梁麗喆，李國信，于雪峰

中藥0期臨床藥效學(xué)試驗探索＊

梁麗喆，李國信＊＊，于雪峰＊＊

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院沈陽110034）

目的：以舒血寧注射液為研究對象，探索中藥開展0期臨床藥效學(xué)試驗的可行性。方法：確立適合中藥0期（早期）臨床評價的關(guān)鍵技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。按照所建立的研究方法，進行健康受試者低劑量舒血寧注射液體內(nèi)給藥，收集給藥前和給藥后血清，進行人主動脈內(nèi)皮細胞模型損傷的體外實驗，并以臨床給藥劑量的血液樣本為對照，驗證低劑量用藥與臨床劑量用藥的藥效學(xué)趨勢一致性。結(jié)果：在過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷實驗中，低劑量舒血寧注射液含藥血清能夠影響細胞增殖，保護細胞形態(tài)，減少細胞損傷所導(dǎo)致的離子釋放以及細胞上清分泌，轉(zhuǎn)錄組差異表達具有藥效學(xué)趨勢。結(jié)論：與臨床給藥組相比，低劑量給藥具有大致相同的藥理活性趨勢，中藥0期臨床藥效學(xué)試驗具有可行性。

中藥0期臨床試驗藥效學(xué)舒血寧注射液

中藥作為天然藥物，具有多組分、多途徑、多靶點等的特點，組分與靶點間的關(guān)系相互交叉，故在單味中藥甚至方劑配伍的療效研究中，探尋明確的作用機制相對困難[1-3]。隨著中藥現(xiàn)代化進程的推進，中藥新藥研發(fā)偏重于提取有效組分并且劑型西化，而組分中藥能否替代單味中藥或者處方所具備的療效，成為中醫(yī)界亟需解釋和解決的問題。西藥0期臨床試驗，以小樣本、小劑量、短時間的方式在人體進行臨床前試驗，中藥若能借鑒其“探索”思路，在新藥研發(fā)初期，從微觀角度進行人體的藥效機制評價，將會拓寬中藥新藥優(yōu)選途徑，節(jié)約時間、經(jīng)費和人力[4，5]。本研究與西藥0期臨床試驗設(shè)計進行類比，擬定適合中藥的0期（早期）臨床評價方法，并以舒血寧注射液的示范性臨床試驗，對所建立方法進行驗證。

1 方法學(xué)建立

1.1 藥物選擇

西藥0期臨床試驗多數(shù)應(yīng)用于腫瘤等沒有治療藥物或治療方案不合理的疾病，藥物具備治療窗寬、靶點明確、生物標(biāo)記確證等特性[6]；中藥吸收代謝過程復(fù)雜，明確的藥效機制探討僅見于個別成分，選擇符合中藥開展0期（早期）臨床試驗的藥物特點如下：①代謝途徑相對簡單：以靜脈給藥的中藥注射劑為宜，作為代謝途徑相對單一的中藥成藥，其直接入血，現(xiàn)代藥理研究相對簡單；②成分種類相對分明：選擇成分種類分明（如黃酮、內(nèi)酯類、生物堿）的藥物進行試驗，按每種成分的主要藥效作用分別進行機制探討；③生物標(biāo)記相對確切：采用對其主要成分有足夠研究基礎(chǔ)的藥物，從文獻中獲得用于該藥物藥效學(xué)檢測的常用生物標(biāo)記物、藥物作用靶點以及相應(yīng)檢測方法，既可以對試驗設(shè)計的科學(xué)性進行支撐，也能為臨床驗證提供便利。

1.2 試驗設(shè)計

西藥0期臨床試驗是在藥物開發(fā)早期，于較短時間內(nèi)在少量目標(biāo)患者（不超過30人）進行結(jié)構(gòu)類似化合物的臨床研究，為從眾多類似物中挑選出最佳候選藥物提供理想平臺[7]。針對中藥成分在體內(nèi)代謝復(fù)雜的狀況，本研究將西藥0期臨床試驗設(shè)計與中藥特有的血清藥理學(xué)方法相結(jié)合，進行健康受試者體內(nèi)給藥后的體外誘導(dǎo)損傷試驗，模擬藥物在患者體內(nèi)代謝情況。通過檢測給藥前后含藥血清作用下的細胞生物標(biāo)記物變化，進行藥效機制探討，既避免了患者不能耐受小劑量給藥，及健康受試者不能體現(xiàn)藥物療效的尷尬局面，又在一定程度上減輕倫理壓力，在動物血清藥理學(xué)實驗的基礎(chǔ)上更進一步。

