朱 坤， 徐 明， 丁米娜， 林貞花， 陳麗艷,△

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 2腫瘤研究中心， 吉林 延吉 133000)

3-甲基腺嘌呤聯(lián)合曲古霉素A抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞生長*

朱 坤1， 徐 明2， 丁米娜1， 林貞花2， 陳麗艷1,2△

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院1生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，2腫瘤研究中心， 吉林 延吉 133000)

目的： 探討自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)聯(lián)合組蛋白去乙?；敢种苿┣琶顾谹(TSA)對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長的影響及其可能的分子機(jī)制。方法: MTT法檢測TSA對MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制作用；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化；Western blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的變化；MTT法檢測3-MA聯(lián)合TSA對細(xì)胞活力的影響。結(jié)果: TSA可有效抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的生長，并呈劑量和時(shí)間依賴性；TSA抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬；3-MA可有效抑制TSA誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞自噬，并進(jìn)一步抑制細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論: 3-MA可明顯增加TSA對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的生長抑制作用。

乳腺癌； 曲古霉素A； 3-甲基腺嘌呤； 自噬

三陰性乳腺癌約占乳腺癌的15%～20%，由于其缺乏臨床特異性的治療靶點(diǎn)，具有侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，受到廣泛的研究和關(guān)注[1-2]。自噬是細(xì)胞維持生存的重要機(jī)制之一，與腫瘤關(guān)系密切。研究表明，自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)出雙刃劍作用：一方面，自噬可提高腫瘤細(xì)胞對不利環(huán)境的耐受能力，從而維持其生存；另一方面，自噬也可成為某些腫瘤細(xì)胞的死亡途徑[3]。有研究顯示，抑制自噬可增加某些化療藥物的療效。曲古霉素A(trichostatin A，TSA)屬于廣譜組蛋白去乙酰化酶抑制劑，是一種新型的抗腫瘤藥物[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)聯(lián)合TSA對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響及其可能的分子機(jī)制，為臨床治療三陰性乳腺癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系由延邊大學(xué)腫瘤研究中心提供；TSA和3-MA購自Selleck；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和青-鏈霉素等化學(xué)試劑為Gibco產(chǎn)品；MTT試劑及Western blot實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑為Sigma產(chǎn)品；LC3B和β-actin抗體等為Cell Signaling Technology產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，使用0.25%胰酶消化傳代。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力變化 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按每孔1×104接種于96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的TSA，每種濃度設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔，對照組加入等體積的培養(yǎng)液。分別于24 h、48 h和72 h 后每孔加入50 μL的MTT(5 g/L)，4 h后終止培養(yǎng)吸棄上清，每孔加入100 μL的二甲基亞砜(DMSO)，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定各孔吸光度值，并按公式計(jì)算細(xì)胞生存率：細(xì)胞生存率(%)=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對照組吸光值×100%。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力變化 將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90%，用 10 μL的槍頭垂直劃痕，PBS 洗3 次后加入無血清培養(yǎng)基，并給予相應(yīng)濃度的TSA藥物處理；置 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在劃痕后 0 h、12 h和24 h 拍照，顯微鏡下測量劃痕間隙的距離。

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的變化 乳腺癌細(xì)胞經(jīng)藥物處理48 h后，加入RIPA裂解液提取總蛋白；Bradford法測定蛋白濃度；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h；加入 I 抗(LC3B)后4 ℃過夜；室溫下洗膜，加入相應(yīng) II 抗孵育2 h；ECL 曝光，觀察并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TSA對MDA-MB-231細(xì)胞活力及遷移能力的影響

TSA處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，乳腺癌細(xì)胞的活力明顯受到抑制。隨著給藥劑量的增加，時(shí)間的延長，細(xì)胞吸收光密度值逐漸減小，細(xì)胞活力抑制率明顯增加，與未加藥對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。倒置顯微鏡下可見，TSA給藥后活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞密度下降，細(xì)胞形態(tài)變小，固縮(圖2)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用不同濃度TSA處理MDA-MB-231細(xì)胞后，其劃痕愈合距離較未處理組細(xì)胞明顯縮短，且呈時(shí)間與濃度依賴性(P<0.05)，見圖3。

Figure 1.Effect of TSA on the vitality of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3

圖1 TSA對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

Figure 2.Effect of TSA on the growth of MDA-MB-231 cells (×40).

圖2 TSA對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響

2 Western blot 檢測TSA處理后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

與未加藥對照組細(xì)胞相比，TSA處理乳腺癌細(xì)胞后，給藥組的自噬標(biāo)志性蛋白LC3-I型轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ型明顯增多，以200 nmol/L TSA的作用效果最為顯著(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.Effect of TSA on the migration ability of MDA-MB-231 cells (×40).

