高佳琪，魏穎，屈玲霞，劉永巧，劉一冰，徐暾海＊＊，劉銅華

尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞IRS-1、Akt的影響＊

高佳琪1,2,3，魏穎1,2,3，屈玲霞1,2,3，劉永巧1,2,3，劉一冰1，徐暾海1,2,3＊＊，劉銅華2,3

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院北京100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100029）

目的：研究尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞胰島素關(guān)鍵信號(hào)IRS-1、Akt的基因、蛋白的影響。方法：以CCK-8法檢測(cè)HepG2細(xì)胞活性；采用人肝癌HepG2細(xì)胞，并用高濃度胰島素（10-6mol·L-1）培養(yǎng)HepG2細(xì)胞36 h，建立胰島素抵抗細(xì)胞模型。根據(jù)CCK-8法結(jié)果分為正常組（Control組）、模型組（IR組）、尖葉假龍膽乙酸乙酯部位IR+50 μg·mL-1組、IR+500 μg·mL-1組及二甲雙胍組，以葡萄糖試劑盒檢測(cè)葡萄糖消耗量。尖葉假龍膽乙酸乙酯部位給藥6 h后RT-PCR檢測(cè)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞IRS-1、Akt基因表達(dá)；尖葉假龍膽乙酸乙酯部位給藥6 h后，利用Western blot法檢測(cè)IRS-1、Akt的蛋白表達(dá)。結(jié)果：尖葉假龍膽乙酸乙酯部位濃度為500 μg·mL-1時(shí)，存活率達(dá)到95%。濃度高于500 μg·mL-1時(shí)，存活率下降；與IR組比較，IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組促進(jìn)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖的消耗量，但其作用不及鹽酸二甲雙胍組。給藥6 h后與IR組比較，IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組的RT-PCR檢測(cè)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞IRS-1、Akt的基因表達(dá)顯著升高，P＜0.01。給藥6 h后與IR組比較，IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組的Western blot法檢測(cè)IRS-1、Akt的蛋白表達(dá)顯著升高，P＜0.01。結(jié)論：尖葉假龍膽乙酸乙酯部位上調(diào)HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)IRS-1、Akt基因表達(dá)，以及IRS-1、Akt蛋白表達(dá)從而可能是其改善胰島素抵抗作用的機(jī)制。

尖葉假龍膽乙酸乙酯部位HepG2細(xì)胞胰島素抵抗胰島素信號(hào)

胰島素抵抗（Insulin Resistence,IR）是一種先于多種疾病狀態(tài)的病理狀態(tài)，包括高血壓、肥胖病、高血脂和2型糖尿病[1,2]。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的主要因素，在2型糖尿病發(fā)病中起重要作用。2型糖尿病嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，為了人類(lèi)健康與發(fā)揚(yáng)民族用藥我們做了本次研究。胰島素抵抗的特點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)失調(diào)和葡萄糖攝取不足，存在于許多組織和器官；在分子水平表現(xiàn)為胰島素與胰島素受體結(jié)合后信號(hào)傳導(dǎo)丟失，可以發(fā)生在肝臟、脂肪及骨骼肌組織中[3-5]。胰島素信號(hào)傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致葡萄糖利用率降低，被認(rèn)為是胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素[6]。HepG2細(xì)胞被廣泛用于葡萄糖代謝、脂類(lèi)代謝、胰島素抵抗等[7,8]。因此，本研究針對(duì)胰島素抵抗的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)選取HepG2細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞）作為模型細(xì)胞。

尖葉假龍膽Gentianella acuta為龍膽科Gentiananceae假龍膽Gentianella草本植物。全草入蒙藥，性涼、味苦。廣泛分布于中國(guó)內(nèi)蒙古、新疆、河北、山東、山西等省。具有清熱利濕的功效，常用于治療黃疸、頭痛、發(fā)熱等癥狀。民間多用于治療心臟病[9]?，F(xiàn)在藥理研究表明，尖葉假龍膽主要含有三萜、口山酮類(lèi)化合物[10,11]，其中口山酮類(lèi)化合物具有很好的抗糖尿病活性[12]。本研究以人肝癌HepG2細(xì)胞為模型，研究尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)其胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)基因、蛋白的影響,探討尖葉假龍膽乙酸乙酯部位改善胰島素抵抗的機(jī)制。