1.3 指標(biāo)選擇

西藥0期臨床藥效試驗根據(jù)藥物成分及作用特點，對起效靶點及能夠反應(yīng)療效的生物標(biāo)記物，采用芯片、放射元素跟蹤等方式進行作用機制通路內(nèi)的敏感指標(biāo)檢測[8，9]。中藥藥效作用相互交叉，故本研究采取復(fù)雜問題簡單化的處理方式，將中藥按照其效應(yīng)成分的主要功能分類進行體外損傷誘導(dǎo)，再利用損傷后的血液樣本及靶向細胞，進行較為公認的體外藥效指標(biāo)檢測和全序列轉(zhuǎn)錄組基因測序，以此完成對多組分、多靶點的中藥療效的微觀的、全面的探討。

2 示范性試驗

舒血寧注射液是從銀杏葉中提取并制備的滅菌水溶液包括內(nèi)酯類（銀杏內(nèi)酯A，B，C，白果內(nèi)酯）和黃酮類成分，具有較為明確的抗氧化、抗血小板聚集等作用，臨床常用于缺血性心腦血管疾病[10,11]。本文以低劑量舒血寧注射液的健康受試者含藥血清干預(yù)H2O2誘導(dǎo)損傷的人主動脈內(nèi)皮細胞，并與臨床給藥劑量組對照，比較其療效趨勢，探索中藥開展早期臨床藥效學(xué)評價的可行性[12]。

2.1 材料與方法

2.1.1 試驗受試者與細胞

8名健康志愿者，男女各半，年齡20-45歲，體重指數(shù)19-24（BMI=體重kg/身高cm2）；心電圖、血尿常規(guī)、凝血、肝腎功能等檢查指標(biāo)均在正常范圍；無煙、酒嗜好；獲取知情同意并志愿受試。人主動脈血管內(nèi)皮細胞株（HAEC）由中國醫(yī)科大學(xué)提供。

2.1.2 主要儀器與試藥

JEM-1200EX透射電鏡（日本電子株式會社）；激光共聚焦掃描顯微鏡（德國Leica公司）。

舒血寧注射液（黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，5 mL/17.5 mg，批號：B20140907）；1640培養(yǎng)基、PAN胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗（美國Hyclone公司）；細胞毒性檢測試劑盒、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽、Fluo-3/AM（美國Sigma公司）；酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法試劑盒（瑞士羅氏公司）。

2.2 含藥血清制備

8名受試者分為低劑量試驗組和臨床劑量對照組，每組4人。分別將臨床給藥劑量的1/6.25（11.2 mg）和臨床給藥劑量（70 mg）的舒血寧注射液添加至250 mL葡萄糖注射液中，每天早晨用藥前1 h統(tǒng)一進食，隨后按一定滴速靜脈滴注，2 h靜點完畢，每天1次，連續(xù)給藥7天。末次給藥結(jié)束時從肘靜脈取血10 mL，置于促凝試管中，離心得血清，56℃水浴滅活，微孔濾膜過濾除菌后，裝凍存管-80℃冰箱保存。

2.3 細胞培養(yǎng)及分組

人主動脈血管內(nèi)皮細胞株（Human Aorta Endothe?lial Cells,HAEC）常規(guī)復(fù)蘇，90%貼壁時進行1：2傳代。實驗設(shè)空白組（細胞+空白血清）、模型組（細胞+空白血清+H2O2）、低劑量試驗組（細胞+低劑量含藥血清+H2O2）、臨床劑量試驗組（細胞+臨床劑量含藥血清+H2O2）。以0%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、50%的血清體積分數(shù)考察最佳空白血清添加量，每組設(shè)6個復(fù)孔。

2.4 過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的HAEC細胞，2×108/L的密度100 μL接種于96孔板內(nèi)，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，不同的96孔板分別加入濃度為100、200、300、400、500、600 μmol·L-1的H2O2共同培養(yǎng)24 h。終止培養(yǎng)后，每孔加入MTT溶液10 μL，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄液加DMSO 100 μL，避光搖床10 min，于酶標(biāo)儀上測定各孔A492處的OD值。

