劉福權(quán)，巫碧清，趙志峰，何強(qiáng)

(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，成都 610065)

花椒中典型酰胺類物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化研究

劉福權(quán)，巫碧清，趙志峰*，何強(qiáng)

(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，成都 610065)

為了獲得高質(zhì)量的花椒酰胺類物質(zhì)，文章采用有機(jī)溶劑萃取法進(jìn)行提取，并利用HPLC法測定花椒中酰胺類物質(zhì)的含量，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對提取溫度、料液比和提取時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的優(yōu)化設(shè)計(jì)。結(jié)果表明：溫度與料液比的交互作用明顯，而溫度與時(shí)間、料液比與時(shí)間的交互作用不顯著(p>0.05)；最佳提取工藝為溫度43 ℃，料液比1∶15，時(shí)間4.5 h，此條件下的提取率可達(dá)7.68%，理論預(yù)測值為7.32%。該研究為提取花椒中典型的酰胺類物質(zhì)提供了參考。

花椒；酰胺類物質(zhì)；提取工藝；響應(yīng)面分析

花椒(Zanthoxylumbungeanum)系蕓香科花椒屬植物，其成熟干燥的果皮作為一種傳統(tǒng)的香辛料長期存在于亞洲人的廚房中，因其具有獨(dú)特的“麻味”以及唾液分泌性質(zhì)而被譽(yù)為中國“八大味”之一[1]?；ń分械孽０奉愇镔|(zhì)是山椒素和花椒素類物質(zhì)的總稱[2]，因其能通過激活觸覺和熱感應(yīng)三叉神經(jīng)的神經(jīng)元產(chǎn)生“麻”這一感覺又被廣泛地稱為麻味物質(zhì)[3]。從花椒中提取得到酰胺類物質(zhì)不僅能夠?yàn)槁槲堆芯刻峁┗A(chǔ)性原料，更是進(jìn)一步研究其生物活性、藥理作用和神經(jīng)科學(xué)分子機(jī)制的基礎(chǔ)性步驟[4-6]，因此花椒中典型酰胺類物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化至關(guān)重要。目前常見的提取方法主要是有機(jī)溶劑萃取法和超臨界CO2萃取法。薛小輝[7]研究了青花椒麻味成分的超臨界CO2萃取工藝，得到了最優(yōu)參數(shù)；劉雄[8]對比研究了有機(jī)溶劑法和超臨界CO2萃取法提取花椒中風(fēng)味物質(zhì)的工藝條件，得到了提取花椒油樹脂的最佳工藝參數(shù)，但是文章主要對精油得率進(jìn)行了工藝優(yōu)化，并未對花椒中典型的酰胺類物質(zhì)的有機(jī)溶劑提取進(jìn)行研究。

近年來不斷發(fā)展的麻味評價(jià)方法對花椒中的酰胺類物質(zhì)提出了更高的要求[9]，而超臨界CO2萃取法雖然具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是因其設(shè)備昂貴而難以廣泛使用。本文擬通過有機(jī)溶劑萃取法提取花椒中典型的酰胺類物質(zhì)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，建立數(shù)學(xué)模型，分析不同因素對酰胺類物質(zhì)提取的影響程度，以期為花椒麻味研究的基礎(chǔ)步驟提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

花椒：由四川五豐黎紅食品有限公司提供，選用2015年8月采摘于四川漢源的鮮花椒，采收后于40 ℃條件下烘干，常溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

甲醇、堿性氧化鋁、乙腈：成都科龍?jiān)噭S；超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DZKW-4恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；TDZ5-WS低速離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵 上海道京儀器有限公司；LC-6AD高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察提取溫度、時(shí)間和料液比對酰胺類物質(zhì)提取率的影響。稱取粉碎至40目的花椒1 g，置于100 mL錐形瓶中，按設(shè)定的料液比加入分析純甲醇，在設(shè)定溫度下水浴加熱一定時(shí)間后，減壓抽濾。濾液減壓蒸干(50 ℃)后加入10 mL分析純甲醇，超聲波輔助溶解。將所得混合溶液過堿性氧化鋁層析柱，收集層析液。所得層析液經(jīng)離心(4000 r/min，10 min)后，取上清液減壓蒸干并計(jì)重，所得樣品即為酰胺類物質(zhì)提取物。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法對花椒中酰胺類物質(zhì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行三因素三水平的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。選取提取溫度、時(shí)間和料液比為自變量，分別用A，B，C表示，以花椒酰胺類物質(zhì)提取率為響應(yīng)值，用R表示。實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平

