昌艷萍，田其凡，郭欣，李彥芹，閆蕾蕾，李春青

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

蝸牛腸道細(xì)菌及其纖維素酶性質(zhì)

昌艷萍，田其凡，郭欣，李彥芹，閆蕾蕾，李春青

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

為了探尋功能微生物,用幾種不同培養(yǎng)基分離蝸牛腸道可培養(yǎng)細(xì)菌并篩選纖維素降解細(xì)菌，研究了纖維素酶學(xué)性質(zhì).結(jié)果表明，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)蝸牛腸道細(xì)菌時(shí)菌落種類和數(shù)量最多，達(dá)3.3×104CFU/mL.剛果紅染色顯示，7種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌全部具有產(chǎn)酶能力；菌S6粗酶液的內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)和濾紙酶(FPase)活性最高,分別為5.96和2.84 U/mL.對(duì)Cx酶學(xué)性質(zhì)初步研究表明：該酶最適反應(yīng)溫度為35 ℃，在55 ～75 ℃時(shí)有較高的熱穩(wěn)定性；最適pH為6.0，在pH 3.0～8.0均有酶活力，pH 8.0相對(duì)酶活仍為60%；Mg2+、Na+、K+和Ca2+對(duì)酶反應(yīng)具有促進(jìn)作用，Zn2+、Cu2+和Mn2+為酶反應(yīng)的抑制劑.研究蝸牛腸道細(xì)菌的組成，從中分離高產(chǎn)纖維素酶菌株，為纖維素生物降解轉(zhuǎn)化成可再生能源尋找新的思路.

條華蝸牛; 腸道細(xì)菌; 產(chǎn)酶能力; 纖維素生物降解

在資源與環(huán)境的雙重制約壓力下，來源于秸稈生物質(zhì)產(chǎn)品的開發(fā)利用引起越來越多學(xué)者的關(guān)注[1].中國秸稈數(shù)量巨大，秸稈在短期內(nèi)不易腐解，在以種植業(yè)為主的地區(qū)作物秸稈已經(jīng)成為生產(chǎn)中的障礙.農(nóng)業(yè)部、國家發(fā)改委為了推進(jìn)秸稈綜合利用，加快實(shí)現(xiàn)秸稈的資源化、商品化，促進(jìn)資源節(jié)約、環(huán)境保護(hù)和農(nóng)民增收，于2009年2月9日制定了《編制秸稈綜合利用規(guī)劃的指導(dǎo)意見》.因此加大秸稈的利用是農(nóng)業(yè)和能源發(fā)展的必然選擇. “秸稈利用”說得那么好，為何就是推不開? 主要原因是秸稈中木質(zhì)纖維素不易被降解，在木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化過程中，其水解糖化是關(guān)鍵技術(shù)之一，目前最為有效的方法是酶解.然而，低效高昂的酶制劑極大地限制了以木質(zhì)纖維素為原料的生物質(zhì)產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展.本實(shí)驗(yàn)旨在篩選高效分解天然木質(zhì)纖維素且具有高效分泌胞外酶能力的微生物，以期為分解酶制劑的開發(fā)和木質(zhì)纖維素資源的高效分解利用提供新的思路和實(shí)踐探索.

目前的研究表明，細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、昆蟲和軟體動(dòng)物等均能夠產(chǎn)生纖維素酶[2-3].植食性動(dòng)物自身并不產(chǎn)生纖維素酶[4]，而是依賴其消化道共生生物，如細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物產(chǎn)生的纖維素酶降解纖維素.多種微生物生長(zhǎng)繁殖的理想場(chǎng)所是動(dòng)物腸道，正常腸道微生物對(duì)宿主具有生長(zhǎng)刺激、生物拮抗、營養(yǎng)、免疫等作用，也是機(jī)體的生理組成部分[5].蝸牛屬于軟體動(dòng)物門，腹足綱，大蝸牛屬.蝸牛飼養(yǎng)方便，以攝取富含纖維素的植物性材料為主，來源簡(jiǎn)單，繁殖較快，蝸牛消化道含有多種降解多糖的水解酶，可將纖維素水解為各種小分子糖.