2.5 細胞實驗樣本處理

以2×108/L的密度種板，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，以含相應(yīng)濃度的空白及含藥血清的條件培養(yǎng)基預(yù)處理2 h，加入相應(yīng)濃度H2O2，再次孵育24 h，按照檢測試劑要求，對細胞及細胞上清液進行收樣。

2.6 增殖能力測定

終止培養(yǎng)后，每孔加入MTT溶液10 μL，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄液加DMSO 100 μL，避光搖床10 min，于酶標(biāo)儀上測定各孔A492處的OD值。

2.7 細胞凋亡流式檢測

6孔板培養(yǎng)細胞，終止后胰酶消化收集，離心后PBS清洗，100 μL 1×binding buffer避光染色15 min（含Annexin V和PI各5 μL），作單染和空白對照，加入400 μL 1×bindingbuffer，過濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移至流失管中待測。

2.8 吖啶橙染色

96孔板培養(yǎng)細胞，終止后PBS清洗，將AO和EB溶液按1∶1混合制備工作液，2%比例PBS稀釋后，每孔加入100 μL，5 min后鏡下觀察染色情況。

2.9 鈣離子濃度測定

終止培養(yǎng)后HBSS溶液3次清洗，每孔加入稀釋的Fluo 3-AM工作液以覆蓋細胞為度；細胞培養(yǎng)箱孵育30 min，去液并用HBSS溶液清洗以充分去除工作液。每孔加入HBSS溶液以覆蓋細胞，培養(yǎng)箱孵育約20 min后，用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測細胞，激發(fā)波長480-500 nm，發(fā)射波長525-530 nm。

2.10 細胞骨架鬼筆環(huán)肽染色

96孔板培養(yǎng)細胞，終止后PBS清洗，每孔加入100 μL 4%多聚甲醛覆蓋，室溫固定30 min；PBS洗3遍，加入100 μL打孔液5 min；熒光洗液清洗、封閉；1∶1 000稀釋Alexa Fluor 546 phalloidin染色，清洗4次；1∶600稀釋DAPI染色劑，清洗4次；棄液，加入50 μL防熒光猝滅封片劑，封口膜封好，4℃保存待測。

2.11 透射電鏡檢測

6孔板培養(yǎng)細胞，終止后胰酶消化收集，加2.5%戊二醛固定。經(jīng)漂洗，脫水，浸透，包埋，聚合，超薄切片，醋酸鈾檸檬酸鉛染色，于透射電鏡下觀察攝片。

2.12 細胞分泌功能測定

終止培養(yǎng)后，采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA）對各組細胞培養(yǎng)液上清中NO、SOD和MDA含量進行檢測，采用放射免疫法檢測ET。ELISA過程嚴格按照試劑盒中說明書步驟進行。

2.13 全轉(zhuǎn)錄組RNA測序

對于低劑量試驗組的空白血清和含藥血清進行6孔板培養(yǎng)細胞，終止后胰酶消化收集，加入裂解液后凍存待測

2.14 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計描述和分析，計量資料用（xˉ±s）表示，多組間差異性比較采用ANOVA，兩兩比較采用LSD，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同添加量空白血清對內(nèi)皮細胞活力的影響

結(jié)果顯示：15%的血清濃度對內(nèi)皮細胞的增殖無明顯抑制或促進作用，最接近常規(guī)培養(yǎng)，為理想條件（圖1）。

3.2 不同濃度過氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞模型建立的結(jié)果

圖1 不同添加量血清對內(nèi)皮細胞毒性損傷OD值變化

圖2 不同濃度過氧化氫對內(nèi)皮細胞毒性損傷OD值變化

表1 各組血清對細胞增殖活性O(shè)D值的影響

由圖2可見，細胞活力隨H2O2濃度的升高而受到抑制，當(dāng)H2O2濃度為300 μmol/l，作用24 h時，細胞損傷率接近50%，考慮為理想造模條件。

3.3 舒血寧注射液含藥血清對細胞增殖活性的影響

由表1結(jié)果顯示：與模型對照組相比，含藥血清組均能改善細胞的增殖能力，且隨藥物劑量的增加，呈遞增趨勢?？瞻讓φ战M與臨床劑量給藥組P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.4 細胞凋亡流式檢測

圖3顯示，模型組HAEC發(fā)生顯著凋亡，14.7%早凋，66.6%晚凋，凋亡發(fā)生率81.3%；低劑量試驗組血清干預(yù)后，晚凋下降至27.9%；臨床劑量試驗組早凋和晚凋均顯著減少，試驗組凋亡發(fā)生率分別為54.4%和23.2%。

