蘇曉菊 董詩(shī)琦 李貌 趙九龍 滿曉華 金晶 李兆申 鄒多武 黃浩杰

·論著·

高遷移率族蛋白B1在大鼠急性壞死性胰腺炎中的表達(dá)

蘇曉菊 董詩(shī)琦 李貌 趙九龍 滿曉華 金晶 李兆申 鄒多武 黃浩杰

目的 檢測(cè)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織高遷移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA表達(dá)量，觀察血清HMGB1水平的變化規(guī)律。方法 采用腹腔注射20% L-精氨酸250 mg/100 g體重2次、間隔1 h的方法制備ANP大鼠模型，以腹腔注射等容積生理鹽水作為對(duì)照組。注射后6、18、24、36、48、72、96 h分批處死大鼠，取血檢測(cè)血清淀粉酶及HMGB1水平；取胰腺組織常規(guī)行病理學(xué)檢查；采用實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)量，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胰腺組織HMGB1蛋白表達(dá)。結(jié)果 血清淀粉酶水平自造模后6 h開(kāi)始升高，18 h達(dá)峰值[(5 070±603)U/L]，48 h后恢復(fù)至正常水平，其中ANP 6、18 h時(shí)的淀粉酶活性顯著高于對(duì)照組的(1 844±181)U/L(P值均<0.05)。血清HMGB1水平自造模后6 h開(kāi)始升高，36 h達(dá)峰值[(288.5±42.1)μg/L]，以后逐漸下降，ANP組所有時(shí)間點(diǎn)的HMGB1水平均顯著高于對(duì)照組的(31.6±10.1)μg/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。ANP各時(shí)間點(diǎn)組的胰腺病理評(píng)分均顯著高于對(duì)照組的0.38±0.52，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。ANP 6、18、24、36、48、72、96 h組胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)量分別為1.23±0.25、2.60±0.46、3.23±0.34、4.77±0.66、2.88±0.56、2.05±0.20、1.33±0.28，均顯著高于對(duì)照組的0.44±0.09，其中ANP 36 h組的表達(dá)量顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)組(P值均<0.05)；ANP組6、18、36、72 h胰腺組織HMGB1蛋白表達(dá)量分別為1.14±0.02、1.15±0.01、1.22±0.01、1.22±0.04，均顯著高于對(duì)照組的表達(dá)量1，其中ANP 36、72 h組的表達(dá)顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。結(jié)論 HMGB1可能是參與ANP時(shí)全身炎癥反應(yīng)的晚期炎癥因子之一。

胰腺炎，急性壞死性； 糖基化終產(chǎn)物； 高遷移率族蛋白B1； 炎癥； 大鼠

Fund program: Youth Science Foundation, National Natural Science Foundation of China(81300353)

近年研究表明，高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1, HMGB1)是一種在重癥急性胰腺炎(SAP)病程晚期發(fā)揮重要作用的促炎遞質(zhì)，也是SAP治療研究的重要切入點(diǎn)[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，急性壞死性胰腺炎(ANP)小鼠的血清HMGB1水平顯著高于正常小鼠[2]；臨床研究表明，SAP患者血清HMGB1水平顯著升高[3]。采用抗HMGB1抗體能有效緩解ANP的進(jìn)展[4]。本研究檢測(cè)ANP大鼠血清HMGB1水平及胰腺組織HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)，分析其變化規(guī)律。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

64只健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，5～6周齡，清潔級(jí)，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(滬)2007-0003。在室溫22～28℃、相對(duì)濕度40%～70%的動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水。按完全隨機(jī)法將大鼠分為對(duì)照組及ANP 6、18、24、36、48、72、96 h組，每組8只。參考Tani等[5]報(bào)道，采用腹腔注射20% L-精氨酸(Sigma公司)250 mg/100 g體重2次、間隔1 h的方法制備ANP模型，對(duì)照組大鼠腹腔注射等容積生理鹽水。按各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，心臟取血，分離血清；取胰腺組織，部分置液氮保存，部分置4%甲醛液固定。