1 儀器和材料

1.1 儀器

HDL型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；HERA cell 150i CO2孵育箱（美國(guó)Thermo scientific公司）；IX71倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Sigma臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；Glomax multi酶標(biāo)儀（美國(guó)Promega公司）；R200D型分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽（美國(guó)BIO-RAD公司）；ABI Prism 7500PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；凝膠成像儀（美國(guó)BIORAD公司；ChemiDocTM XRS+with Image LabTM Software）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Corning公司）；青霉素-鏈霉素混合液（深圳市康杰爾生物科技有限公司，批號(hào)：151116）；胰蛋白酶-EDTA溶液（深圳市康杰爾生物科技有限公司，批號(hào)20161012）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（深圳市康杰爾生物科技有限公司，批號(hào)：150413）；胰島素（丹麥諾和諾德制藥股份有限公司，批號(hào)：J201000117）；鹽酸二甲雙胍（中國(guó)中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：AAA2857）；CCK-8（日本同仁化學(xué)研究所）；葡萄糖檢測(cè)試劑盒（上海Robio公司）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Corning公司）；96孔板（美國(guó)Corning公司）；GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒（美國(guó)Promega公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Biomiga公司）；IRS-1、Akt抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；β-actin抗體（北京普利萊基因技術(shù)有限公司、）；Blocking one（日本Nacalai Tesque公司）；Solution1(日本TOYOBO公司)；Solution2（日本TOYOBO公司）；10×TBST封閉洗滌緩沖溶液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；10×TBS封閉洗滌緩沖溶液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；分離膠緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；濃縮膠緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；葡萄糖檢測(cè)試劑盒（上海Robio公司）；RNA引物（上海生工生物工程股份有限公司合成）。

1.3 藥材與細(xì)胞

尖葉假龍膽：產(chǎn)于內(nèi)蒙古呼倫貝爾海拉爾為龍膽科假龍膽屬植物尖葉假龍膽(Gentianella acuta Hulten)的干燥全草（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定）。HepG2細(xì)胞人肝癌細(xì)胞株：北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位提取物制備

尖葉假龍膽3.5 kg全草。粉碎后，室溫下，加95%乙醇浸漬提取。至提取液呈微黃色，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至沒(méi)有醇味，得到95%乙醇濃縮液；藥材殘?jiān)?0%乙醇浸漬提取，至提取液呈微黃色；回收乙醇，濃縮至沒(méi)有醇味，得到70%乙醇濃縮液。將95%和70%乙醇濃縮液，分別加水懸浮，用乙酸乙酯萃取。合并，濃縮，凍干，得到乙酸乙酯部位提取物。

2.2 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)

將放于液氮中的HepG2細(xì)胞，快速在置于37℃水浴中5 min內(nèi)復(fù)蘇。馬上移入到含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基的細(xì)胞瓶中。置于孵育箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞融合到80%以上時(shí)，用PBS輕輕洗滌3次；加1 mL 0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，再加3 mL培養(yǎng)基停止消化。4℃，1 000 r·min-1，離心5 min；棄去原來(lái)的培養(yǎng)基加新培養(yǎng)基進(jìn)行吹打，形成細(xì)胞混懸液；移入至新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。每2天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK-8法細(xì)胞活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按每孔8 000個(gè)/mL密度接種于96孔板中，每孔100μL，每組6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁以后，設(shè)置空白對(duì)照組與藥物干預(yù)組。藥物干預(yù)組加無(wú)血清含藥DMEM高糖培養(yǎng)基的尖葉假龍膽乙酸乙酯部位，藥物終濃度分別為1 500、1 000、500、150、100、50 μg·mL-1。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，加藥24 h后，每孔加10 μL CCK-8，置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h后；取出置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)，波長(zhǎng)為450 nm，讀取吸光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率：

