%異丙醇清洗20 s，雙蒸水洗3遍, 然后在倒置熒光顯微鏡下拍照。

2.3 MTT法檢測(cè)不同濃度油酸對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響 肝細(xì)胞以1×107/L、每孔0.2 mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后在培養(yǎng)液內(nèi)分別加入不同濃度油酸(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，各孔分別加入MTT試劑(5 g/L) 20 μL，培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，各孔分別加入150 μL DMSO并震蕩5 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的吸光度(A)值，細(xì)胞活力=A處理組/A對(duì)照組×100%。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Western blot PBS清洗細(xì)胞3遍，每孔加入200 μL RIPA裂解液，混勻后室溫靜置10 min，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，在冰上震蕩裂解5 min，12 000×g、4 ℃離心，取上清按照BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。上樣50 μL，100 V電泳45～60 min，轉(zhuǎn)膜后取出PVDF膜，用TBST清洗10～15 min。 I 抗用含脫脂奶粉的TBST稀釋(1∶1 000)，室溫孵育2 h， TBST緩沖液洗PVDF膜10 min，洗3次，加入 II 抗(1∶1000稀釋?zhuān)琀RP標(biāo)記)室溫孵育2 h， TBST緩沖液洗PVDF膜10 min×3次，加入顯色液照相保存結(jié)果。

2.5 檢測(cè)細(xì)胞甘油釋放量 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，4 ℃、12 000×g離心10 min，吸取上清按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)(原理：在ATP存在下甘油被甘油激酶磷酸化為3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫；過(guò)氧化氫在過(guò)氧化物酶作用下轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，苯醌亞胺光密度值與甘油濃度成正比)，用比色法測(cè)量培養(yǎng)基中的甘油含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析比較組間均數(shù)的差異， 以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 倒置顯微鏡下的小鼠原代肝細(xì)胞的形態(tài)

分離的小鼠原代肝細(xì)胞的純度和存活率均在95%以上，在倒置顯微鏡下，細(xì)胞貼壁，并具有典型的肝細(xì)胞形態(tài): 細(xì)胞呈不規(guī)則圓形或多邊形，邊界輪廓清晰，胞體很大，核呈圓形或橢圓形，有單核或雙核，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The morphology of mouse primary hepatocytes under inverted microscope (×200).

圖1 倒置顯微鏡下小鼠原代肝細(xì)胞的形態(tài)

2 MTT實(shí)驗(yàn)確定誘導(dǎo)液中油酸的適宜濃度

為確定誘導(dǎo)液中合適的油酸濃度，本實(shí)驗(yàn)用MTT法測(cè)量不同濃度油酸誘導(dǎo)后肝細(xì)胞的活力，結(jié)果表明誘導(dǎo)液中油酸濃度在0.8～1.2 mmol/L時(shí)，肝細(xì)胞活力較高，當(dāng)誘導(dǎo)液中油酸的濃度大于1.2 mmol/L或小于0.8 mmol/L時(shí)，細(xì)胞活力明顯下降。

本實(shí)驗(yàn)用1.2 mmol/L OA誘導(dǎo)肝細(xì)胞48 h后進(jìn)行油紅染色，結(jié)果顯示細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大量脂滴積聚，提示肝細(xì)胞脂肪變性模型構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2、3。

Figure 2.The effect of different concentrations of OA on the viability of mouse primary hepatocytes detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L;#P<0.05vs1.2 mmol/L.

圖2 不同濃度油酸對(duì)肝細(xì)胞活性的影響

Figure 3.The lipid accumulation in the hepatocytes induced by OA (oil red O staining, ×400). OA at 1.2 mmol/L was used to induce hepatocytes for 48 h to establish the steatosis model. The fat drops were indicated by the arrows. A: control group; B: model group.

圖3 油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積

3 H2S對(duì)肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)分解的影響

肝細(xì)胞釋放至培養(yǎng)液的甘油量可反映胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解的狀況[10]。收集細(xì)胞培養(yǎng)液并檢測(cè)其中細(xì)胞釋放的甘油量，結(jié)果顯示對(duì)照組培養(yǎng)液中含甘油較少；模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中甘油量比對(duì)照組顯著增多(P<0.05)；H2S組培養(yǎng)液中甘油量又比模型組顯著減少(P<0.05)；和H2S組相比，PAG組細(xì)胞培養(yǎng)液中甘油量顯著增多(P<0.05)，提示胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解可被外源性H2S抑制，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The effect of H2S on the glycerin release from the he-patocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsH2S group.

