羅穎，趙之麗，陳科力，劉義梅

基于ITS2序列鑒定白及與其偽品小白及＊

羅穎，趙之麗，陳科力，劉義梅＊＊

（湖北中醫(yī)藥大學藥學院教育部中藥資源和中藥復(fù)方重點實驗室武漢430065）

目的：通過分析白及與小白及的ITS2條形碼序列，鑒定白及與其偽品小白及。方法：以采集自云南、湖北、貴州、湖南、四川的38份白及和小白及葉片為實驗材料，提取其總DNA，并PCR擴增其ITS2序列，對序列進行雙向測序，并從GenBank上下載2個物種共8條ITS2序列，用MAGA5.0進行序列分析，計算種內(nèi)、種間遺傳距離，構(gòu)建鄰接樹。結(jié)果：白及與小白及的ITS2序列全長均為259 bp，種間有14個變異位點；ITS2序列種內(nèi)最大遺傳距離0.008，種間最小遺傳距離0.040。由所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹可以看出，不同來源的白及與小白及的樣本均分別聚為一支，兩者明顯分開。結(jié)論：利用ITS2序列可快速準確地鑒別白及與小白及。

白及小白及ITS2序列鑒定

白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.和小白及Bletilla formosana（Hayata）Schltr.均為蘭科白及屬Bletilla Rchb.f.植物，是常用中藥材。兩者均以假鱗莖入藥，但僅白及一種被列入《中國藥典》作為藥用白及的正品基源植物。白及味苦、甘、澀，微寒，具有收斂止血、消腫生肌等功效，用于治療咯血吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、肺結(jié)核咯血、潰瘍病出血等癥[1]。小白及性涼，味苦、微麻，有小毒，具有清熱化濕，祛風止痛的功效，可用于治療消化不良，腹痛，癰瘡腫毒，風濕痹痛等癥，在云南當?shù)乇粡V泛用治療肺結(jié)核咳嗽[2]。白及與小白及在湖北、四川、陜西、貴州、云南等地都有分布[3]。由于白及與小白及的資源分布具有重疊性，而且原植物的形態(tài)在非花期較難區(qū)別，同時在假鱗莖形態(tài)上區(qū)別較小，經(jīng)加工處理為飲片、粉末時，藥材的真?zhèn)舞b別難度較大。隨著白及價格的上漲，白及野生資源受到極大沖擊，小白及充斥市場。但是兩者在藥效和藥性上存在差異，因此建立一種快速、準確鑒定白及與小白及的方法，對于保證白及藥材的質(zhì)量及用藥安全具有重要意義。

DNA條形碼技術(shù)作為物種鑒定的新手段，具有準確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，操作簡便等優(yōu)點。ITS2條形碼作為DNA條形碼候選序列之一，在植物近緣種親緣關(guān)系、藥材真?zhèn)舞b別等方面應(yīng)用廣泛[4-6]。目前有關(guān)白及屬植物的鑒定，已有其形態(tài)學、理化性質(zhì)、ISSR DNA分子標記[7-9]，以及利用nrDNA ITS、LFY同源基因內(nèi)含子2及葉綠體ycf1基因的3條候選條形碼鑒定等方面的報道[10]，宋爽等[11]以ITS2序列條形碼對藥用白及和云南本地種白及進行了分析研究，陳黎等[3]應(yīng)用ITS2條形碼序列對白及藥材及8種常見不同屬的混偽品進行了鑒定研究。本研究運應(yīng)用ITS2序列條形碼對采集自不同產(chǎn)地的白及和同屬偽品小白及進行鑒定。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與試劑

MM400臺式振動混合球磨儀（德國萊馳公司）、HHS-4S數(shù)顯水浴鍋（上海虞龍儀器設(shè)備有限公司）、JY1000C電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、Prime5G PCR儀（英國Techne公司）、Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）、β-巰基乙醇，Buffer PCB，瓊脂糖均購于上海捷瑞生物工程有限公司。

表1 白及與小白及樣本信息表

1.2 樣品來源

從湖北、云南、貴州、四川、湖南5個省采集白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.、小白及Bletilla formo?sana（Hayata）Schltr.共2個物種38個樣本。新鮮葉片經(jīng)硅膠干燥保存，原植物材料經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學陳科力教授鑒定。另從GenBank下載2個物種ITS2序列共8條。46份植物材料來源及GenBank號詳表1。

2 實驗方法

2.1 樣品DNA提取用

分別取實驗材料的干燥葉片50 mg，用球磨儀研磨2 min（30次/min）,加入600 μL 65℃預(yù)熱的Buffer PCB和12 μLβ-巰基乙醇，震蕩混勻，置于65℃水浴25 min，間或混勻。再采用Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