二、方法

1．血清淀粉酶、HMGB1水平檢測(cè)：血清淀粉酶采用HITACHI-7150型自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定。HMGB1采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒(上海西唐生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)操作。

2．胰腺組織病理學(xué)檢查： 取甲醛固定的胰腺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，由病理科醫(yī)師盲法讀片，并參照Rongione等[6]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評(píng)分。

3．胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)檢測(cè)：用Trizol試劑盒(上海晶美公司)提取胰腺組織總RNA。應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由上海英駿生物技術(shù)公司合成。HMGB1引物上游序列為5′-GCTGGCTGTAATGCCTTTGCCC-3′，下游為5′-AGCGCGGAAAATTACAAGAACGCT-3′，擴(kuò)增片段396 bp；內(nèi)參β-actin引物上游序列為5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′，下游為5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′，擴(kuò)增片段251 bp。先行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再使用SYBR Premix Ex TagTM試劑盒在ABI 7500PCR儀(Applied Biosystems公司)上采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)儀器自帶軟件獲取Ct值，以正常胰腺組織作為對(duì)比，采用公式2-△△Ct計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

4．胰腺組織HMGB1蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用蛋白裂解液提取胰腺組織，應(yīng)用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒(Pierce公司)定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HMGB1蛋白的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。羊抗人HMGB1單克隆抗體(上海普盛生物公司)工作濃度1∶200，羊抗人抗體(上?？党缮锕こ逃邢薰?工作濃度1∶7 500，HRP標(biāo)記的兔抗羊抗體(長(zhǎng)島生物科技有限公司)工作濃度1∶1 000。最后ECL顯色，應(yīng)用Fluorchem FC2熒光及凝膠成像系統(tǒng)掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清淀粉酶活性及HMGB1水平的變化

血清淀粉酶水平自造模后6 h開(kāi)始升高，18 h時(shí)達(dá)峰值，以后逐漸下降，48 h后恢復(fù)至正常水平，僅ANP 6、18 h時(shí)的淀粉酶活性顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05，表1)。

血清HMGB1水平自造模后6 h開(kāi)始升高，36 h達(dá)峰值，以后逐漸下降，但ANP組所有時(shí)間點(diǎn)的水平均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。

組別只數(shù)淀粉酶活性(U/L)HMGB1水平(μg/L)對(duì)照組81844±18131.6±10.1ANP6h組82912±612a74.7±21.9ab 18h組85070±603a127.1±28.4ab 24h組82829±741171.1±63.2ab 36h組81833±218288.5±42.1a 48h組81701±614135.0±39.1ab 72h組81371±269116.2±37.7ab 96h組81489±25088.3±11.9ab

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與ANP 36 h組比較，bP<0.05

二、大鼠胰腺組織病理改變

對(duì)照組胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)異常改變。ANP 6 h組胰腺腺泡組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯破壞，間質(zhì)水腫，輕、中度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)；18 h時(shí)胰腺間質(zhì)顯著水腫，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度實(shí)質(zhì)壞死和出血；24 h時(shí)胰腺腺泡細(xì)胞腫脹，灶性壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)大量紅細(xì)胞滲出；36 h時(shí)腺泡結(jié)構(gòu)破壞較多，小葉排列紊亂，大量炎性滲出，壞死區(qū)內(nèi)腺泡結(jié)構(gòu)消失；48 h組腺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，胰腺周?chē)窘M織明顯充血，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；72 h組胰腺壞死加重，腺泡結(jié)構(gòu)消失，胞核溶解，葉間隙增寬，間質(zhì)微血管破裂，大量紅細(xì)胞溢出，片狀脂肪壞死形成，可見(jiàn)皂化斑；96 h時(shí)胰腺組織壞死達(dá)到最高程度(圖1)。ANP 6、18、24、36、48、72、96 h組的胰腺組織病理分值分別為(3.38±1.30)、(6.88±0.64)、(9.50±1.77)、(10.25±1.04)、(12.00±1.31)、(12.38±1.06)、(13.50±0.93)分，較對(duì)照組的(0.38±0.52)分顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