存活率=給藥組OD值/對(duì)照組OD值×100%

2.4 造模與分組給藥

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以8 000個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，每孔100μL，每組6個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞達(dá)到80%融合度時(shí)，移除舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌3次。設(shè)置Control組與IR組、IR+50 μg·mL-1與IR+500 μg·mL-1，IR組、IR+50 μg·mL-1與IR+500 μg·mL-1加含有10-6mol·L-1胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），Control組無(wú)胰島素，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h[12]。即為胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型。移除舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌3次；加入無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。

2.5 測(cè)定葡萄糖消耗量

按“2.4”項(xiàng)方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以8 000個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，每孔100μL，每組6個(gè)復(fù)孔。分組給藥24 h后，用PBS輕輕洗滌3次；加入無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。利用葡萄糖試劑盒進(jìn)行糖消耗量檢測(cè)。

2.6 RT-PCR基因檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL，每組3個(gè)復(fù)孔。分組給藥6 h后，HepG2細(xì)胞用PBS輕輕洗滌3次。依照RNA提取試劑盒提取RNA；測(cè)純度。然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，搖勻，室溫靜置5 min。退火25℃5 min，延伸42℃1 h，70℃滅活15 min，得到cDNA。每管20μL反應(yīng)體系：2μL cDNA稀釋液（1∶45）、10μL Mix反應(yīng)液、7.92μL無(wú)核酸水和0.08μL引物混合物（表1），置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min（共40次循環(huán)）；95℃15 s，60℃15 s溶解。

2.7 Western Blot蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL，每組3個(gè)復(fù)孔。分組給藥6 h后，用Homoginized Buffer提取總蛋白，加2×蛋白上樣緩沖液100μL，100℃煮沸5 min后蛋白變性。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白量。每孔20μg上樣量，預(yù)電泳90 V 5 min，電泳100 V 1.5 h，預(yù)先用轉(zhuǎn)膜液處理PVDF膜及濾紙45 min，再半干法凝膠轉(zhuǎn)膜0.2 A 50 min，膜在1×TBS中室溫?fù)u床中清洗2次，每次10 min；Blocking one封閉2 h。分別以IRS-1、Akt、β-actin抗體（1∶1 000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜?；厥找豢梗び?× TBST室溫?fù)u床中清洗3次，每次10 min；洗膜后加羊抗兔二抗（1∶20 000）室溫孵育1 h?；厥斩?，膜用1× TBST室溫?fù)u床中清洗3次，每次10 min；洗膜后加ECL發(fā)光液，避光反應(yīng)1 min，凝膠成像系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行成像。用Image J軟件進(jìn)行分析蛋白灰度。

表1 IRS-1、Akt、β-actin引物合成序列

圖1 尖葉假龍膽乙酸乙酯粗提物對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響

2.8 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)處理采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示。多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)；P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01有極顯著差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響

CCK-8（圖1）結(jié)果顯示：尖葉假龍膽乙酸乙酯部位濃度為500 μg·mL-1時(shí)，存活率達(dá)到95%；濃度低于500 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率趨近于100%；濃度超過(guò)500 μg·mL-1時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。且濃度越大，抑制作用越明顯。所以本實(shí)驗(yàn)選取500和50 μg·mL-1用來(lái)進(jìn)行改善胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的研究。

3.2 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

由表2可知，與Control組比較，IR組的葡萄糖消耗量明顯降低（P＜0.05），說(shuō)明IR組的HepG2細(xì)胞產(chǎn)生了胰島素抵抗作用。與IR組比較，鹽酸二甲雙胍組與IR+ 500 μg·mL-1組葡萄糖消耗量極顯著增大（P＜0.01），細(xì)胞葡萄糖消耗量分別增加了55.4%與22.9%，IR+50 μg·mL-1組葡萄糖消耗量明顯增大（P＜0.05）細(xì)胞葡萄糖消耗量增加了16.4%。

