陳浩，鄧悅

冠心病心絞痛代謝組學的證候客觀化研究＊

陳浩，鄧悅＊＊

（長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院長春130021）

目的：利用代謝組學技術檢測冠心病心絞痛中醫(yī)證候中的潛在生物標志物，探討冠心病心絞痛不同證型的客觀化規(guī)律。方法：選取健康組、冠心病心絞痛患者氣虛血瘀證和氣虛血瘀痰濁證，應用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）的方法，檢測健康組和不同中醫(yī)證型的血清、尿液的內(nèi)源性代謝物，通過主成分分析（PCA)和正交信號校正偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）的方法分析其代謝譜。結果：在PCA分析中，健康組和氣虛血瘀組、氣虛血瘀痰濁組之間可以明顯的區(qū)分開來；氣虛血瘀證型的潛在生物標志物有天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亞磺酸；氣虛血瘀痰濁證型的潛在生物標志物有馬尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺、甘油三酯；氣虛證型客觀化的表現(xiàn)為缺少生物素、賴氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨膽酸。結論：通過代謝組學這項新技術，探討出冠心病心絞痛氣虛血瘀證型、氣虛血瘀痰濁證型的不同內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，為臨床不同中醫(yī)證型的預防、診治提供思路。

中醫(yī)證型代謝組學液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用氣虛血瘀證氣虛血瘀痰濁證

代謝組學作為新興的系統(tǒng)生物學技術已經(jīng)被各學者廣泛應用于中醫(yī)藥領域的研究中，它具有終點放大的特點并且可以從網(wǎng)絡終端表象的整體角度反映生物體的功能水平，與中醫(yī)學的整體觀念相近，因此，代謝組學技術的引進和利用為中醫(yī)證候的客觀化提供了嶄新的平臺[1]。另一方面，嚴重威脅人類健康的冠心病具有病情重，病位深，病程長，且多反復發(fā)作、正氣多虛、臟腑多損等特點。人們意識到，如果能在器質(zhì)性疾病形成之前及早的預防，或是延緩病情的發(fā)生發(fā)展，將會有效的降低冠心病乃至心血管事件鏈的死亡率。現(xiàn)代學者對冠心病中醫(yī)證型的分布規(guī)律做了相關研究，如吳氏等[2]在對116例住院患者的證候進行調(diào)查分析后得出實證（68.94%）明顯多于虛證，實證中以血瘀（36.2%）、痰濁（30.2%）最常見；而張氏等[3]在對1989-2004年公開發(fā)表于國內(nèi)各學術斯刊上的425篇學術論文的18 698例病例進行了分析，總結出常見的主要證型，發(fā)作期以實證表現(xiàn)突出，實邪主要為血瘀、寒凝、痰濁、氣滯4類，血瘀是本病的主要實邪；虛證之中以心氣虧虛證最多。本研究在冠心病心絞痛中醫(yī)證候流行病學調(diào)查研究中，選取吉林省三家中醫(yī)院2014年9月至2015年9月住院或門診的冠心病心絞痛患者600例，對這600例患者進行了單因素、雙因素、三因素統(tǒng)計學調(diào)查，發(fā)現(xiàn)雙因素證型中氣虛血瘀和痰瘀互結型分別位居第一、第二位，而三因素證型中氣虛血瘀痰濁證型位居首位；根據(jù)以上結論，利用代謝組學中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的技術，分析冠心病心絞痛不同證型間的尿液、血清的代謝產(chǎn)物，探尋中醫(yī)證候的客觀化規(guī)律，為冠心病心絞痛的有效防治提供參考和依據(jù)。

1 病例標本

1.1 一般資料

健康人來源于長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院體檢確定其身體健康的志愿者，病理組來源于長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院部的患者（表1）。所有患者都符合相應的中西醫(yī)診斷標準和中醫(yī)診斷標準。

表1 不同組別病例數(shù)

1.2 診斷標準

西醫(yī)診斷標準參照1979年國際心臟病學會及世界衛(wèi)生組織臨床命名標準化聯(lián)合專題報告《缺血性心臟病的命名及診斷標準》以及2010年《穩(wěn)定型冠心病診治指南》制定冠心病心絞痛的診斷。中醫(yī)診斷標準參照中國中西醫(yī)結合學會心血管學會1990年10月修訂《冠心病中醫(yī)辨證標準》。