圖4 H2S對(duì)肝細(xì)胞甘油釋放量的影響

4 H2S對(duì)肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)激素敏感性脂肪酶蛋白表達(dá)量的影響

檢測(cè)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞中總的激素敏感性脂肪酶(total HSL，t-HSL)的表達(dá)均無(wú)顯著差異；模型組細(xì)胞中磷酸化的激素敏感性脂肪酶(phosphorylated HSL，p-HSL)與對(duì)照組相比顯著增多(P<0.05)； H2S組細(xì)胞中p-HSL表達(dá)水平比模型組顯著降低(P<0.05)，提示外源性H2S可抑制HSL的磷酸化，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The effect of H2S on the phosphorylation of HSL in the hepatocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖5 H2S對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)激素敏感性脂肪酶磷酸化的影響

討 論

肝臟在脂質(zhì)代謝中有重要作用，其功能異?？蓪?dǎo)致NAFLD。肝細(xì)胞在生理?xiàng)l件下可分解脂肪，但不儲(chǔ)存脂肪；過(guò)多的脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)聚集成脂滴，代償性地增加胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解[11]，本實(shí)驗(yàn)選用肝細(xì)胞甘油釋放量作為衡量肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解代謝的指標(biāo)。

體外油酸孵育細(xì)胞是制作細(xì)胞脂肪變性模型的常用方法[12]。本文選用1.2 mmol/L油酸既成功誘導(dǎo)建立脂肪變性模型，同時(shí)又最大程度地消除油酸細(xì)胞毒性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。HSL是胞質(zhì)內(nèi)催化脂肪分解的關(guān)鍵酶，該酶的磷酸化形式具有活性，可催化胞質(zhì)內(nèi)甘油三酯分解，因此HSL磷酸化水平可反映胞質(zhì)內(nèi)脂肪分解的強(qiáng)弱。作為一種新型H2S緩釋劑，GYY4137在高劑量時(shí)有細(xì)胞毒性，而少劑量時(shí)又不能顯著改變胞內(nèi)H2S水平[13]。研究表明，GYY4137可抑制大鼠脂肪細(xì)胞中HSL的活性，抑制脂肪細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解[14]，但對(duì)肝細(xì)胞中HSL的影響還不清楚。本文用油酸誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞建立脂肪變性模型，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于GYY4137的H2S可抑制胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解，同時(shí)胞質(zhì)內(nèi)p-HSL水平降低，因此本文推測(cè)，GYY4137可能通過(guò)抑制HSL的磷酸化而減弱胞質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)分解。若該推測(cè)成立，將為NAFLD臨床治療開(kāi)創(chuàng)一個(gè)新的思路，也為開(kāi)發(fā)H2S藥物提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本文又發(fā)現(xiàn)模型組胞質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)分解及p-HSL水平均比對(duì)照組增強(qiáng)，提示油酸誘導(dǎo)可導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解的代償性增強(qiáng)。Geng等[8]研究表明，在小鼠脂肪細(xì)胞中，GYY4137可減少cAMP水平而抑制蛋白激酶A的激活，進(jìn)而降低HSL磷酸化水平抑制胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解。本文中GYY4137究竟通過(guò)何種途徑抑制HSL的磷酸化有待進(jìn)一步研究。有研究表明NaHS可通過(guò)促進(jìn)脂代謝而改善小鼠肝脂肪變[7]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果矛盾，也可能本文結(jié)論只是GYY4137本身的副作用或者其它，其確切原因有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在小鼠原代脂肪變性肝細(xì)胞中，外源性給予H2S供體GYY4137可能通過(guò)降低HSL的磷酸化水平而抑制由油酸誘導(dǎo)的胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)分解的代償性增強(qiáng)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of GYY4137 on cytosolic lipid decomposition in mouse primary hepatocytes

WANG Hong-gang, ZHANG You-jing, HUANG-FU Chao-shen, WANG Jun, WU Dong-dong, ZHONG Pei-yu, WANG Guo-ying, LI Yan-zhang

(TheBasicMedicalCollegeofHenanUniversity,Kaifeng475004,China.E-mail: 10190011@henu.edu.cn)

AIM: To evaluate the effect of GYY4137， a novel hydrogen sulfide (H2S) donor， on cytosolic lipid decomposition in mouse primary steatosis hepatocytes. METHODS: Oleic acid (OA) was used to induce hepatic steatosis modelinvitro. The C57BL/6 mouse primary hepatocytes isolated and cultured by 2-stepinsituperfusion were divided into 4 groups: the cells in control group were incubated with normal medium for 54 h; the cells in model group were incubated with OA at 1.2 mmol/L for 48 h followed by serum-free phenol red-free RPMI-1640 for 6 h; the cells in H2S group or DL-propar-gylglycine (PAG； an inhibitor of cystathione γ-lysase， inhibiting H2S synthesis) group were incubated with OA at 1.2 mmol/L for 48 h followed by serum-free phenol red-free RPMI-1640 which contained 1 mmol/L GYY4137 or 200 μmol/L PAG for 6 h. The glycerin release and the protein expression of hormone-sensitive lipase (HSL) in the cells were mea-sured. RESULTS: Compared with model group, the glycerin release and the protein expression of phosphorylated HSL (p-HSL) in H2S group decreased significantly， while those increased significantly in PAG group. CONCLUSION: In steatosis hepatocytes, exogenous H2S possibly decreases cytosolic lipid decomposition by decreasing the protein level of p-HSL.

Hydrogen sulfide； Cytosolic lipid decomposition； Hepatocytes； Oleic acid

1000- 4718(2017)08- 1520- 04

2017- 06- 05

2017- 06- 27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 3130084)；河南省高校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(No. 16A310001)

R575.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.028

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