張厚梅+王琳

摘 要：為了揭示芳香化酶與黃鱔（Monopterus albus）性逆轉(zhuǎn)之間的內(nèi)在聯(lián)系和作用機(jī)理，以不同性別黃鱔的性腺和腦組織為試驗(yàn)材料，采用免疫組化方法檢測芳香化酶在不同性別黃鱔的性腺和腦組織上的定位及其變化趨勢。免疫組化結(jié)果顯示：在雌性黃鱔性腺中，芳香化酶主要分布在成熟卵母細(xì)胞的胞質(zhì)上，卵膜、胞核和不成熟的卵母細(xì)胞呈陰性；在雌雄間性黃鱔性腺中，芳香化酶主要分布在的退化卵母細(xì)胞膜和縱隔上；在雄性黃鱔性腺中，芳香化酶主要分布在各級精母細(xì)胞上。芳香化酶在腦組織中均有分布，并且其染色程度隨著黃鱔由雌性轉(zhuǎn)換為雄性而趨于減弱。這意味著黃鱔性腺和腦組織中的芳香化酶可能參與黃鱔的性逆轉(zhuǎn)過程，且與其性別轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：黃鱔（Monopterus albus）；芳香化酶；性逆轉(zhuǎn)

中圖分類號：S965.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

在脊椎動物發(fā)育過程中，胚胎的早期，原始性腺是呈中性的，它具有分化為卵巢或精巢的雙向潛能。在魚類進(jìn)化過程中，鹽度、pH值、溫度以及外源性激素等均可影響其性別分化的方向。芳香化酶能催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，它是性腺分化的核心酶，芳香化酶可能調(diào)控著性別分化的方向。李廣麗[1]用芳香化酶抑制劑進(jìn)行腹部埋植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清11-酮基睪酮水平顯著提高，且能誘導(dǎo)赤點(diǎn)石斑魚（Epinephelus arkoya）由雌性轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌浴Ａ硗?，在性別形成階段，使用芳香化酶抑制劑可以使基因型為雌性的羅非魚（Oreochromis niloticus）、鮭魚（Oncorhvnchus tschawytscha）轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄孕坌贼~[2-3] 。到目前為止，已有斑馬魚（Barchydanio rerio）、羅非魚等[4-5]的芳香化酶基因片段被分離和克隆，并研究了該基因與性別分化的關(guān)系。近年來，越來越多的研究結(jié)果表明，芳香化酶與魚類性別分化密切相關(guān)。黃鱔（Monopterus albus），隸屬于合鰓目、合鰓科，是我國主要淡水養(yǎng)殖產(chǎn)品之一。黃鱔從胚胎發(fā)生階段到性成熟階段， 都為雌性， 性成熟以后即可產(chǎn)生卵子， 但在產(chǎn)卵以后， 卵巢慢慢退化消失，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫玻?隨后就可以產(chǎn)生成熟精子，變?yōu)樾坌?，即具有極為罕見的性逆轉(zhuǎn)生理現(xiàn)象。目前，關(guān)于芳香化酶在黃鱔腦組織、性腺上的細(xì)胞學(xué)分布規(guī)律仍較少研究。

本試驗(yàn)以黃鱔為試驗(yàn)動物，應(yīng)用免疫組化技術(shù)系統(tǒng)觀察芳香化酶在黃鱔腦組織、性腺上的細(xì)胞學(xué)分布規(guī)律，為進(jìn)一步探討芳香化酶如何調(diào)控動物生殖活動的機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物和主要試劑

2016年4-12月份，從安徽省肥西縣境內(nèi)共采購活體野生黃鱔128尾，實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)，隨后分批進(jìn)行解剖，收集黃鱔性腺和腦垂體，試驗(yàn)時，黃鱔體重為50～180 g，兔抗P450arom 抗體（A7981）購自美國 Sigma公司，PV-9000兩步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動物處理 將上述黃鱔處死，迅速分離大腦、性腺等組織，立即投入多聚甲醛（4%）溶液中進(jìn)行固定，倒出固定液，用微流水沖洗組織12 h左右，使用不同濃度酒精順序脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片（5 μm）

1.2.2 免疫組織化學(xué)步驟

（1）切片常規(guī)脫蠟至水；（2）熱修復(fù)抗原；（3）滅活內(nèi)源性酶；（4）滴加一抗P450arom；（5）按照免疫組化檢測試劑盒說明，滴加試劑1、2；（6）DAB 顯色，蒸餾水洗滌；（7）蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.2.3 顯微鏡觀察 在顯微鏡下觀察拍照，陰性對照組呈藍(lán)色，陽性產(chǎn)物染色呈棕黃色。

2 結(jié)果與分析

2.1 芳香化酶（P450arom）在黃鱔性腺組織中的定位

2.1.1 芳香化酶在雌性黃鱔性腺上的定位

雌性黃鱔性腺上可觀察到大小不一的卵粒，P450arom主要分布在成熟卵母細(xì)胞的胞質(zhì)上（圖1B），卵膜、胞核和不成熟的卵母細(xì)胞及對照組（圖1A、B）呈陰性。

2.1.2 芳香化酶在雌雄間性黃鱔性腺上的定位

雌雄間性黃鱔性腺形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，既可觀察到卵母細(xì)胞，還可觀察到結(jié)締組織縱隔和在縱隔形成的管狀結(jié)構(gòu)的早期精細(xì)管。P450arom主要分布在退化卵母細(xì)胞膜（圖2B）和縱隔（圖 2D）上。