3.3 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)HepG2細(xì)胞IRS-1、Akt mRNA表達(dá)的影響

由表3可知，與IR組比較，Control組mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組表達(dá)也顯著上調(diào)（P＜0.05）。給藥濃度越大，mRNA表達(dá)越顯著，并呈現(xiàn)劑量依賴性上升。表明尖葉假龍膽乙酸乙酯部位能上調(diào)胰島素抵抗中信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵基因IRS-1、Akt的表達(dá)。

3.4 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)HepG2細(xì)胞IRS-1、Akt蛋白表達(dá)的影響

調(diào)節(jié)糖代謝的重要途徑之一是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路。其通路的關(guān)鍵蛋白IRS-1、Akt是其發(fā)揮作用的重要體現(xiàn)。由表4和圖2可知，與IR組比較，Control組IRS-1、Akt蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組IRS-1、Akt蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)（P＜0.05）。給藥濃度越大，蛋白表達(dá)越顯著，并呈現(xiàn)劑量依賴性上升。表明尖葉假龍膽乙酸乙酯部位能上調(diào)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白IRS-1、Akt。

4 討論

尖葉假龍膽乙酸乙酯部位中富集了大量的口山酮類(lèi)化合物[14]?，F(xiàn)代藥理研究表明，口山酮類(lèi)化合物具有抗糖尿病作用。Bellidifolin給藥后可以上調(diào)胰島素受體InsRα，IRS1，PI3K蛋白，表明Bellidifolin可能通過(guò)上調(diào)胰島素信號(hào)來(lái)改善胰島素抵抗來(lái)發(fā)揮作用[12]。Yan Liu等[15]研究表明口山酮類(lèi)化合物過(guò)氫鍵和π-π共軛與α-葡萄糖苷酶發(fā)生作用，來(lái)抑制α-葡萄糖苷酶活性來(lái)發(fā)揮降糖作用。現(xiàn)代藥理研究表明對(duì)尖葉假龍膽改善胰島素抵抗作用，其具體機(jī)理還尚不明確，需要進(jìn)一步對(duì)其機(jī)理進(jìn)行探究。胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立，為尖葉假龍膽改善胰島素抵抗作用提供有利的保障。因?yàn)楦闻K是糖代謝的主要是靶器官之一，所以選用人肝癌HepG2細(xì)胞作為細(xì)胞模型；采用高濃度胰島素(10-6mol·L-1)誘導(dǎo)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞36 h產(chǎn)生胰島素抵抗模型，以葡萄糖試劑盒檢測(cè)其對(duì)葡萄糖消耗量的影響，結(jié)果表明尖葉假龍膽乙酸乙酯部位促進(jìn)葡糖糖的消耗量。但其作用不及鹽酸二甲雙胍。本實(shí)驗(yàn)CCK-8法用來(lái)篩選安全有效的藥物濃度，結(jié)果提示500 μg·mL-1以下的濃度對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用并且細(xì)胞存活率大于95%，這為研究關(guān)鍵胰島素信號(hào)提供理論依據(jù)。

胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中的信號(hào)分子受到阻礙或者減弱，就會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗（IR）。IR是指外周組織和靶器官對(duì)內(nèi)和(或)外源性胰島素的反應(yīng)性和敏感性降低的一種代謝狀態(tài)，是2型糖尿病最主要的病理機(jī)制之一[16]。胰島素首先與胰島素受體（InsR）結(jié)合。InsR受體家族包括RS1、IRS2、IRS3等許多亞型，研究顯示，IRS1上Ser/Thr磷酸化活性的變化是其中重要環(huán)節(jié)之一；IRS1上Ser位點(diǎn)磷酸化主要作為一種生理的負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制IRS1的活性，與IR的發(fā)生有密切關(guān)系。Akt是PI3K信號(hào)通路下游的重要靶蛋白，也與胰島素抵抗有著密切的聯(lián)系[17]。在尖葉假龍膽乙酸乙酯部位干預(yù)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞6 h后檢測(cè)IRS1、Akt的基因表達(dá)與蛋白水平。發(fā)現(xiàn)尖葉假龍膽乙酸乙酯部位IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組都能上調(diào)IRS1、Akt的基因與蛋白水平，并且呈現(xiàn)劑量依賴性上調(diào)。表明尖葉假龍膽乙酸乙酯部位可能調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵因子，從而改善胰島素抵抗的作用。