2 樣品取材與預處理

受試者取清晨空腹尿液10 mL，3 000 r·min-1離心10 min后，取上清分裝至-80℃冰箱保存；患者采血前1天素食，次日清晨經(jīng)肘靜脈抽取受試者空腹12 h靜脈血2-3 mL,室溫下經(jīng)3 000 r·min-1離心后10 min后，取血清至-80℃冰箱保存；健康人同上。統(tǒng)一送至長春應用化學研究所進行代謝組學尿液及血清檢測。

3 數(shù)據(jù)采集與分析

尿液和和血清檢測均使用Waters Acquity UPLC液相色譜系統(tǒng)、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS質(zhì)譜儀和Wa? ters CQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm,2.1×50 mm）進行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用進行數(shù)據(jù)采集。數(shù)據(jù)分析均使用EZinfo 2.0軟件中的PCA和OPLS-DA進行多元變量分析。使用SPSS17.0軟件進行組間獨立樣本方差檢驗。使用生物學數(shù)據(jù)庫，如HMDB(http://www.hmdb. ca/)進行生物標志物的鑒定和代謝通路的分析。

4 結果

4.1 尿液PCA分析結果（圖1）

4.2 血清PCA分析結果（圖2）

在PCA得分圖中每一個點代表一個樣品，每個樣品的位置由其自身的代謝決定，處于相同生理病理的樣品通常具有相似的代謝物，因此得分圖上表現(xiàn)出處于相近的地理位置。如果彼此間的差距越大，也就表明其生理病理狀態(tài)相差越大。在尿液檢測中，正離子模式下健康組、氣虛血瘀組、氣虛血瘀痰濁組之間的代謝通路存在明顯差異，而負離子模式下，健康組與氣虛血瘀、氣虛血瘀痰濁兩組之間可以明顯區(qū)分；在血清檢測中，在正離子模式下氣虛血瘀痰濁組和健康組、氣虛血瘀組這兩組可以明顯區(qū)分，負離子模式下，健康組、氣虛血瘀組、氣虛血瘀痰濁組之間都可以明顯區(qū)分，說明三者之間存在顯著的代謝差異。

4.3 尿液OPLS-DA分析結果

圖1 正、負離子模式下的尿液PCA分析結果

圖2 正、負離子模式血清PCA分析結果

圖3 氣虛血瘀證在正離子模式（A）和負離子模式（B）下的S-plot圖（尿液）

圖4 氣虛血瘀痰濁證在正離子模式（A）和負離子模式（B）下的S-plot圖（尿液）

圖5 氣虛血瘀證在正離子模式（A）和負離子模式（B）下的S-plot圖（血清）

圖6 氣虛血瘀痰濁證在正離模式（A）和負離子模式（B）下的S-plot圖（血清）

對氣虛血瘀組（圖3）和氣虛血瘀痰濁組（圖4）的尿液進行OPLS-DA[4]分析，建立模型，得出S-plot圖。

4.4 血清OPLS-DA分析結果（圖5、圖6）

分散在S型兩端的散點越遠，越具有特異性。用交叉驗證法進行檢驗，得到R2Y值和Q2值，R2Y值代表了對模型的驗證能力，Q2值代表了對模型的預測能力，它們可以對模型進行有效性評價。理論上R2Y值和Q2值越高，越接近1，說明所建立的OPLS-DA模型質(zhì)量良好，能夠反應原始變量的信息，預測能力也就越強。尿液檢測中，氣虛血瘀組在正離子模型下的模型評價指標為R2Y=0.99、Q2=0.89，負離子模式下的模型評價指標為R2Y=0.97、Q2=0.85；氣虛血瘀痰濁組在正離子模型下的模型評價指標為R2Y=0.99、Q2=0.97，負離子模式下的模型評價指標為R2Y=0.98、Q2=0.87。血清檢測中，氣虛血瘀組在正離子模型下的模型評價指標為R2Y=0.98、Q2=0.90，負離子模式下的模型評價指標為R2Y=1.00、Q2=0.98；氣虛血瘀痰濁組在正離子模型下的模型評價指標為R2Y=0.99、Q2=0.97，負離子模式下的模型評價指標為R2Y=1.00、Q2=0.95，R2Y值和Q2值都反映了模型建立良好。不管在正離子模式下還是負離子模式下，氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組均存在一些特異性標志物。

