葉文芳+劉健+黃永平+黃雄峰+王敘德+潘淳

【摘 要】目的：分析39例強直性脊柱炎患者和20例健康體檢者的血清免疫球蛋白（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、SIgA、IgM）、淋巴細胞自噬蛋白Beclin1、自噬指標微管相關(guān)蛋白l輕鏈（LC3-Ⅱ）、磷脂酰肌醇三磷酸激酶（PI3K）、AKT、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），觀察上述指標的變化并對其相關(guān)因素進行分析。方法：選取39例強直性脊柱炎患者為AS組，另設20例健康體檢者為健康對照組，采用ELISA方法檢測2組血清免疫球蛋白（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、SIgA、IgM），運用Western blot方法檢測2組淋巴細胞自噬蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、PI3K、AKT、mTOR的變化。結(jié)果：①2組

免疫球蛋白比較，IgA、IgG1、IgG3較健康對照組顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。②2組細胞自噬相關(guān)指標比較，PI3K、mTOR較健康對照組明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）。③相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AS患者PI3K與LC3-Ⅱ呈負相關(guān)。④相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AS患者IgG1、IgG2、IgG3、IgG4與mTOR呈正相關(guān)，SIgA與Beclin1呈正相關(guān)。結(jié)論：AS患者存在體液免疫功能的紊亂和細胞自噬指標的變化，且各項指標存在一定的相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 脊柱炎，強直性；免疫球蛋白；自噬蛋白；自噬通路

Changes and Correlation Analysis of Immunoglobulin and Autophagy in Patients with Ankylosing Spondylitis

YE Wen-fang，LIU Jian，HUANG Yong-ping，HUANG Xiong-feng，WANG Xu-de，PAN Chun

【ABSTRACT】Objective：To observe the changes and analyze the related factors of serum immunoglobulin（IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，SIgA，IgM），lymphocyte autophagy protein Beclin1，LC3-Ⅱ，PI3K，AKT and mTOR in 39 patients with ankylosing spondylitis and 20 healthy subjects.Methods：Thirty nine cases of ankylosing spondylitis were selected as an AS group，and 20 healthy subjects were selected as a control group，using ELISA method to detect serum immunoglobulin（IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，SIgA，IgM） of the two groups，and using Western blot to detect the changes of Beclin1，LC3-Ⅱ，PI3K，AKT and mTOR.Results：①According to the comparison of immunoglobulin of the two groups，the levels of IgA，IgG1 and IgG3 in the AS group were significantly higher than those in the control group（P < 0.05 or P < 0.01）.②PI3K and mTOR of the AS group were obviously higher than those in the control group（P < 0.05 or P < 0.01）.③Correlation analysis showed that PI3K in the AS group was negatively correlated with LC3-Ⅱ.④Correlation analysis showed that IgG1，IgG2，IgG3 and IgG4 in the AS group were positively correlated with mTOR，and SIgA were positively correlated with Beclin1.Conclusion：There are changes of humoral immune function and autophagy index in patients with ankylosing spondylitis，and there is a certain correlation between the indexes.

【Keywords】spondylitis，ankylosing；immunoglobulin；autophagy protein；autophagy pathway

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種慢性進行性脊柱關(guān)節(jié)病，屬于自身免疫性疾病。本病早期無特異性癥狀，可出現(xiàn)炎癥性腰背痛和腰背部僵硬，晚期可發(fā)生永久性關(guān)節(jié)畸形。早期診斷有助于控制病情進展，減少致殘率，對AS的治療具有重要意義[1]。據(jù)報道，AS患者體內(nèi)存在免疫球蛋白的異常[2]。筆者分別對20例健康體檢者和39例AS患者的血清免疫球蛋白（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、SIgA、IgM）、淋巴細胞自噬蛋白Beclin1、自噬指標微管相關(guān)蛋白l輕鏈（LC3-Ⅱ）、磷脂酰肌醇三磷酸激酶（PI3K）、AKT、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）進行檢測，并對各項指標進行分析，從免疫球蛋白和細胞自噬的新角度研究，希望能指導AS的早期診斷、治療及預后。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2013年10月至2014年3月在安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院住院的AS患者39例為AS組，其中男31例，女8例，男女比為3.9∶1；年齡15～65歲，平均（33.15±11.24）歲；病程0.08～40年，平均（6.51±6.86）年。20例健康對照組均選自同一時間的門診健康體檢者，男