2.2 PCR擴增和測序

序列擴增選用ITS2通用引物ITS2F（5′-AT GC? GATACTTGGTGTGAAT-3′）和ITS3R（5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）。PCR反應(yīng)體系為25 μL，體系內(nèi)包含2×Tag PCR Mix 12.5 μL，引物（2.5 μmol·L-1）各1.0 μL、模板DNA 2μL，雙蒸水8.5 μL。擴增程序為94℃變性5 min，經(jīng)過40個循環(huán)（94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45s），最后72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將清晰、明亮、單一電泳條帶所對應(yīng)的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司行雙向測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理

測序峰圖應(yīng)用CodonCode Aligner V4.2.4（Codon?Code Co.，USA）校對拼接，去除低質(zhì)量序列和引物區(qū)，46條序列的兩端5.8S和28S除去（采用基于隱馬爾可夫模型HMMer注釋方法）以獲得ITS2間隔區(qū)序列[12]。將所有序列用MEGA5.0軟件進行分析比對，計算K2P遺傳距離值并建立NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 白及與小白及ITS2序列特征分析

不同來源白及和小白及樣本共46條序列，比對后長度均為259 bp。白及種內(nèi)有3個位點變異，分別為86位處A-G變異，137位C-T變異，相對于HNBJ002號樣品其他白及樣品246位處有堿基G缺失。小白及種內(nèi)在137位存在A-G變異。白及與小白及種間有14個堿基變異位點，其中特征性位點10個，分別為第6、36、38、44、66、124、136、137、163、174、223位點。變異的位點及堿基變化有一定的規(guī)律，即在特定的位點變異，且變異相同，例如在38位處，白及的堿基全部為“T”，而小白及全部為“G”,因此這些變異位點都可作為鑒定的依據(jù)，將二者完全分開。白及種內(nèi)GC含量在62.2%-62.7%，平均GC含量為62.3%，小白及種內(nèi)GC含量61.4%-61.8%,平均GC含量為61.5%（表2）。

3.2 白及與小白及種內(nèi)與種間遺傳距離分析

白及ITS2序列種內(nèi)最小遺傳距離為0，最大遺傳距離為0.008，平均遺傳距離為0.003。小白及種內(nèi)最小遺傳距離為0，最大遺傳距離為0.004，平均遺傳距離為0.001 6。白及和小白及種間最小遺傳距離為0.040，最大為0.053,平均遺傳距離為0.044。兩者種間最小遺傳距離顯著大于兩者種內(nèi)最大遺傳距離，說明采用ITS2序列可以將白及與小白及準確鑒別開（表3）。

3.3 白及與小白及聚類分析

從基于ITS2序列構(gòu)建的鄰接（NJ）聚類樹（圖1）可

以看出，不同來源的白及樣品聚為一支，不同來源的小白及樣品聚為另一支，兩者明顯分開，因此ITS2條形碼可以鑒定白及與小白及。

表2 白及與小白及ITS2序列特征

表3 白及與小白及的遺傳距離

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的白及與小白及的NJ樹

4 討論

白及是中國常用中藥材，由于白及種子繁育困難，人工種植難度較大，導致產(chǎn)區(qū)私挖濫采現(xiàn)象嚴重，野生資源遭到破壞，白及藥用資源緊張，市場上白及藥材的混偽現(xiàn)象嚴重，其中白及屬混偽現(xiàn)象較為常見。中國分布的白及屬有4個種，其中華白及分布范圍狹窄，極為罕見，市場用藥少見。黃花白及因花色為黃色，顯著區(qū)別于其他3個物種的粉紅至紫紅色。而白及和小白及在分類學上特征差異很小，區(qū)別僅在于小白及的唇瓣褶片從基部至唇瓣的中裂片均為波狀，而白及的唇瓣褶片僅中裂片為波狀，從植物形態(tài)上進行鑒別困難。同時，白及與小白及都以假鱗莖入藥，藥材經(jīng)加工切制后，已經(jīng)失去原有的性狀，從藥材性狀上也很難區(qū)分開。白及與小白及在植株形態(tài)，藥材性狀，顯微特征方面都有高度相似性，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學方法進行鑒定非常困難且繁瑣[13]。二者在藥效和藥性上具有一定差異，藥材的混用將直接影響到白及臨床用藥的安全和療效。因此，對白及和小白及進行深入的鑒定研究，對白及的準確引種栽培，規(guī)范商品市場以及臨床用藥有重要意義。

本研究從5個省份收集38份實驗樣品，通過Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒提取植物的總DNA，具有快速、方便，不受有機試劑污染的特點。所提取的DNA經(jīng)檢測，質(zhì)量均較好。其PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測均可出現(xiàn)單一、明亮的條帶，純化后雙向測序成功率達100%，說明ITS2序列在白及與其偽品小白及的鑒定中是有效的DNA區(qū)段，ITS2序列引物及其反應(yīng)條件針對白及和小白及鑒定的穩(wěn)定性好。