沒有任何一種培養(yǎng)基能滿足所有微生物的營養(yǎng)要求，本研究以蝸牛腸道細(xì)菌為研究對(duì)象，通過不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以便盡可能全面了解蝸牛腸道可培養(yǎng)微生物的數(shù)量和種類，同時(shí)為分離純化高產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的研究提供了新思路.研究蝸牛腸道細(xì)菌的組成，從中分離高產(chǎn)纖維素酶菌株.

1 材料與方法

1.1 蝸牛樣品采集及鑒定

實(shí)驗(yàn)蝸牛采自河北大學(xué)花園草叢中，對(duì)采集的蝸牛的貝殼大小、殼質(zhì)形態(tài)、螺層數(shù)量及殼面顏色等形態(tài)特征進(jìn)行觀測(cè)和鑒定.

1.2 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基

為了盡可能了解蝸牛腸道細(xì)菌的種類和數(shù)量，本實(shí)驗(yàn)用以下3種培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH 7.4～7.6)；LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2)；SOB培養(yǎng)基(胰化蛋白胨20 g，酵母提取物5 g，NaCl 0.5 g，KCl 2.5 mmol，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2，使用前，加入5 mL滅菌的2 mol/L MgCl2).發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10 g，(NH4)2SO44 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值.

1.3 蝸牛腸道菌的分離與培養(yǎng)

取5只饑餓24 h中等大小的蝸牛，于無菌操作臺(tái)上，用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精棉球擦拭蝸牛體表3次，將蝸牛外殼敲碎，用鑷子輕輕將碎了的蝸牛殼取下，將去掉外殼的蝸牛浸入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇中消毒，移入無菌水中漂洗2次.順著蝸牛蜷縮的身體，將蝸牛展開，尋找蝸牛的腸道.一般蝸牛的腸道較長(zhǎng)且細(xì)，里面的食物清晰可見.將切下來的腸道用無菌水漂洗2次，然后放入研磨缸里研磨.將腸道研磨碎后，加入1 mL無離子水?dāng)噭?按10倍稀釋法將腸液稀釋后取原液、10-1和10-23個(gè)連續(xù)稀釋度各0.2 mL直接涂布于上述各種固體培養(yǎng)基上，各稀釋度重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，挑取表征各異的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上劃線、純化和培養(yǎng).將純化后菌落再分別移植斜面培養(yǎng)，并按照表征依次編號(hào).

1.4 不同菌落羧甲基纖維素(CMC)水解圈的測(cè)定及初步分析

將1.3分離出的菌株分別接在CMC培養(yǎng)基篩選板上培養(yǎng)72 h，10 g/L剛果紅染色0.5 h，觀察并測(cè)定記錄水解圈大小，比較各菌株CMC-Na的相對(duì)酶活A(yù)(圖1) [A=水解圈的直徑(D)/菌落的直徑(d)]，以A值的大小為參考依據(jù)，判斷細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶的能力，即比值越大，表示該菌株的產(chǎn)纖維素酶的能力越大；反之越小.

圖1 部分纖維素降解菌在剛果紅培養(yǎng)基的水解圈Fig.1 Hydrolyzing circle produced by partial degrading celluloses strains on Congo red medium

1.5 菌株產(chǎn)纖維素酶復(fù)篩

取1環(huán)1.4初篩產(chǎn)纖維素酶能力較大的菌株S6接種到100/250 mL液體種子培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，然后按10%接種量轉(zhuǎn)接于100/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)3 d，等發(fā)酵結(jié)束后，5 000 r/min冷凍(4 ℃)離心10 min，取上清液得粗酶液，參照田敏等[6]方法稍作改進(jìn)，測(cè)定各菌株的內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)和濾紙酶(FPase)的酶活，進(jìn)行復(fù)篩.這2種酶的酶活定義為：1 mL粗酶液1 h催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，用U表示.Cx的活力用 CMC-Na為底物進(jìn)行測(cè)定；FPase活力以去淀粉的濾紙為底物進(jìn)行測(cè)定.

1.6 纖維素酶酶學(xué)特性初步分析

提取產(chǎn)酶能力最大的菌株S6的粗酶液，按照1.5描述的方法測(cè)定CMC酶的酶活，分析酶的熱穩(wěn)定性、酶的pH穩(wěn)定性以及終濃度為1 mmol/L不同金屬離子對(duì)纖維素酶活力的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 蝸牛樣品鑒定

所采集蝸牛貝殼中等大小，呈低圓錐形，殼面黃色或者黃褐色，殼頂尖縫合線明顯.有5～5.5個(gè)螺層，各螺層膨脹，初步鑒定該蝸牛為陸生腹足綱，柄眼目，巴蝸?？频臈l華蝸牛[7].