1.2.3 酰胺類物質(zhì)的檢測

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將實(shí)驗(yàn)室自制的羥基-α-山椒素標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同濃度的溶液，采用HPLC法進(jìn)行檢測，色譜條件：MN Nucleodur 1100-5 C18柱；流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測波長：270 nm；進(jìn)樣量：20 μL。洗脫程序見表2。

表2 HPLC洗脫程序

以各濃度溶液在270 nm下吸收峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=198648x，R2=0.998，式中：x為麻味物質(zhì)的質(zhì)量濃度(μg/mL)，y為270 nm下吸收峰的面積。

1.2.3.2 酰胺類物質(zhì)含量的測定

取一定量的提取物用色譜級甲醇溶解后過0.22 μm濾膜，使用高效液相色譜儀進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到花椒中酰胺類物質(zhì)的含量。

1.2.3.3 酰胺類物質(zhì)提取率的計(jì)算

酰胺類物質(zhì)提取率(ER)計(jì)算公式如下：

式中：c為酰胺類物質(zhì)質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品定容體積，mL；d為樣品溶液稀釋倍數(shù)；G為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21進(jìn)行處理，方差分析采用Duncan模型進(jìn)行多重比較，顯著性水平為5%，采用Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對酰胺類物質(zhì)提取率的影響

考察在30，40，50，60 ℃條件下，提取溫度對花椒酰胺類物質(zhì)提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 溫度對酰胺類物質(zhì)提取率的影響

由圖1可知，當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，提取率最大，隨著溫度繼續(xù)升高，提取率開始下降，溫度對提取率的影響顯著(p<0.05)。

當(dāng)溫度較低時(shí)，隨著溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)速率加快，在相同時(shí)間內(nèi)，花椒中酰胺類物質(zhì)的溶出隨著溫度的升高而增加。但當(dāng)溫度較高時(shí)，溫度的繼續(xù)升高將導(dǎo)致溶劑蒸發(fā)速率加快，在相同時(shí)間內(nèi)，體系的料液比降低，提取率下降。此外，由于酰胺類物質(zhì)為熱敏性物質(zhì)，在高溫下不穩(wěn)定，溫度較高可能會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生轉(zhuǎn)化或降解[10]，由此也導(dǎo)致提取率下降。

2.1.2 時(shí)間對酰胺類物質(zhì)提取率的影響

考察溫度在40 ℃條件下，提取時(shí)間對花椒酰胺類物質(zhì)提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時(shí)間對酰胺類物質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，花椒中酰胺類物質(zhì)的提取率在4 h時(shí)達(dá)到最大值，隨著時(shí)間延長，6～8 h花椒麻味物質(zhì)提取率有所下降，但在10 h時(shí)又出現(xiàn)峰值，隨后提取率繼續(xù)降低。在2～12 h內(nèi)，時(shí)間對提取率具有顯著影響(p<0.05)。

出現(xiàn)2個(gè)峰值的原因可能是4 h時(shí)正好是1個(gè)分離周期，而隨著時(shí)間延長，花椒中酰胺類物質(zhì)又進(jìn)行了1次分離。但是相比第1個(gè)分離周期，第2個(gè)分離周期所得到的酰胺類物質(zhì)有所減少，這可能是因?yàn)榻?jīng)過1次分離后有機(jī)溶劑中已經(jīng)存在酰胺類物質(zhì)，導(dǎo)致濃度差減小，傳質(zhì)推動(dòng)力下降。

2.1.3 料液比對酰胺類物質(zhì)提取率的影響

考察溫度為40 ℃、時(shí)間為4 h條件下，料液比對花椒酰胺類物質(zhì)提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對酰胺類物質(zhì)提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)，酰胺類物質(zhì)的提取率最大，料液比對提取率的影響顯著(p<0.05)。當(dāng)料液比小于1∶15時(shí)，提取率隨著料液比的增加而增加，而當(dāng)料液比大于1∶15時(shí)，由于提取已經(jīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，料液比的增加并不會(huì)繼續(xù)提高酰胺類物質(zhì)提取率，反而由于后續(xù)需要延長減壓蒸干的時(shí)間所導(dǎo)致的酰胺類物質(zhì)部分分解而有所下降。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用Box-Benhnken中心組合對酰胺類物質(zhì)的提取率進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，結(jié)果見表3。