圖3 TSA對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 4.Expression of autophagy-related proteins in MDA-MB-231 cells induced by TSA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 TSA誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 3-MA聯(lián)合TSA對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

為進(jìn)一步檢測自噬抑制劑3-MA對TSA抑制MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響，通過MTT法檢測了3-MA與TSA聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后細(xì)胞活力的變化。結(jié)果表明，與TSA單獨(dú)給藥組比較，3-MA可進(jìn)一步增加TSA對細(xì)胞活力的抑制作用(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.Effect of 3-MA combined with TSA on the growth of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsTSA group.

圖5 3-MA聯(lián)合TSA對MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響

4 3-MA對TSA誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2.5 μmol/L的3-MA與100 nmol/L 的TSA聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，與TSA單獨(dú)用藥組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

討 論

近年研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；悄[瘤抑癌基因失活的重要機(jī)制。抑制組蛋白去乙酰化酶可在一定程度上逆轉(zhuǎn)抑癌基因的低乙?；?，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長及分化[5]。TSA源自鏈霉菌代謝產(chǎn)物，是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)可抑制組蛋白去乙?；傅奶烊划a(chǎn)物，研究證實(shí)TSA對多種腫瘤細(xì)胞具有抗癌活性并以其特異性、高效性及低毒性等特點(diǎn)而受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系，首先探討了TSA對細(xì)胞增殖及遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSA可明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的生長及遷移能力，并且抑制效應(yīng)與時(shí)間及劑量呈正相關(guān)。

Figure 6.Effect of 3-MA combined with TSA on the autophagy of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsTSA group.

圖6 3-MA對TSA誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬的影響

有研究顯示，自噬與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，多種抗腫瘤治療都可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬[6-7]。LC3-Ⅱ是特異性表達(dá)在自噬小體膜的分子標(biāo)識(shí)，可作為自噬的特異檢測指標(biāo)。為探討TSA對三陰性乳腺癌細(xì)胞自噬作用的影響，本實(shí)驗(yàn)通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)分析了TSA給藥后乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100 nmol/L的TSA處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)LC3B-Ⅱ的表達(dá)明顯上調(diào)，提示TSA對乳腺癌細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)自噬作用。

有學(xué)者認(rèn)為，自噬可降低腫瘤對某些化療藥的敏感性，提示自噬可能是細(xì)胞對抗腫瘤治療的一種耐受機(jī)制[8]。3-MA為自噬特異性抑制劑，既往研究報(bào)道3-MA可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡或自噬[9-10]，提示其作為聯(lián)合治療藥物之一，具有較好的臨床應(yīng)用前景。因此，本文進(jìn)一步探討了自噬抑制后TSA對三陰性乳腺癌的治療效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)3-MA與TSA聯(lián)合處理三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后，聯(lián)合用藥組細(xì)胞自噬蛋白LC3-Ⅱ的活化得到有效抑制；同時(shí)細(xì)胞生長能力進(jìn)一步受到抑制，表明自噬作用被抑制后，腫瘤細(xì)胞對TSA的敏感性得到增強(qiáng)，提示乳腺癌化療中存在的細(xì)胞自噬可能是化療抵抗的原因之一。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，自噬抑制劑3-MA與TSA聯(lián)用可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，其作用機(jī)制與腫瘤細(xì)胞的保護(hù)性自噬受到抑制密切相關(guān)。自噬抑制劑與化療藥物的聯(lián)用可為三陰性乳腺癌的治療提供更多的選擇。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

3-MA combined with TSA inhibits growth of triple-negative breast cancer cells

ZHU Kun1, XU Ming2, DING Mi-na1, LIN Zhen-hua2, CHEN Li-yan1, 2

(1DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,2CancerResearchCenter,YanbianUniversityMedicalCollege,Yanji133002,China.E-mail:lychen@ybu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of 3-methyladenine (3-MA) combined with trichostatin A (TSA) on triple-negative breast cancer cells and the mechanism involved. METHODS: The viability of MDA-MB-231 cells was detected by MTT assay, the migration ability was determined by scratch assay, and the expression of autophagy-related proteins was detected by Western blot. RESULTS: TSA significantly inhibited the viability of MDA-MB-231 cells in a time- and dose-dependent manner. The results of scratch assay showed that TSA inhibited cell migration ability. Western blot data indicated that TSA resulted in a moderate increase in LC3-Ⅱ expression. Moreover, 3-MA inhibited cell autophagy induced by TSA, and combination of 3-MA and TSA further inhibited the viability of MDA-MB-231 cells. CONCLUSION: Combination of 3-MA and TSA may effectively inhibit the growth of triple-negative breast cancer cells．

Breast cancer; Trichostatin A; 3-methyladenine; Autophagy

1000- 4718(2017)08- 1524- 04

2016- 12- 23

2017- 03- 23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81460399 )

R730.23; R737.9

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.029

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△通訊作者 Tel: 0433-2435041; E-mail: lychen@ybu.edu.cn