2.2 蝸牛腸道細(xì)菌的組成特點(diǎn)及其產(chǎn)纖維素酶活性大小

用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)了蝸牛腸道細(xì)菌，分離得到了7種不同特征的腸道菌落，其菌落形態(tài)特點(diǎn)和菌落數(shù)量如表1、表2所示.表中顯示，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)蝸牛腸道細(xì)菌時(shí)菌落種類和數(shù)量最多，其次是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，而SOB培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)顯示統(tǒng)計(jì)的細(xì)菌菌落種類最少.S3菌落即邊緣規(guī)則、隆起、淡白色、光滑菌落是優(yōu)勢(shì)菌落，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和SOB培養(yǎng)基所占比例最高，分別為90.7%、72.5%和80.6%.

表1 可培養(yǎng)細(xì)菌菌落的菌落特征及其在CMC篩選結(jié)果

+表示有這種類型的菌落，-表示沒有這種類型的菌落

表2 優(yōu)勢(shì)菌S3在各培養(yǎng)基中分離的菌落數(shù)量

圖2 各測(cè)試菌的2種酶活Fig.2 Two kinds of enzyme activities of test bacteria

2.3 細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶活性大小

在CMC 培養(yǎng)基平板中加入剛果紅溶液進(jìn)行染色，并以相對(duì)酶活A(yù)的大小為參考依據(jù)，判斷細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶的能力，結(jié)果見表1.從蝸牛腸道分離出的7種不同特征菌都能產(chǎn)纖維素酶，從表1看出菌落S3的A值最高，而菌落S4的A值最低，取其中A>2的6種菌進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)篩.

2.4 菌株產(chǎn)纖維素酶復(fù)篩

用DNS法測(cè)定各菌粗酶液的Cx和FPase的酶活，結(jié)果見圖2. 菌S6發(fā)酵72 h后，其粗酶液的Cx和FPase的酶活最大，分別為5.96和2.84 U/mL，菌S1粗酶液的Cx和FPase的酶活最小，分別為5.06和2.45 U/mL，可以看出，各測(cè)試菌纖維素酶的酶活有差別，但是相差不明顯.

2.5 酶學(xué)特性分析

2.5.1 酶反應(yīng)的熱穩(wěn)定性

不同溫度對(duì)CMC酶酶活反應(yīng)的影響見圖3.圖3顯示，隨著溫度上升，纖維素酶活力也隨之上升，35 ℃是纖維素酶的最佳反應(yīng)溫度，同時(shí)看出此菌分泌的纖維素酶在15～75 ℃均有酶活力，并且在55～75 ℃時(shí)相對(duì)酶活為30%左右, 說明此菌分泌的纖維素酶具有較強(qiáng)的高溫耐受性.

2.5.2 酶反應(yīng)的pH穩(wěn)定性

在最佳溫度35 ℃下，測(cè)定不同的pH對(duì)CMC酶酶活反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖4.由圖4可以看出，纖維素酶活力剛開始隨著pH值的增大而下降，而后上升，最適反應(yīng)pH為6.0.此菌分泌的纖維素酶在pH 3.0～8.0均有酶活力，pH 8.0相對(duì)酶活仍為60%，說明此菌分泌的纖維素酶pH范圍廣泛，無論是酸性還是堿性條件都具有一定酶活力.

圖3 溫度對(duì)纖維素酶活力的影響Fig.3 Influence of enzyme activity from different temperatures

圖4 pH值對(duì)纖維素酶活力的影響Fig.4 Influence of enzyme activity from different pH

2.5.3 金屬離子對(duì)纖維素酶活力的影響

在上述最佳反應(yīng)溫度和最佳pH下測(cè)定酶活力，以未加金屬離子的酶活力定義為100%，計(jì)算加入不同金屬離子后的相對(duì)酶活力，結(jié)果見圖5.從圖5可知，Mg2+、Na+、K+和Ca2+對(duì)纖維素酶反應(yīng)具有促進(jìn)作用，其中Mg2+的促進(jìn)作用顯著，相對(duì)酶活力為205%；Zn2+、Cu2+和Mn2+對(duì)纖維素酶反應(yīng)具有抑制作用，而Mn2+的抑制作用最強(qiáng)，相對(duì)酶活力僅為44%.