表2 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（xˉ±s，n=6）

表3 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)HepG2細(xì)胞IRS-1、Akt mRNA表達(dá)的影響（xˉ±s，n=3）

圖2 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞IRS-1、Akt蛋白表達(dá)的影響

表4 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)HepG2細(xì)胞IRS-1、Akt蛋白表達(dá)的影響（xˉ±s，n=3）

綜上所述，尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)有顯著影響，上調(diào)IRS-1、Akt信號(hào)因子可能改善胰島素作用。本研究為尖葉假龍膽在抗糖尿病領(lǐng)域提供一定的理論基礎(chǔ)，為追蹤分離尖葉假龍膽中的主要活性成分提供科學(xué)依據(jù)，深入的研究機(jī)理仍然缺乏，尖葉假龍膽改善胰島素抵抗作用的機(jī)理研究有待于進(jìn)一步探究。

1Cordain L,Eades M R,Eades M D,et al.Hyperinsulinemic diseases of civilization:More than just Syndrome X.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol,2003,136(1):95112.

2Xie W,Wang W,Su H,et al.Effect of ethanolic extracts of Ananas comosus L.leaves on insulin sensitivity in rats and HepG2.Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol.2006,143(4):429435.

3Mu J,Brozinick J T Jr,Valladares O,et al.Arole for AMP-activated protein kinase incontraction and hyproxia-regulated glucose transport in skeletal muscle.Mol Cell,2001,7(5):1085-1094.

4Ryder J W,Chibalin A V,Zierath J R.Intracellular mechanisms underlying increases in glucose uptakeinresponsetoinsulin orexercrises in skeletal muscle.Acta physicol scand,2001,171(3):249-257.

5Bouzakri K,Koistinen HA,Zierath JR.Molecular mechanisms of skeletal muscle insulin resistance in type 2 diabetes.Curr Diabetes Rev, 2005,1(2):167-174.

6Onoue T,Goto M,Tominaga T,et al.Reactive oxygen species mediate insulin signaltransduction in mouse hypothalamus.Neurosci Lett,2016, 619(4):1-7.

7Kahn S E,Hull R L,Utzschneider K M.Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.Nature,2006,444(7121):840-846.

8Samuel V T,Shulman G I.Mechanisms for insulin resistance:Common threads and missing links.Cell,2012,148(5):852-871.

9烏尼爾,春亮,哈斯巴根.內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)鄂溫克族民間藥用植物調(diào)查.中國(guó)野生植物資源,2008,27(06):27-29+43.

10李旻輝,靳敏,張海濤,等.尖葉假龍膽化學(xué)成分研究.包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,27(02):13-14.

11 Lv L J,Li M H.Terpenoids,flavonoids and xanthones from Gentianella acuta(Gentianaceae).Biochem Syst Ecol,2009,37(4):497-500.

12Tian L Y,Bai X,Chen X H,et al.Anti-diabetic effect of methylswertianin and bellidifolin from Swertia punicea Hemsl.and its potential mechanism.Phytomedicine,2010,17(7):533-539.

13張汝學(xué),賈正平,李茂星,等.體外胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立及在藥物篩選中的應(yīng)用.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2008,24(7):971-976.

14劉洋洋.尖葉假龍膽乙酸乙酯部位化學(xué)成分研究及含量測(cè)定.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文,2015.