14例，女6例；年齡20～65歲，平均（30.62±

9.07）歲。2組患者在性別、年齡等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 診斷標準 符合1984年美國風濕病學會（ACR）修訂的紐約診斷標準[3]。

1.3 納入標準 ①符合上述診斷標準；②患者知情同意，并簽署知情同意書。

1.4 排除標準 ①合并心、腎、肝、肺、造血系統(tǒng)等基礎(chǔ)疾病者；②伴有其他自身免疫性疾病等嚴重原發(fā)性疾病者；③不能配合治療的精神病患者。

2 研究方法

2.1 ELISA方法檢測IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、

IgA、SIgA、IgM 于清晨采集所有研究對象空腹肘靜脈血10 mL，置普通采血管內(nèi)，將標本放置于試管架上，在室溫下靜置2 h。隨后，將標本放入水平離心機內(nèi)3000 r·min-1離心15 min，用滴管分離出血清并放于-80 ℃冰箱中直至使用，避免反復凍融。各亞型免疫球蛋白的測定均采用ELISA試劑盒S進行，操作前將試劑在室溫下平衡30～60 min。實驗過程嚴格按照說明書進行操作。

2.2 Western blot方法檢測Beclin1、LC3-Ⅱ、PI3K、

AKT、mTOR 室溫下采集所有研究對象空腹靜脈血10 mL于2個真空肝素鈉抗凝管中，并加入與血液等量的淋巴細胞分離液，水平移動抗凝管，放入離心機內(nèi)2000 r·min-1離心20 min，試管中云霧狀層，為單個核細胞層，吸取該層，用等量的PBS沖洗兩次后，放置于離心機內(nèi)1500 r·min-1離心5 min，上述操作重復2次。沉于試管底部呈淡黃色者即為淋巴細胞，吸取該層存于EF管內(nèi)，置于-80 ℃冰箱中保存，用于Western blot檢測。采血、分離淋巴細胞的整個過程不得超過2 h，避免標本反復凍融[4]。

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，采用Spearman相關(guān)性分析，分析數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 2組免疫球蛋白亞型比較 2組比較，AS 組IgG1、IgG3、IgA較健康對照組顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

3.2 2組細胞自噬相關(guān)指標比較 2組比較，AS組PI3K、mTOR較健康對照明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

3.3 AS患者細胞自噬蛋白與PI3K-AKT-mTOR信號通路相關(guān)性分析 AS患者PI3K與LC3-Ⅱ呈負相關(guān)，AKT、mTOR與Beclin1、LC3-Ⅱ均無相關(guān)性。見表3。

3.4 AS患者免疫球蛋白與細胞自噬指標的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：AS患者IgG1、IgG2、IgG3、IgG4與mTOR呈正相關(guān)，SIgA與Beclin1呈正相關(guān)；免疫球蛋白各亞型與LC3-Ⅱ、PI3K、AKT無明顯相關(guān)性。見表4。

4 討 論

AS是一種較為常見的自身免疫性疾病，以中軸關(guān)節(jié)、骶髂關(guān)節(jié)、外周關(guān)節(jié)及肌腱附著點的慢性炎癥為特征。早期表現(xiàn)為腰背僵痛，晚期可發(fā)生脊柱強直以及嚴重功能障礙。王倩倩等[5-6]認為，可能有多種免疫炎癥因子參與了AS的發(fā)病。免疫球蛋白是重要的免疫學指標，其異常對AS診斷、治療和預防具有一定的意義。防止感染、防御異物是體液免疫的兩大基本功能[7]。B細胞是體液免疫的重要執(zhí)行細胞，其活化是機體產(chǎn)生保護性抗體的關(guān)鍵步驟[8]。人體執(zhí)行體液免疫功能是免疫球蛋白，免疫球蛋白是由B淋巴細胞經(jīng)抗原刺激而產(chǎn)生[9]。起主要作用的免疫球蛋白有IgG、IgM和IgA，它們是人體內(nèi)重要的免疫抗體，免疫球蛋白在體內(nèi)的水平可以反映體液免疫的情況[10]。細胞自噬是自我平衡的一個過程，通過溶酶體降解受損的細胞器及大分子物質(zhì)的過程，它不僅對多種組織細胞具有保護作用，還可防止細胞壞死[11]。自噬功能的缺陷會增加自身免疫性疾病的發(fā)病[12]。BAFF主要作用于外周B淋巴細胞，通過其受體BAFF-R激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，進而促進各亞型免疫球蛋白的分化[13]。PI3K/Akt/mTOR信號通路參與了淋巴細胞增殖和存活[14]。此外，該信號通路在細胞自噬中也起著調(diào)節(jié)作用[10]。PI3K/Akt/mTOR信號通路是目前研究的熱點之一。本實驗結(jié)果顯示，AS患者存在體液免疫功能的紊亂和細胞自噬指標的變化，且各項指標存在一定的相關(guān)性。