三、胰腺組織HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá)的變化

ANP 6、18、24、36、48、72、96 h組胰腺組織HMGB1 mRNA的表達(dá)量分別為1.23±0.25、2.60±0.46、3.23±0.34、4.77±0.66、2.88±0.56、2.05±0.20、1.33±0.28，ANP各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組的0.44±0.09，其中ANP 36 h組又顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)組(P值均<0.05)。胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)量與血清HMGB1水平變化的趨勢(shì)基本一致(圖2)。

ANP 6、18、36、72 h組胰腺組織HMGB1蛋白表達(dá)量分別為1.14±0.02、1.15±0.01、1.22±0.01、1.22±0.04，其中36、72 h組顯著高于對(duì)照組的表達(dá)量1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖3)。

討 論

1973年Goodwin等[7]首次在牛胸腺中發(fā)現(xiàn)HMGB1，它是一種含量豐富的非組蛋白核蛋白。人與嚙齒動(dòng)物的氨基酸序列同源性達(dá)到98%以上，小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性更是高達(dá)100%，說(shuō)明HMGB1氨基酸序列具有高度保守性。HMGB1由A、B、C區(qū)3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，A區(qū)和B區(qū)是兩個(gè)同源的L型功能結(jié)構(gòu)域，也稱(chēng)為box A和box B，box B是HMGB1誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的部分，是HMGB1發(fā)揮致炎作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[8]。

圖1 對(duì)照組(1A)及ANP 18(1B)、36(1C)、96 h(1D)組胰腺組織病理變化(HE ×200)

圖2 胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)量與血清HMGB1水平的變化趨勢(shì)

圖3 對(duì)照組(1)及ANP 6(2～3)、18(4～5)、36(6～7)、72(8～9)h組胰腺組織HMGB1蛋白表達(dá)

臨床研究發(fā)現(xiàn)，SAP患者的血清HMGB1水平顯著升高，且與病情的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，HMGB1是一種“晚期”促炎遞質(zhì)，在建模后前幾個(gè)小時(shí)無(wú)明顯變化，至12 h則升高，至48 h仍維持在較高水平[9]。楊智勇等[10]采用胰管逆行灌注人工膽汁的方法制備大鼠ANP模型，結(jié)果顯示，ANP組大鼠血清TNF-α和IL-1水平在建模后3～6 h達(dá)高峰，12 h即大幅下降，而HMGB1水平在建模后12 h明顯升高，至12～24 h仍維持在較高水平。作為一種晚期炎癥因子，HMGB1很可能對(duì)SAP的全身炎癥反應(yīng)有顯著影響，而且HMGB1在血清中出現(xiàn)時(shí)間晚于相應(yīng)受體RAGE。

本研究結(jié)果顯示，ANP大鼠胰腺組織HMGB1mRNA表達(dá)量在造模后36 h達(dá)峰值，顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清HMGB1水平在造模后6 h開(kāi)始升高，36 h達(dá)峰值，以后逐漸下降，但ANP各時(shí)間點(diǎn)的血清HMGB1水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與楊智勇等[10]的結(jié)果一致，提示HMGB1對(duì)ANP大鼠晚期炎癥反應(yīng)和胰腺組織損傷有顯著影響。

[1] Yasuda T, Ueda T, Takeyama Y, et al. Significant increase of serum high-mobility group box chromosomal protein l levels in patients with severe acute pancreatitis[J]. Pancreas, 2006, 33(4):359-363.

[2] Yang ZY, Ling, Y, Yin T, et al. Delayed ethyl pyruvate therapy attenuates experimental severe acute pancreatitis via reduced serum high mobility group box 1 levels in rats[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(28):4546-4550.

[3] Yasuda T, Ueda T, Takeyama Y, et al. Significant increase of serum high-mobility group box chromosomal protein 1 levels in patients with severe acute pancreatitis[J]. Pancreas, 2006, 33(4):359-363.

[4] Sawa H, Ueda T, Takeyama Y, et al. Blockade of high mobility group box-1 protein attenuates experimental severe acute pancreatitis[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(47):7666-7670.