3 討論

蝸牛是一種低脂肪、趨零膽固醇、含30多種人體有益酶和20多種氨基酸、具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值的高級(jí)保健品.中國學(xué)者首次報(bào)道從江西巴蝸牛中提取天螺多糖，并證實(shí)該多糖具有提高免疫力和明顯的體外抑制HBV病毒復(fù)制的生物活性[8].此外，蝸牛含有30多種混合酶素，蝸牛酶能降解幾丁質(zhì)內(nèi)切酶分解幾丁質(zhì)產(chǎn)物成單糖，但蝸牛腸道微生物種類和數(shù)量特別是降解纖維素的研究鮮有報(bào)道.

圖5 金屬離子對(duì)纖維素酶活力的影響Fig.5 Influence of enzyme activity from different metal ions

一些學(xué)者做過有關(guān)雜食性水產(chǎn)消化道產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌區(qū)系的研究[9]，消化代謝相關(guān)的功能微生物的報(bào)道越來越多.蝸牛作為一種草食性軟體生物，纖維素是其攝入的主要成分，因此，推斷蝸牛需要依靠腸道中能降解纖維素的細(xì)菌來輔助其消化纖維素提供營養(yǎng)，通過不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)，全面了解蝸牛腸道可培養(yǎng)微生物的數(shù)量和種類，并從中分離能夠產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌.

纖維素降解是一個(gè)需要多種酶協(xié)同作用的復(fù)雜過程，本研究以CMC-Na和濾紙為底物，僅僅檢驗(yàn)的是細(xì)菌產(chǎn)Cx和FPase的能力，因此，對(duì)蝸牛腸道纖維素降解細(xì)菌的全面研究需要運(yùn)用更多的底物來分析不同的纖維素酶.

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，剛果紅脫色圈直徑與菌落直徑的比值，和DNS法測(cè)得的酶活活性高低并沒相關(guān)性(圖1和表1)，表明僅用脫色圈直徑與菌落直徑的比值來評(píng)價(jià)纖維素酶活性的方法并不可靠.為了快速獲得更多的高效產(chǎn)酶菌株，在篩選纖維素酶時(shí)，建議先用簡(jiǎn)單方法(如剛果紅染色法)進(jìn)行初篩，再用稍微復(fù)雜但精確度較高的方法(如DNS法)進(jìn)行復(fù)篩.

研究表明S6菌粗酶液的Cx和FPase酶活力都最高，對(duì)溫度和酸堿度都有一定的耐性，有關(guān)該菌的生物學(xué)特性以及分類鑒定見后續(xù)的研究報(bào)告.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Composition of the intestinal bacteria and their cellulase characterization inCathaicafasciola

CHANG Yanping, TIAN Qifan, GUO Xin, LI Yanqin, YAN Leilei, LI Chunqing

(College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China)

In order to explore the functional microorganism, the intestinal culturable microflora inCathaicafasciolawere screened and cultured by several kinds of culture media, and the cellulase activity of the isolated bacteria and the characteristics of the crude cellulase that produced by strain S6 was studied.The results showed that the largest number of intestinal bacteria was up to 3.3×104CFU/mL in LB medium.Congo red staining showed that all the 7 dominant bacteria had the ability to secrete cellulase.The strain S6 had highest CMCase and FPase values of 5.96 and 2.84 U/mL, respectively.The CMCase characterization revealed that, the optimum reaction temperature was 35 ℃, the cellulose kept its high activity from 55 ℃to 75 ℃.The crude enzyme still had 60% of the highest obvious activation function at pH 8.0.Mg2+、Na+、K+and Ca2+had enhancing effect, and Zn2+、Cu2+and Mn2+had inhibitory action.To research the composition of the snail intestinal bacteria and separate high-yield cellulase strains is a new way for the cellulose biodegradation into renewable energy.

Cathaicafasciola; intestinal bacteria; enzyme producing capabilities; cellulose biodegradation

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.04.011

2016-12-27

河北大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目(2014-276)

昌艷萍(1969—)，女，湖北仙桃人，河北大學(xué)副教授，博士，主要從事微生物技術(shù)的研究. E-mail:yanpingchang@126.com

Q939.9

A

1000-1565(2017)04-0400-05