3.5 吖啶橙染色

由圖4可見，模型組出現(xiàn)明顯凋亡，其中綠色熒光聚集和染色增強，提示早凋發(fā)生，個別細胞核有橘紅色熒光，提示晚凋；在給予低劑量血清預(yù)先處理后，晚凋細胞明顯減少；臨床劑量試驗組進一步緩解了凋亡情況，表現(xiàn)為細胞核染色較淺，細胞間染色均勻。

3.6 鈣離子濃度測定

由圖5結(jié)果所示：與空白組比較，模型組鈣離子熒光強度明顯增強，舒血寧注射液含藥血清的干預(yù)，可以使鈣離子熒光強度降低，具有藥物濃度依賴性。

3.7 細胞骨架鬼筆環(huán)肽染色

由圖6結(jié)果所示：空白組細胞骨架呈絲網(wǎng)狀排列，清晰有序；模型組細胞形態(tài)皺縮排列紊亂，微絲減少或缺失；含藥血清干預(yù)后，細胞形態(tài)趨于規(guī)則，隨血清中藥物含量增加，細胞骨架呈絲網(wǎng)狀排列清晰可見。

圖3 細胞凋亡的流式檢測

圖4 吖啶橙染色

圖5 各組細胞鈣離子濃度測定（×400）

圖6 各組細胞鬼筆環(huán)肽染色（×400）

圖7 各組內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)（×15 000）

圖8 各組內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)（×30 000）

3.8 電鏡檢測

由圖7和圖8結(jié)果所示：空白組細胞核呈橢圓形，核膜核仁清楚，染色質(zhì)分布均勻，胞質(zhì)內(nèi)見溶酶體、線粒體、核糖體、高爾基復(fù)合體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及脂滴等細胞器。模型組細胞核形狀不規(guī)則，核膜模糊，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚，胞質(zhì)小面積溶解，胞質(zhì)內(nèi)細胞器減少。舒血寧注射液含藥血清干預(yù)后，細胞微觀結(jié)構(gòu)改善，隨著血清含藥量升高，細胞核逐漸清晰，胞質(zhì)內(nèi)細胞器逐漸增多。

3.9 細胞分泌功能測定

由表2可見，與模型組相比，試驗組均能不同程度降低細胞內(nèi)ET和MDA含量，提高NO和SOD活性，且隨血清濃度的增加呈遞進趨勢。

3.10 全轉(zhuǎn)錄組RNA測序

由表3、表4可見，低劑量試驗組含藥血清干預(yù)前后（較模型組而言），基因表達和基因表達趨勢均出現(xiàn)差異，與本藥物已有文獻對照，該差異符合藥物已知功能。

表2 不同組別血清作用下細胞MDA、SOD、NO、ET水平釋放

表3 試驗組給藥前后轉(zhuǎn)錄組基因表達差異（Enrichment_Analysis）

表4 試驗組給藥前后轉(zhuǎn)錄組基因表達差異趨勢（GREAT_Analysis）

4 討論

中藥在長期的臨床應(yīng)用中，已經(jīng)具備了明確的功效分類，大量的現(xiàn)代藥理研究也為中藥作用機制進行了有力補充[13,14]。在中藥提取物的新藥研發(fā)過程中，利用基因、蛋白組學(xué)對差異性測序結(jié)果進行解析，以及不為組分與靶點間錯雜的對應(yīng)關(guān)系所牽制，選擇現(xiàn)代文獻中該味或類似中藥相關(guān)起效靶點作為檢測指標(biāo)，是中藥早期臨床評價中對于藥效機制判定的兩種候選方法[15,16]。

考慮到開展中藥早期臨床評價倫理審批的特殊性和療效評價指標(biāo)的敏感性，本研究以上市中藥舒血寧注射液為示范，將健康受試者的含藥血清作用于受損靶細胞，模擬疾病人群用藥后的細胞狀態(tài)，在前期的藥代動力學(xué)探索基礎(chǔ)上，確定藥效試驗的給藥劑量和采血時間，對藥物主要的效應(yīng)成分（黃酮類）的主要功能（抗氧化作用）進行相應(yīng)的體外誘導(dǎo)（H2O2損傷），結(jié)合透射電鏡、放射免疫法、轉(zhuǎn)錄組測序等高敏感性檢測方法，對低劑量中藥的藥效學(xué)進行綜合評價，同時，兩個劑量組大致相同的藥效學(xué)趨勢表明，中藥早期臨床評價具有可行性。

1金少華.中藥西藥化與西藥中藥化探討.中國實用醫(yī)藥,2008,3(26): 173-174.