表3 花椒中酰胺類物質(zhì)提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù) 表

由表3可知，回歸模型的顯著性檢驗(yàn)p=0.1524>0.05，差異不顯著，說明該模型擬合程度不好。因此，需要進(jìn)一步對模型進(jìn)行逐步回歸分析，得到回歸方程為：R=6.44736+0.16052A+0.65773B-0.80348A2。

方差分析見表4。

表4 方差分析表

注：“*”為影響顯著(0.01

由表4可知，回歸方程的失擬性檢驗(yàn)p=0.3002>0.05，差異不顯著，這表明所選用的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)?；回歸模型的顯著性檢驗(yàn)p=0.0106<0.05，差異顯著，說明該模型擬合程度好，模型成立。因此，在所選的3個(gè)因素中，提取溫度和料液比對花椒酰胺類物質(zhì)提取率具有顯著影響，而提取時(shí)間作為不顯著因素被剔除，表明提取時(shí)間對于花椒酰胺類物質(zhì)提取率并無顯著影響。

由分析結(jié)果可知，當(dāng)溫度為43.08 ℃、料液比為0.06、時(shí)間為4.45 h時(shí)，提取效果最好，提取率為7.32%。因此，選擇最佳提取工藝參數(shù)為溫度43 ℃，料液比1∶15，時(shí)間4.5 h。

回歸模型的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖4～圖6。

圖4 料液比和提取溫度的交互作用

圖5 溫度和提取時(shí)間的交互作用

圖6 料液比和提取時(shí)間的交互作用

由圖4～圖6可知，提取溫度與料液比的響應(yīng)曲面圖較為陡峭，且交互的等高線圖近似橢圓形，說明提取溫度與料液比的交互作用較為明顯。而提取溫度與提取時(shí)間、料液比與提取時(shí)間的響應(yīng)曲面圖較為平緩，且交互的等高線圖近似圓形，表明提取溫度與提取時(shí)間、料液比與提取時(shí)間的交互作用并不顯著(p>0.05)，該結(jié)果與方差分析結(jié)果相吻合。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到采用有機(jī)溶劑萃取法提取花椒中典型酰胺類物質(zhì)的最優(yōu)參數(shù)為提取溫度43 ℃，料液比1∶15，提取時(shí)間4.5 h，此條件下提取率可達(dá)7.68%。本文通過逐步回歸模型成功擬合得到了提取率的方程，闡述了提取溫度和料液比對酰胺類物質(zhì)提取率具有顯著影響，而提取時(shí)間無顯著影響。

本文較為系統(tǒng)地闡述了花椒中典型酰胺類物質(zhì)的提取優(yōu)化過程，得到了以甲醇為溶劑條件下的最佳提取工藝，但在不同溶劑下酰胺類物質(zhì)傳質(zhì)過程的對比研究還鮮有報(bào)道，或可作為未來研究的方向。

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Research on Optimization of Extraction Process ofTypical Amides inZanthoxylumbungeanum

LIU Fu-quan, WU Bi-qing, ZHAO Zhi-feng*, HE Qiang

(College of Light Industry, Textile and Food Engineering, SichuanUniversity, Chengdu 610065, China)

To obtain the high-quality amides fromZanthoxylumbungeanum, the organic solvent extraction is used and the amides content ofZanthoxylumbungeanumis determined by HPLC. On the basis of single factor experiment, the response surface method is applied to extraction temperature,solid-liquid ratio and extraction time for optimal design of three factors and three levels. The results show that the interaction between temperature and solid-liquid ratio is obvious, however, the interaction between temperature and time as well as the interaction between solid-liquid ratio and time are not significant(p>0.05).And the optimal extraction process is temperature of 43 ℃, solid-liquid ratio of 1∶15,time of 4.5 h, the extraction rate can reach 7.68% under such conditions, and the predicted value is 7.32%. The study can provide a reference for the extraction of typical amides fromZanthoxylumbungeanum.

Zanthoxylumbungeanum;amides;extraction process;response surface analysis

2017-02-20 *通訊作者

國家自然科學(xué)基金(21502128)

劉福權(quán)(1992-)，男，遼寧撫順人，碩士，研究方向：食物資源利用。

TS264.29

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.006

1000-9973(2017)08-0025-05