4.5 對潛在是生物標志進行檢索

分散在S型兩端的點作為潛在的生物標志物，選擇其中VIP值大于1.0的分子量且獨立t檢驗的P＜0.05的化合物作為潛在的生物標志物，通過精確分子量在生物數(shù)據(jù)庫進行正譜和負譜檢索，選取可以解釋代謝通路且具有代表意義的物質(zhì)，尿液中檢測出：馬尿酸（精確分子量179.172 7）、生物素（精確分子量244.311）、天冬氨酰蛋氨酸（精確分子量264.299）、賴氨酰酪氨酸（精確分子量309.360 8）、半胱氨酸亞磺酸（精確分子量151.118）、氨基葡萄糖（精確分子量179.171 1）、果糖胺（精確分子量179.171 1）、磷脂酰甘油（精確分子量512.614 2）；血清中檢測出甘油三酯（精確分子量815.299 2）、甘氨膽酸（精確分子量465.622 7）等，對這些物質(zhì)在三組之間進行非參數(shù)檢驗，得到各物質(zhì)在三組中的秩均值，對各組別進行組與組的差異性分析，a表示氣虛血瘀組和健康組之間的比較，b表示氣虛血瘀痰濁組和健康組之間的比較，c表示氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組之間的比較，得出相應的P值（P＜0.05表示兩組之間存在差異），根據(jù)三組之間的P值，得出相應的變化趨勢（表2）。

由表2可知，馬尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺、甘油三酯：氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組均高于健康組，但是氣虛血瘀組和健康組之間沒有差異性；天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亞磺酸：氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組均高于健康組，氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組之間沒有差異性；生物素、賴氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨膽酸這四種物質(zhì)氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組均低于健康組，氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組之間沒有差異性。

5 討論

從PCA得分圖分析，在尿液檢測中，正離子模式下三組之間的地理位置存在著明顯差異，提示三組間的體內(nèi)代謝通路存在本質(zhì)的差異；在負離子模式下，健康組和氣虛血瘀、氣虛血瘀痰濁這兩組的代謝通路有明顯差異。而血清檢測中，負離子模式下三組之間的代謝物通路存在著明顯差異；在正離子模式下，氣虛血瘀痰濁組可以明顯和健康組和氣虛血瘀組區(qū)分開來。相關學者同樣在不同中醫(yī)證型中進行檢測對比，華何與等[5]對氣滯血瘀證、心血瘀阻證、氣虛血瘀證這三種血瘀證患者的血漿分別進行代謝組學的檢測，發(fā)現(xiàn)氣虛血瘀證組可以和其他兩組證型明顯區(qū)分，而氣滯血瘀證和心血瘀阻證之間的差別不明顯。我們在S-plot圖中還探討出，不管在正離子模式下還是負離子模式下，氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組均存在一些特異性標志物。

相關學者通過代謝組學技術，還檢測出許多中醫(yī)證型的內(nèi)源性代謝物，如史琦等[6]采用核磁共振技術檢測出冠心病血瘀證患者的血漿含有纈氨酸和丙酮；朱明丹等[7]對冠心病不同證型的患者的血漿進行代謝組學研究，同樣采用了PCA方法，探討一些小分子代謝物如葡萄糖、花生四烯酸、亞油酸、苯丙氨酸、磷酸肌酸等與能量代謝、脂質(zhì)代謝、糖代謝紊亂密切相關。