[5] Tani S, Itoh H, Okabayashi Y, et al. New modeI of acute necrotizing pancreatitis induced by excessive doses of arginine in rats[J]. Dig Dis Sci, 1990, 35(3): 367-374.

[6] Rongione AJ, Kusske AM, Ashley SW, et al. Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rats[J]. Gastroenterology, 1997, 112(3):960-967.

[7] Goodwin GH, Johns EW. Isolation and characterisation of two calf-thymus chromatin non-histone proteins with high contents of acidic and basic amino acids[J]. Eur J Biochem, 1973, 40(1):215-219.

[8] Li J, Kokkola R, Tabibzadeh S, et al. Structural basis for the proinflammatory cytokine activity of high mobility group box 1[J]. Mol Med, 2003, 9(1-2):37-45.

[9] 劉輝,姚詠明,董月青,等.內(nèi)毒素刺激大鼠腹腔巨噬細(xì)胞高遷移率族蛋白Bl釋放的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2005, 22(1):37-38.DOI:10.3760.j.issn.1001-9030.2005.01.014.

[10] 楊智勇,王春友,熊炯圻,等.重癥急性胰腺炎大鼠血清高遷移率族蛋白-1水平的時(shí)相變化及意義[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2004,33(4):466-468.DOI:10.3870/j.issn.1672-0741.2004.04.024.

(本文編輯：冀凱宏)

The expression of HMGB in rats with acute necrotizing pancreatitis

Su Xiaoju, Dong Shiqi, Li Mao, Zhao Jiulong, Man Xiaohua, Jin Jing, Li Zhaoshen, Zou Duowu, Huang Haojie.

Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

Huang Haojie, Email: peal1920@hotmail.com

Objectives To detect the expression of serum high mobility group box-1(HMGB1) and explore its changes in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP). Methods Intraperitoneal injection of 20%L-arginine in the dosage of 250 mg/100 g twice every 1 hour was used to establish ANP rat model. Intraperitoneal injection of normal saline solution in equal volume was performed in control rats. Rats were sacrificed at 6 h, 18 h, 24 h, 36 h, 48 h, 72 h and 96 h after injection. Blood samples were collected to detect serum amylase and HMGB1 level. Pancreatic tissue was collected for pathological examination. Real-time PCR was applied to detect the mRNA expression of HMGB1 in pancreatic tissue. Werstern blot was used to determine HMGB1 protein expression in pancreatic tissue. Results Serum amylase level began to increase at 6 h after modeling, reached the peak at 18 h [(5 070±603)U/L] and returned to normal level after 48 h. Serum amylase activity at 6 h and 18 h in ANP group was much higher than that in control group (1 844±181)U/L(P<0.05). The expression of HMGB1 began to increase at 6 h, reached to the peak at 36 h[(288.5±42.1)μg/L], and then decreased gradually. HMGB1 expressions at each time point in ANP group were significantly higher than those in control group (31.6±10.1)μg/L], and the differences were statistically significant (allP<0.05). Pathological scores in pancreatic tissues in ANP group were higher than those in control group 0.38±0.52, and the differences were statistically significant (P<0.05). HMGB1 mRNA expressions at t 6 h, 18 h, 24 h, 36 h, 48 h, 72 h and 96 h in ANP group were 1.23±0.25, 2.60±0.46, 3.23±0.34, 4.77±0.66, 2.88±0.56, 2.05±0.20, 1.33±0.28, which were significantly higher than those in control group 0.44±0.09, and the relative expression of HMGB1 in ANP group at 36 h was significantly higher than those at other time points (allP<0.05). HMGB1 protein expression in pancreatic tissue in ANP group at 6 h, 18 h, 36 h, 72 h were 1.14±0.02, 1.15±0.01, 1.22±0.01, 1.22±0.04, which obviously higher than those in control group(1.0), and HMGB1 expression in ANP group at 36 h was higher than those at other time points(allP<0.05). Conclusions HMGB1 may participate in systematic inflammation as one of the late inflammatory mediators during ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Glycosylation end products; High mobility group box-1; Inflammation; Rat

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.04.003

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

黃浩杰，Email: peal1920@hotmail.com

國(guó)家自然基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81300353)

2016-12-13)