2.1.3 芳香化酶在雄性黃鱔性腺上的定位

雄性黃鱔組織切片中可觀察到精母細(xì)胞，且?guī)в泻谏唿c(diǎn)，P450arom主要分布在各級精母細(xì)胞上，染色較淺（圖3）。

2.2 芳香化酶（P450arom）在黃鱔腦組織中的定位

在黃鱔的腦組織中，芳香化酶主要分布在神經(jīng)細(xì)胞的胞核內(nèi)（圖4 A、B、C）。對照組無陽性細(xì)胞（圖4 D）。且芳香化酶在雌性（圖4 A）雌雄間性（圖4 B）、雄性（圖4 C）黃鱔的腦組織中的染色越來越淺。

3 討論

黃鱔屬于硬骨魚綱，黃鱔亞科，是一種具有天然單向性逆轉(zhuǎn)特性的動物。雌性發(fā)育的第一個周期內(nèi)黃鱔個體性腺全部表現(xiàn)為雌性特征，性成熟后，卵巢內(nèi)卵細(xì)胞逐漸凋亡，卵巢結(jié)構(gòu)趨于退化，與此同時雄性生殖細(xì)胞開始發(fā)育，通過雌雄間性發(fā)育過渡到雄性表征。

目前關(guān)于魚類性腺分化的機(jī)理目前尚不清楚，現(xiàn)有的研究結(jié)果更多的是傾向于性激素比率假說和下丘腦控制學(xué)說[6]，認(rèn)為魚類性腺分化與雄激素/ 雌激素比值的高低密切相關(guān)，而芳香化酶能夠催化睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇，所以芳香化酶與魚類性腺分化可能存在潛在的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化技術(shù)系統(tǒng)研究芳香化酶在黃鱔性腺和腦組織上的分布。

在雌性黃鱔的性腺中，可清晰地看到不同形狀的卵母細(xì)胞，不少卵黃顆粒沉積在細(xì)胞內(nèi)，有的卵黃顆粒充滿整個卵母細(xì)胞，核也逐漸邊移。同時，卵巢內(nèi)存在少數(shù)一、二期的卵母細(xì)胞。免疫組化結(jié)果表明，芳香化酶主要分布在成熟卵母細(xì)胞的胞質(zhì)上，不成熟的卵母細(xì)胞、卵泡膜和胞核呈陰性。由此看來，成熟卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)換雄激素為雌激素的能力大于未成熟的卵母細(xì)胞。同時，我們發(fā)現(xiàn)卵泡體積越大，染色越深，這意味著芳香化酶的活性隨著卵泡體積的增大而增加。

在雌雄間性的黃鱔中，顯微鏡下可見較少的細(xì)小卵細(xì)胞，但幾乎不能發(fā)育成熟，而是逐漸凋亡吸收，同時可看到曲精小管的雛形。芳香化酶主要分布在退化卵母細(xì)胞膜和縱隔上。其染色較淺，意味著活性減弱，芳香化酶活性減弱直接導(dǎo)致血液中雌二醇水平降低，從而加快了卵母細(xì)胞退化速度，促進(jìn)雄性生殖細(xì)胞增殖。

在雄性黃鱔中，可見未成熟的精巢細(xì)長，表面有色素斑點(diǎn)，黑色斑點(diǎn)可能是卵母細(xì)胞退化凋亡的痕跡。顯微鏡下可見曲精小管及精子，成熟的黃鱔精巢表面有黑色細(xì)紋，并且存在大量成熟的精子。免疫組化結(jié)果顯示，芳香化酶在黃鱔睪丸中的表達(dá)呈弱陽性，主要分布在睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞和生精細(xì)胞中。杜啟艷等[7]采用半定量RT-PCR方法研究芳香化酶在泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）各組織中的表達(dá)時發(fā)現(xiàn)在睪丸中幾乎無表達(dá)。由此可見，芳香化酶在不同魚類睪丸中的表達(dá)并不一致。

芳香化酶在腦組織免疫組化結(jié)果表明，它主要分布在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，這意味著它可能直接參與調(diào)節(jié)雌激素的合成，從而影響黃鱔的性別分化。芳香化酶可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)上參與調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌[8]。這和其他魚類P450arom 在腦組織的表達(dá)研究結(jié)果不完全相同[9]。Kishida M使用Northern 雜交發(fā)現(xiàn)P450arom在斑馬魚的腦沒有表達(dá)[10]。造成各研究結(jié)果不同可能與所研究魚的類別、生長發(fā)育階段有關(guān)。芳香化酶在雌性、雌雄間性、雄性黃鱔的腦組織中的染色越來越淺，這意味著芳香化酶的活性愈來愈弱，即雌激素的水平愈來愈低。

由此看來，黃鱔中芳香化酶的活性與個體發(fā)育階段和性別密切相關(guān)，這與Anderson E[11]的結(jié)果類似。同時進(jìn)一步證明了芳香化酶參與黃鱔的性逆轉(zhuǎn)過程，通過生殖軸對未分化的性腺產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響腦和性腺的性別分化。目前，對黃鱔的性逆轉(zhuǎn)發(fā)生的機(jī)制并沒有徹底研究清楚，有必要對芳香化酶進(jìn)行進(jìn)一步研究，以闡明黃鱔腦及性腺性別決定和分化的機(jī)制。

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