本研究從GenBank上共下載了8條白及與小白及的ITS2序列片段，與實驗采集的樣品進行對比鑒別。從實驗結(jié)果可以看出，通過相似性搜索法、最小距離法以及基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹均能將白及與其偽品小白及很好的區(qū)分開，說明采用ITS2序列鑒定白及與小白及有較高的可靠性。

由此可見，基于ITS2序列的DNA條形碼技術(shù)能夠有效地鑒定白及與其偽品小白及，為保障白及的臨床用藥安全和療效提供了參考依據(jù)。

1中國藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:103.

2馬正,馬宏坤.中藥材白及與小白及的區(qū)別.農(nóng)業(yè)與技術(shù),2016,36 (4):250-250.

3陳黎.鄂西北白及產(chǎn)地適宜性與品質(zhì)評價研究.武漢:湖北中醫(yī)藥大學博士學位論文,2014.

4朱英杰,陳士林,姚輝,等.重樓屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究.藥學學報,2010,45(3):376-382.

5高婷,姚輝,馬新業(yè),等.中國黃芪屬藥用植物DNA條形碼(ITS2)鑒定.世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2010,12(2):222-227.

6趙莎,辛天怡,侯典云,等.黨參藥材及其混偽品的ITS/ITS2條形碼鑒定研究.世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2013,15(3):421-428.

7孫樂樂,楊永紅,劉軍凱,等.中藥材,2010,33(12):1965-1968.

8趙艷霞,鄧雁如,張曉靜,等.白及屬藥用植物化學成分及藥理作用研究進展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(8):1137-1145.

9和志嬌,呂麗芬,楊麗云,等.白芨種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析.西南農(nóng)業(yè)學報,2008,21(4):1081-1085.

10吳勁松,張宇思,劉薇,等.白及屬藥用植物DNA條形碼的確立及其應(yīng)用.藥學學報.2014,49(10):1466-1474.

11宋爽,周洋帆,黃麗,等.ITS2條形碼對白及屬植物的初步分析研究.云南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學),2017,32(1):95-100.

12 Keller A,Schleicher T,Schultz J,et al.5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation.Gene,2009,430（1-2）:50-57.

13蘇鈦,李學芳,邱斌,等.滇產(chǎn)習用白及類藥材的生藥學研究.現(xiàn)代中藥研究與實踐,2015,29(6):18-21.

Identification of Bletilla Striata(Thunb.)Reichb.f.and Bletilla Formosana(Hayata)Schltr.Based on ITS2 Sequence

Luo Ying,Zhao Zhili,Chen Keli,Liu Yimei
(Key Laboratory of Ministry of Education on Traditional Chinese Medicine Resource and Compound Prescription, College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

This study was aimed to identify Bletilla Striata(Thunb.)Reichb.f.and Bletilla Formosana(Hayata)Schltr.by ITS2 sequence.The leaves of 38 samples of Bletilla striata and Bletilla formosana from Yunnan,Hubei,Guizhou,Hunan and Sichuan province were used as experiment materials.The total DNA was extracted.Internal transcribed spacer 2 (ITS2)sequences were obtained by PCR.All of the ITS2 sequences were checked.The 8 ITS2 sequences from two species were downloaded from GenBank.The intraspecific and interspecific Kimura-2-parameter(K2P)distances of Bletilla striata and Bletilla formosana were calculated by MEGA5.0.And neighbor-joining(NJ)tree was constructed. The results showed that the full-length sequences of ITS2 from Bletilla striata and Bletilla formosana were 259 bp,with a total of 14 variable sites.The maximum intraspecific K2P distance of Bletilla striata and Bletilla formosana was 0.008, while the minimum interspecific K2P distance was 0.040.The ITS2 secondary structure showed that different origins of Bletilla striata were gathered together and could be distinguished obviously from Bletilla formosana by NJ tree.It was concluded that ITS2 sequence was able to identify Bletilla striata and Bletilla formosana quickly and accurately.

Bletilla striata,Bletilla formosana,ITS2 sequence,identification

10.11842/wst.2017.05.022

R282.5

A

（責任編輯：張娜娜，責任譯審：王晶）

2017-03-21

修回日期：2017-05-01

＊科學技術(shù)部重大新藥創(chuàng)制國家科技重大專項（2014ZX09304307001）：中藥新藥安全性檢測技術(shù)與標準研究，負責人：肖紅斌。

＊＊通訊作者：劉義梅，教授，主要研究方向：中藥資源及其品質(zhì)研究。