施勇，龔甜，李健雄，肖芳，周珺，熊英

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

三種實(shí)驗(yàn)室檢測方法在瘧疾檢測中的應(yīng)用比較

施勇，龔甜，李健雄，肖芳，周珺，熊英

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

目的探討三種實(shí)驗(yàn)室檢測方法對(duì)瘧疾檢測的應(yīng)用價(jià)值。方法分別采用傳統(tǒng)鏡檢法、巢式聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法及實(shí)時(shí)熒光（Real-Time）PCR法，對(duì)江西省2012年-2014年的61份瘧疾疑似病例血樣進(jìn)行檢測。結(jié)果巢式PCR法和Real-Time PCR法的結(jié)果一致，與鏡檢結(jié)果有17份樣本不一致。結(jié)論巢式PCR法和Real-Time PCR法檢測瘧疾感染具高度敏感性和特異性，對(duì)瘧疾鑒別診斷和明確診斷具有重要價(jià)值。

瘧疾；巢式聚合酶鏈反應(yīng)；鏡檢法

瘧疾是經(jīng)蚊媒傳播的重要熱帶病，也是嚴(yán)重危害人類身體健康和生命安全及社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要寄生蟲病[1]，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。在目前瘧疾防治和監(jiān)測工作中，鏡檢仍為發(fā)現(xiàn)瘧疾病例的主要手段[2]，但傳統(tǒng)的鏡檢方法檢出率低并費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且鏡檢人員的專業(yè)素質(zhì)和經(jīng)驗(yàn)會(huì)直接影響結(jié)果的判定，當(dāng)原蟲密度較低時(shí)，鏡檢容易出現(xiàn)漏檢，對(duì)于國內(nèi)少見的卵形瘧和三日瘧，容易錯(cuò)判。近年來國內(nèi)外將巢式PCR和Real-Time PCR技術(shù)應(yīng)用于瘧疾的快速檢測和分型[3]，能準(zhǔn)確判斷疑似病例是否感染或攜帶瘧原蟲，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)和采取必要的防控措施。

本研究采用姬氏染色鏡檢、巢氏PCR及實(shí)時(shí)熒光（Real-Time）PCR法3種方法對(duì)江西省2012年-2014年各地市疾控中心上送的61份瘧疾疑似病例血樣進(jìn)行檢測，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，比較其優(yōu)缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 瘧疾樣本江西省2012年-2014年各地市疾控中心上送的61份瘧疾疑似病例血樣。

1.2 儀器和試劑核酸提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit）購自德國Qiagen公司；PCR Master Mix (LOT.0000031171)購自美國Promega公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司，循環(huán)擴(kuò)增儀購自美國Bio-rad公司，凝膠成像系統(tǒng)購自法國VILBER LOURMAT公司，熒光PCR儀為ABI7500。

1.3 顯微鏡檢查以姬氏染色法染色厚薄血片，參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-瘧疾診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS259-2015）附錄B《病原學(xué)檢查》規(guī)范要求，進(jìn)行厚薄血膜制作與吉氏染色，顯微鏡油鏡下檢查。

1.4 巢氏PCR檢測用QIAamp DNA Mini Kit核酸提取試劑盒提取濾紙血中的瘧原蟲基因組DNA，按說明書操作，獲得100μl DNA，－70℃保存。對(duì)核酸進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。反應(yīng)體系（25μl）：2×PCR Master Mix 12.5μl，上、下游引物（10μmol/ μl）各1μl，模板DNA 5μl（第1輪），用ddH2O補(bǔ)至25μl。反應(yīng)條件：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃1min 40s，共35個(gè)循環(huán)；72℃10min。取第一輪PCR產(chǎn)物1μl為模板DNA進(jìn)行第二輪PCR，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定第二輪PCR產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.5 實(shí)時(shí)熒光（Real-Time）PCR檢測用上海之江的商品化試劑盒按照說明書進(jìn)行檢測，試劑盒分別為瘧原蟲核酸測定試劑盒（貨號(hào)ED-0066-02），惡性瘧核酸測定試劑盒（貨號(hào)ED-0214-02），卵形瘧核酸測定試劑盒（貨號(hào)ED-0215-02），三日瘧核酸測定試劑盒（貨號(hào)ED-0216-02），間日瘧核酸測定試劑盒（貨號(hào)ED-0217-02），卵形瘧原蟲Wallikeri亞種核酸測定試劑盒（貨號(hào)ED-0425-02）。

2 結(jié)果

比較、分析61份樣品的檢測結(jié)果，61份樣品為2012年-2014年各地市疾控中心采集并鏡檢陽性樣本，上送至省疾控中心，均為輸入性瘧疾病例，其鏡檢結(jié)果為44份惡性瘧，13份間日瘧，4份瘧疾未分型。而巢式PCR法和Real-Time PCR法的結(jié)果一致，其結(jié)果為44份惡性瘧，6份間日瘧，1份卵形瘧，1份三日瘧，2份惡性瘧和三日瘧混合感染，其余7份陰性。PCR檢測結(jié)果與鏡檢結(jié)果有44份一致，其中惡性瘧39份，間日瘧5份；有17份樣本與鏡檢結(jié)果不一致（表2）。