2李野,楊悅.中藥研發(fā)的路徑選擇.中國藥房,2005,16(11):815-816.

3葉崢嶸,吳琳.對“西藥中藥化”的思考.中華中醫(yī)藥雜志,2012,27 (10):2616-2617.

4U S Department of Health and Human Services Food and Drug Adminis?tration Center for Drug Evaluation and Research(CDER).Guidance for industry,investigators,and reviewers exploratory IND studies,2006．

5Kinders R,Parchment R E,Ji J,et al,Phase 0 clinical trials in cancer drug development:from FDA guidance toclinical practice.Mol Interv, 2007,7(6):325-334．

6FDA.Exploratory IND studies.http://www.fda.gov/Drugs/default.htm.

7EMEA.Concept paper on the development of a CHMP guideline on the non-clinical requirements to support early phase I clinical trials with pharmaceutical compounds.

8EMEA.Position paper on non-clinical safety studies to support clinical trials with a single microdose.2014.

9ICH M3(R2).Guidance on non-clinical safety studies for the conduct of human.clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals (step 5).2014.

10任艷萍.中藥矮地茶質(zhì)量控制與體內(nèi)代謝及舒血寧注射液的多組分測定與藥動學(xué)研究.石家莊:河北醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2013.

11王世偉,張小慧.中藥注射劑的不良反應(yīng)現(xiàn)狀及注意事項.中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2011,8(4):118-120.

12林圓圓,杜武勛,張少強等.基于血清藥理學(xué)的中藥復(fù)方時效關(guān)系研究.中醫(yī)雜志,2013,54(14):1175-1178.

13麥景標(biāo),馮儉,孫川,等.中藥新藥研發(fā)的新模式.湖北中醫(yī)雜志, 2011,33(5):73-74.

14李朋收,時曉娟,劉洋洋,等.中藥復(fù)方效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究及展望.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2014,16(9):108-113.

15金磊.中藥研究開發(fā)的現(xiàn)狀及對未來發(fā)展的思考.中國醫(yī)藥科學(xué), 2011,1(18):32-33.

16周娜.中西醫(yī)的碰撞.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2015,11(17):1-2.

Abstract:Shu-Xue-Ning(SXN)injection was used as study subject in order to explore the feasibility of pharmacodynamics experiment of Phase 0 clinical trial in Chinese materia medica(CMM).This paper tried to establish key-technique standards which fit to the evaluation on CMM phase 0(early)clinical evaluations.According to the established research methods,this research selected volunteers and assured low dose SXN injection inside their body.And then,serum before and after medication were collected for the HAEC in vitro experiment.Blood sample of the clinical dosage was used as control to verify the tendency consistency of pharmacodynamics in low dose and clinical dose.The results showed that in the H2O2inducing HAEC damage experiment,low dose SXN injection can affect the cell proliferation,protect the shape of cells,reduce the release of ion owing to cell damages and influence the secretion in cells.Complete-sequence RNA gave differential multiterm expression before and after the low dose.It was concluded that compared with the clinical group,low dose medication had similar metabolic tendency.The pharmacodynamics experiment of phase 0 CMM clinical trial is feasible.

Exploratory on Phase 0 Clinical Pharmacodynamics Trial in Chinese Materia Medica

Liang Lizhe,Li Guoxin,Yu Xuefeng
(The Second Affiliated Hospital to Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110034,China)

Chinese materia medica,phase 0 clinical trial,pharmacodynamics Shu-Xue-Ning injection

10.11842/wst.2017.05.024

R969

A

（責(zé)任編輯：陳寧，責(zé)任譯審：王晶）

2017-05-12

修回日期：2017-05-20

＊科學(xué)技術(shù)部國家“十二五”重大新藥創(chuàng)制項目（2012ZX09303-017）：中藥新藥臨床評價研究技術(shù)平臺，負責(zé)人：李國信；遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目（2015225015）：肺系重大疾病中醫(yī)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)規(guī)范化研究，負責(zé)人：李國信。

＊＊通訊作者：李國信，博士，主任醫(yī)師，主要從事中藥新藥研究；于雪峰，碩士，主任醫(yī)師，主要從事肺病中藥研究。