根據(jù)表2中，各標志物的秩均值、各組間的P值和變化趨勢，提示尿液中檢測出的馬尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺這三種物質(zhì)以及血清中檢測出的甘油三酯，氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組雖然均高于健康組，但是氣虛血瘀組和健康組之間沒有差異性，而氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組存在差異性，提示這四種物質(zhì)可能代表了氣虛血瘀痰濁的特異性，而在痰濁證型中這四種物質(zhì)明顯增多。馬尿酸過多反映了腸道微生物菌群失調(diào)，氨基葡萄糖、果糖胺的過多反應了糖代謝的紊亂，甘油三酯的過多反應了脂類、能量代謝的紊亂，所以臨床中對痰濁證型的患者，要預防胃腸功能紊亂而致的腸道疾病以及要密切關注血糖、血脂的水平。我們檢測出馬尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺這三種物質(zhì)可能是氣虛血瘀痰濁證潛在的生物標志物，與張紅栓等[8]通過對冠心病心絞痛患者的尿液代謝組學檢測，發(fā)現(xiàn)血瘀證和痰濁證兩組的代謝物可以明顯區(qū)分，且痰濁證組的檸檬酸、酪氨酸、馬尿酸等的含量高于血瘀證組具有高度相似性。

天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亞磺酸：氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組均高于健康組，氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組之間沒有差異性，提示天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亞磺酸可能為氣虛血瘀中特異性標志物，而在氣虛血瘀痰濁中并無特異性。天冬氨酰蛋氨酸是由天門冬氨酸和蛋氨酸組成的二肽，這是蛋白質(zhì)分解代謝的不完整的的分解產(chǎn)物，表明蛋白質(zhì)處于高代謝的一個狀態(tài)，所以氣虛血瘀證在飲食上是需要補充一定的蛋白質(zhì)營養(yǎng)。半胱氨酸亞磺酸是氧化還原酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的副產(chǎn)品，當天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高時，提示肝臟疾病可能引起的肝損傷，臨床中氣虛血瘀證可能存在潛在的肝損傷，需謹慎治療。

生物素、賴氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨膽酸這四種物質(zhì)氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組均低于健康組，氣虛血瘀組和氣虛血瘀痰濁組之間沒有差異性，提示氣虛血瘀證和氣虛血瘀痰濁證均缺少這些物質(zhì)，同時也提示氣虛證型—虛性伏邪的物質(zhì)基礎是缺少這些物質(zhì)。生物素又稱維生素H、輔酶R，也屬于維生素B族中的B7，它是合成維生素C的必要物質(zhì)。賴氨酰酪氨酸是賴氨酸和酪氨酸形成的雙肽，兩種氨基酸都是人體所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，為蛋白質(zhì)的吸收和利用提供基礎。磷脂酰甘油是一種酸性磷脂，磷脂具有促進脂肪代謝，降低血清膽固醇、改善血液循環(huán)、預防心血管疾病的作用。甘氨膽酸是由膽酸和甘氨酸結合生成的，然后隨膽汁排入腸道，幫助脂肪的消化和吸收。所以臨床治療中，對于氣虛證型要注意維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的補充以及控制脂類代謝的紊亂，同樣，對于臨床中一些缺乏維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的患者可以給予補氣的治療方案。

6 總結與展望

尿液和血清的代謝組學研究中，PCA得分圖中可以明顯區(qū)分出三組樣本的差異性；在S-plot圖中也可以看到氣虛血瘀和氣虛血瘀痰濁兩組的定性分析，既存在S型兩端的黑色點狀就是區(qū)分彼此的差異性代謝物；對于天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亞磺酸這兩種物質(zhì)，可能為氣虛血瘀證型的潛在特異性標志物；馬尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺、甘油三酯可能為氣虛血瘀痰濁證的潛在特異性標志物；氣虛證型—虛性伏邪的物質(zhì)基礎是缺少生物素、賴氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨膽酸這四種物質(zhì)。通過代謝組學這項新技術，探討出冠心病心絞痛氣虛血瘀證型、氣虛血瘀痰濁證型的不同內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，為臨床不同中醫(yī)證型的預防、診治提供思路。

系統(tǒng)生物學的研究方法和中醫(yī)學體系的整體觀念存在著許多的相似性，但將二者結合起來也面臨諸多挑戰(zhàn)，特別是中醫(yī)證候的復雜多變性，這就需要技術成熟發(fā)展，國內(nèi)一些學者在傳統(tǒng)中醫(yī)辨證的基礎上，一直尋找可以量化冠心病中醫(yī)證候的新標準，相信通過各學者的不斷探索，代謝組學的無創(chuàng)性、高靈敏性的分析特點，逐漸為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化所接受，為目前中醫(yī)藥的研究開辟了新的方法和思路，有望使中醫(yī)辨證實現(xiàn)客觀化[9]。

1朱萱萱,王廣基,阿基業(yè),等.冠心病中醫(yī)辨證分型的代謝組學研究.中華中醫(yī)藥學刊,2009,27(6):1267-1269．

2吳輝,于揚文,吳偉,等.116例冠心病患者中醫(yī)證候及病因分析.江蘇中醫(yī)藥.2004,25(10):30-31.