張鳳等[1]研究發(fā)現(xiàn)，AS患者體內(nèi)常存在免疫球蛋白含量的異常，這提示著AS患者存在體液免疫功能亢進。參與體液免疫的免疫球蛋白主要有IgG、IgA、IgM，其中IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，它是反映機體免疫水平的重要指標之

一[15]。人IgG有IgG1、IgG2、IgG3和IgG4共

4個亞類。有研究表明，自身免疫性抗體增多時，患者常伴有IgG1的升高[16]。這與臨床實踐相符，臨床上IgG1升高的患者，常伴有自身免疫性疾

病[17]。IgG中IgG3活性最強[18]。在自身免疫性疾病過程中有顯著性變化，它對疾病的選擇治療措施和干預藥物有輔助指導意義[19]。IgG4是免疫球蛋白G中含量最低的一種亞型，其敏感性和特異性分別為95.1%和90.76%[20]。既往研究表明，AS患者存在血清IgG4水平升高[21]。有研究表明，IgA水平可以反映AS的疾病活動度。AS患者關(guān)節(jié)病痛加重時，IgA含量相對增加[22]。IgM是急性免疫炎癥反應的指標，它出現(xiàn)時間早、存留時間最短[9]。IgM也是體液免疫應答中最早出現(xiàn)的抗體，不過目前研究較少[7]。

Beclin-1基因是最早發(fā)現(xiàn)的自噬基因，為自噬標記蛋白，參與自噬體膜形成過程[23]。微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）的表達強度與自噬活性密切相關(guān)[24]。LC3修飾泛素樣蛋白的過程在自噬泡形成中至關(guān)重要[25-26]。LC3是自噬標志性蛋白，有

Ⅰ型和Ⅱ型之分，Ⅰ型向Ⅱ型的轉(zhuǎn)化，為自噬小體形成的標志[27]。LC3-Ⅱ定位于前自噬體和自噬體，是自噬體特異性標記蛋白[28]。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，是細胞自噬主要的發(fā)生機制[29]。PI3K是一種膜蛋白[30]，自噬體形成中，PI3K也具有重要的調(diào)控作用[31]。AKT是細胞生存的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，PI3K活性的增加能促進AKT的活

性[32]。PI3K激活后，PIP2受到催化，生成PIP3，

激活AKT[33]。mTOR能調(diào)節(jié)細胞的生長與增殖，為細胞自噬負調(diào)控分子[28]。BAFF通過PI3K的磷酸化作用增加Akt和mTOR的表達[34]。

本研究發(fā)現(xiàn)，AS患者IgG1、IgG2、IgG3、IgG4與mTOR呈正相關(guān)，SIgA與Beclin1呈正相

關(guān)；PI3K與LC3-Ⅱ呈負相關(guān)。B細胞激活因子（BAFF）能誘導B淋巴細胞增殖、分化和分泌免疫球蛋白，增強體液免疫應答[14]。BAFF與BAFF-R的結(jié)合還可激活PI3K，從而活化AKT和mTOR，促進B細胞存活的信號通路[35-36]。有研究稱，PI3K/Akt/mTOR信號通路的上游可能是BAFF/BAFF-R，BAFF/BAFF-R能促進B淋巴細胞存活、增殖、抗原呈遞[14]。PI3K/AKT/mTOR信號通路與類風濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病密切相關(guān)，也是目前的研究熱點[37]。體液免疫與PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)，AS患者細胞自噬與PI3K/AKT/mTOR信號通路也相關(guān)，當機體體液免疫增強的同時，PI3K/AKT/mTOR信號激活，細胞自噬受到抑制[4]。目前自身免疫性疾病細胞自噬的研究尚少，本文從免疫球蛋白和細胞自噬的新角度，加強對AS患者細胞自噬的研究，探究其與體液免疫的關(guān)系，研究AS的發(fā)病機制，希望為AS的治療提供新思路。

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收稿日期：2017-01-01；修回日期：2017-06-20