表1 巢氏PCR檢測瘧原蟲種類的引物及其擴(kuò)增產(chǎn)物長度

表2 61份樣本鏡檢法與巢式PCR法和Real-Time PCR法結(jié)果比較

3 討論

瘧疾診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS259-2015）中規(guī)定的三種實(shí)驗(yàn)室檢查中，以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的血涂片顯微鏡檢查，是多數(shù)基層醫(yī)療單位主要或唯一的診斷手段，其敏感度可達(dá)到血樣10～20個(gè)原蟲/μl[4]。該方法簡便、經(jīng)濟(jì)，適用于基層應(yīng)用；缺點(diǎn)是結(jié)果判讀受檢驗(yàn)人員鏡檢技術(shù)、制片染色技術(shù)、顯微鏡質(zhì)量和視力疲勞程度等因素影響，導(dǎo)致瘧疾病例的確診與鑒別診斷困難[5]。特別在瘧原蟲混合感染或藥物治療后，瘧原蟲形態(tài)遭到破壞，給原蟲染色鏡檢增加非常大的難度[6]，而以分子形式存在血液中的核酸不受破壞，仍可被檢出。本研究中，經(jīng)過巢式PCR法和Real-Time PCR法的復(fù)核檢測，鏡檢有5份惡性瘧和8份間日瘧發(fā)生了誤診，對(duì)瘧疾病例的治療帶來了一定的影響。

PCR檢測是通過體外擴(kuò)增，使得特異性靶DNA序列拷貝數(shù)在數(shù)小時(shí)內(nèi)成百萬倍的增加，大大提高了檢測的敏感性。檢測間日瘧和惡性瘧的敏感度血樣分別為0.1個(gè)原蟲/μl[7]和1.5個(gè)原蟲/ μl[8]，顯著高于其他檢查方法。而且PCR檢測瘧疾具有瘧原蟲種、株的鑒別能力，并能方便地檢測出鏡檢漏診的混合感染。近年來，許多學(xué)者用PCR技術(shù)檢測瘧原蟲的實(shí)驗(yàn)室研究中，均顯示了PCR在瘧疾診斷中比鏡檢檢測方法更具敏感性及特異性[9-11]。本研究中，巢式PCR法和Real-Time PCR法檢出了鏡檢漏檢的2例混合感染的病例，并對(duì)鏡檢未能分型的4份瘧疾病例進(jìn)行了分型，其中1份惡性瘧，1份三日瘧，2份陰性，由于不同型別的瘧疾治療藥物有所不同，瘧疾病例正確的分型對(duì)于治療來說意義重大。

由于人群對(duì)瘧疾抵抗力的增強(qiáng)，加上抗瘧藥的濫用，病人治療不規(guī)范等，使傳染源多為低密度帶蟲者。常規(guī)鏡檢法不易檢出，常出現(xiàn)漏診，使傳染源不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和徹底根除。因此，PCR作為高度敏感、高度特異的瘧疾診斷技術(shù)，更能適應(yīng)瘧疾監(jiān)測、診斷和鑒別診斷的需要[12]，并為下一步的治療提供最正確的科學(xué)依據(jù)。隨著PCR技術(shù)的日趨成熟和檢測成本的降低，在瘧疾防治、監(jiān)測中，將具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值和前景。

[1]衛(wèi)生部疾控預(yù)防控制局．瘧疾防治手冊[M].第3版.北京：衛(wèi)生部，2010．

[2]劉秋蓮，賴云英，張水生.瘧疾患者骨髓片與血片瘧原蟲陽性率比較[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，31(10)：503-504.

[3]Xia H，Shen YZ，Gao Q，et al.Field evaluation for malaria surveillance using a Plasmodium vivax PCR detection kit[J].Chin J Parasit Dis Contorl，2000，13(4)：247-249.

[4]Bruce?Chwatt LJ.DNA probes for malaria diagnosis[J].Lancet，1984，323（8380）：795.

[5]巫學(xué)蘭.瘧原蟲鏡檢及鑒定方法探討[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，4(29)：200-201.

[6]張勤，羅忠鑫，侯瑞生，等.瘧疾四重巢式PCR檢測方法的建立[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2015，38（1）：13-16，20.

[7]諸欣平，李明，董潔，等.套式PCR擴(kuò)增特定SSrRNA基因片段診斷間日瘧及混合感染的研究[J].中國寄生蟲病防治雜志，1998，11（2）：92-95.

[8]孫明林，陳培霞，薛采芳，等.套式PCR檢測濾紙干血滴中惡性瘧原蟲的研究[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1996，14（3）：197-200.

[9]林敏，高世同.PCR檢測瘧疾混合感染的現(xiàn)場應(yīng)用研究[J].中國寄生蟲病防治雜志，2004，17（3）：162-163.

[10]夏惠，沈毓祖，高琪，等.間日瘧原蟲PCR檢測試劑盒用于瘧疾監(jiān)測的現(xiàn)場評(píng)價(jià)[J].中國寄生蟲病防治雜志，2000，13（4）：247-249.

[11]吳英松，江曉玲，李明，等.聚合酶鏈反應(yīng)檢測瘧疾的研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2001，1（1）：50-52.

[12]張勤，侯瑞生，薛云紅，等.多重巢式聚合酶鏈反應(yīng)在瘧疾混合感染檢測與分型中的應(yīng)用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2015，34（2）：182-186.

R531.3，R446.11+1，R446.62

A

1674-1129(2017)04-0545-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.032

2016-09-19；

2017-06-12)