3張秋雁,鄧冰湘.冠心病心絞痛臨床中醫(yī)證型分布的回顧性分析.中醫(yī)研究,2005,18(11):23-24.

4錢國華,荀鵬程,陳峰,等.偏最小二乘法降維在微陣列數(shù)據(jù)判別分析中的應用.中國衛(wèi)生統(tǒng)計,2007,24(2):120-123.

5華何與,賈鈺華,張紅栓,等.冠心病心絞痛三種血瘀證的血漿代謝組學研究.熱帶醫(yī)學雜志,2010,10(3):258-260,279,230.

6史琦,王偉,李友林,等.基于代謝組學的冠心病患者血瘀證識別模式研究.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2014,12(5):513-516.

7朱明丹.不同證型冠心病患者的血漿代謝組學研究.中醫(yī)雜志, 2013,54(17):1489-1493.

8張紅栓,賈鈺華,華何與,等.冠心病心絞痛痰濁證、血瘀證的尿液代謝組學研究.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,2010,16(2):126-128.

9程鵬,陳澤奇,王東生.冠心病痰濁證與氣虛證的代謝組學研究.中國中西醫(yī)結合雜志,2015,35(2):193-197.

Objectification on Metabolomics of Different Traditional Chinese Medicine Syndromes in Patients with Coronary Heart Disease andAngina Pectoris

Chen Hao,Deng Yue
(Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130021,China)

This study was aimed to investigate potential biomarkers in different traditional Chinese medicine(TCM) syndromes of angina pectoris of coronary heart disease(CHD)by using metabolomic technology,and to explore the objective law of different TCM syndromes of CHD.Endogenous metabolites in serum and urine from the healthy group, and patients with DHD angina pectoris patients of the syndrome of Qi deficiency and blood stasis,as well as the syndrome of Qi deficiency,blood stasis and phlegm turbidity were detected by the liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS).Metabolic profiles were analyzed by the principal component analysis(PCA)and the orthogonal partial least squares discriminant analysis(OPLS-DA).The results showed that in PCA,the healthy group,Qi deficiency and blood stasis group,as well as the Qi deficiency,blood stasis and phlegm turbidity group can be obviously distinguished.Potential biomarkers in the Qi deficiency and blood stasis syndrome contained aspartyl methionine and cysteine sulfinic acid.Potential biomarkers in the Qi deficiency,blood stasis and phlegm turbidity syndrome contained hippuric acid,amino glucose,fructosamine and triglyceride.The objective performance of Qi deficiency syndrome was the absence of biotin,lysyl tyrosine,phosphatidylglycerol and glycocholic acid.It was concluded that through the new metabolomic technology,different endogenous metabolites in the syndrome of Qi deficiency and blood stasis,as well as the syndrome of Qi deficiency,blood stasis and phlegm turbidity of patients with DHD angina pectoris were detected.It provided ideas for the clinical practice of prevention,diagnosis and treatment of different TCM syndromes.

Traditional Chinese medicine syndrome,metabolomics,liquid chromatography-mass spectrometry,Qi defi?ciency and blood stasis syndrome,Qi deficiency,blood stasis and phlegm turbidity syndrome

10.11842/wst.2017.05.000

R259

A

（責任編輯：吳朦，責任譯審：王晶）

2017-04-21

修回日期：2017-05-20

＊國家中醫(yī)藥管理局國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務建設科研專項課題（JDZX2012070）：冠心病中醫(yī)證候與伏邪發(fā)病機制的流行病學調(diào)查及代謝組學研究，負責人：鄧悅。

＊＊通訊作者：鄧悅，教授，博士生導師，主要研究方向：中西醫(yī)結合心血管病研究。