15 Liu Y,Ma L,Chen W H,et al.Bing Mechanism and Synergetic Effects of Xanthone Derivatives as Noncompetiitive α-Glucosidase Inhibitors: A Theorertical and Experimental Study.J Phys Chem B,2013,117(43): 13464-13471.

16 Pessin J E,Saltiel A R.Signaling pathways insulin action:molecular targets of insulin resistance.J Clin Invest,2000,106(2):165-169.

17 Saltiel A R,Pessin J E.Insulin signaling pathways in time and space. Trends Cell Biol,2002,12(2):65-71.

Effects of EthylAcetate Extracts of Gentianella acuta on IRS-1 andAkt in Insulin Resistance HepG2 Cells

Gao Jiaqi1,2,3,Wei Ying1,2,3,Qu Lingxia1,2,3,Liu Yongqiao1,2,3,Liu Yibing1,Xu Tunhai1,2,3,Liu Tonghua2,3
(1.School of Chinese materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Beijing Key Laboratory on Traditional Chinese Medicine Health Cultivation,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 3.Key Laboratory on Traditional Chinese Medicine Health Cultivation of the Ministry of Education,Beijing 100029,China)

This paper was aimed to study the effect of ethyl acetate extracts of Gentianella acuta on the gene and protein of insulin significant signal IRS-1 and Akt in insulin resistance(IR)HepG2 cells.The CCK-8 method was used to detect the HepG2 cell activity.HepG2 cells of human liver cancer were cultured with high concentration insulin(10-6mol·L-1)for 36 hours to establish IR cell model.According to the results of CCK-8,the control group,model(IR)group,ethyl acetate extracts of Gentianella acuta IR+50 μg·mL-1,IR+500 μg·mL-1group,and the metformin group were divided. Glucose consumption was measured with a glucose assay kit.The expressions of IRS-1 and Akt gene in IR HepG2 cells were detected by RT-PCR after 6-hour using of ethyl acetate extracts of Gentianella acuta.Western blot was used to detect the expression of IRS-1 and Akt protein after 6-hour using of ethyl acetate extracts of Gentianella acuta.The results showed that when the concentration of ethyl acetate extracts of Gentianella acuta was 500 μg·mL-1,the survival rate reached 95%.When the concentration was higher than 500 μg·mL-1,the survival rate decreased.Compared with the IR group,the IR+50 μg·mL-1group and the IR+500 μg·mL-1group promoted glucose consumption of IR HepG2 cells, but its effect was less than that of the metformin hydrochloride group.The expression of IRS-1 and Akt in IR HepG2 cells was significantly increased by using RT-PCR in the group of IR+50 μg·mL-1and IR+500 μg·mL-1compared with the IR group after 6-hour using of ethyl acetate extracts of Gentianella acuta.The expression of IRS-1 and Akt protein in the group of IR+50 μg·mL-1and IR+500 μg·mL-1was significantly higher than that in the IR group after 6-hour medication detected by western blot.It was concluded that the ethyl acetate extracts of Gentianella acuta can increase the expression of IRS-1,Akt gene,the expression of IRS-1 and Akt protein in HepG2 cells,which may be the mechanism of IR improvement.

Ethyl acetate extracts of Gentianella acuta,HepG2 cells,insulin resistance,insulin signal

10.11842/wst.2017.05.011

R96

A

（責(zé)任編輯：陳寧，責(zé)任譯審：王晶）

2017-04-19

修回日期：2017-05-18

＊科學(xué)技術(shù)部國(guó)際科技合作項(xiàng)目（2010DFB33260）：中醫(yī)藥干預(yù)治胰島素抵抗創(chuàng)新中藥研究，負(fù)責(zé)人：徐暾海；北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)-中醫(yī)藥干預(yù)糖尿病及其并發(fā)癥研究團(tuán)隊(duì)（2011-CXTD-19），負(fù)責(zé)人：劉銅華。

＊＊通訊作者：通訊作者：徐暾海，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥活性成分及質(zhì)量控制研究。