周志敏

(許昌市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南許昌461000)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝硬化發(fā)病中的作用及意義

周志敏

(許昌市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南許昌461000)

目的檢測(cè)病毒性肝硬化患者外周血Treg細(xì)胞和IL-10細(xì)胞因子表達(dá)的變化，探討其相關(guān)的臨床意義。方法收集2014年6月到2016年6月我院收治的病毒性肝硬化患者84例，另取同期我院健康體檢者40例作為正常對(duì)照。Treg細(xì)胞的表達(dá)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，IL-10的表達(dá)使用ELISA法檢測(cè)。結(jié)果對(duì)照組Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)分別為5.14±1. 82%和21.14±4.22ng/L，肝硬化組為2.56±1.02%和9.53±2.61ng/L，對(duì)照組上述指標(biāo)均顯著高于肝硬化組（P＜0.05，P＜0.01）。Child-Pugh評(píng)分分級(jí)A級(jí)、B級(jí)和C級(jí)患者Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)各級(jí)之間存在顯著性差異（P＜0.05），其中A級(jí)顯著高于B級(jí)（P＜0.05），B級(jí)又顯著高于C級(jí)（P＜0.05）。Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)在乙肝病毒性肝硬化患者和丙肝病毒性肝硬化患者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論病毒性肝硬化患者外周血中Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)均減低，提示其可能參與了肝硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，并可能為肝硬化的治療提供新思路。

病毒性肝硬化；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；白細(xì)胞介素-10

肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，病毒感染、酒精中毒、膽汁淤積、血吸蟲感染等是其常見的病因[1]，其中病毒感染是我國(guó)肝硬化的主要原因。病毒感染長(zhǎng)期或反復(fù)作用可形成彌漫性的肝損害，已被大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察所證實(shí)，但其具體的作用機(jī)制仍未明了[2]，給肝炎病毒感染患者肝硬化的防治工作帶來(lái)一定的障礙，因此研究病毒損傷肝細(xì)胞的作用機(jī)制具有顯著的臨床意義[3]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞亞群[4]，Treg細(xì)胞分泌的IL-10等細(xì)胞因子具有減低炎癥反應(yīng)的作用[5]。本文通過(guò)檢測(cè)肝硬化患者外周血Treg細(xì)胞與IL-10細(xì)胞因子表達(dá)的變化情況，探討其與肝硬化的相關(guān)性，為該病的發(fā)病機(jī)制和臨床防治等提供更多的思路。

1 一般資料與方法

1.1 一般資料本文選取河南省許昌市人民醫(yī)院2014年6月到2016年6月收治的病毒性肝硬化患者84例，其中男47例，女37例，年齡28～67歲，平均41.6±11.3歲，乙肝病毒性肝硬化42例，丙肝病毒性肝硬化42例。肝硬化診斷符合2009美國(guó)肝硬化指南，84例患者參照Child-Pugh評(píng)分分為[6]：A級(jí)26例（5～6分），B級(jí)28例（7～9分），C級(jí)30例（10～15分）。排除對(duì)象：酒精性肝硬化、膽汁性肝硬化、惡性腫瘤、并發(fā)其它免疫和結(jié)締組織疾病。并選取同期在我院行健康體檢者40例作為對(duì)照組，其中男性21例，女性19例，年齡29～68歲，平均年齡42.2±10.7歲。兩組受試者在性別、年齡等一般臨床資料方面比較，無(wú)顯著性差異，可進(jìn)行比較（P＞0.05）。

1.2 Treg細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)取所有受試者外周靜脈抗凝血5ml，并采用密度梯度離心分離法分離單個(gè)核細(xì)胞，分離液試劑盒購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，1500g×20min，單個(gè)核細(xì)胞層即血漿層和分離液交界處，吸取單個(gè)核細(xì)胞層。將細(xì)胞濃度調(diào)整為106個(gè)細(xì)胞/ml，并在400μl懸浮液中加入R&D公司生產(chǎn)的FITCCD25與PE-CD4抗體以及相應(yīng)的同型對(duì)照，并在室溫避光下孵育30min。同型對(duì)照調(diào)零，使用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD25及CD4雙陽(yáng)性的Treg細(xì)胞。

1.3 血清白介素-10（IL-10）表達(dá)的測(cè)定取所有受試者外周靜脈血2ml，1500g×15min，并分離上清待測(cè)。采用ELISA法測(cè)定血清IL-10表達(dá)，試劑盒為深圳達(dá)科為生物科技技術(shù)有限公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)艾迪(AID)公司提供的酶聯(lián)分析儀測(cè)定OD值，并根據(jù)OD值計(jì)算IL-10濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法文中所涉及的數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)包處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)連續(xù)性資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本均數(shù)比較行t檢驗(yàn)，外周血Treg細(xì)胞、IL-10與肝癌Child-Pugh評(píng)分的關(guān)系應(yīng)用Pearson單因素分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組在外周血Treg細(xì)胞和IL-10表達(dá)上的變化對(duì)照組Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)分別為5.14±1.82%和21.14±4.22ng/L，肝硬化組為2.56± 1.02%和9.53±2.61ng/L，對(duì)照組上述指標(biāo)均顯著高于肝硬化組（P＜0.05，P＜0.01）。見表1和圖1。

表1 兩組Treg細(xì)胞和IL-10表達(dá)的比較

圖1 Treg細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

2.2 肝硬化患者不同分級(jí)中Treg細(xì)胞和IL-10表達(dá)的變化肝硬化Child-Pugh評(píng)分分級(jí)A級(jí)、B級(jí)和C級(jí)患者Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)各級(jí)之間存在顯著性差異（P＜0.05），其中A級(jí)顯著高于B級(jí)（P＜0.05），B級(jí)也顯著高于C級(jí)（P＜0.05）。見表2。

表2 三組Treg細(xì)胞和IL-10表達(dá)的比較

2.3 不同病毒感染者之間Treg細(xì)胞和IL-10表達(dá)的變化從表3可見Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)在乙肝病毒性肝硬化患者和丙肝病毒性肝硬化患者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表3 兩組Treg細(xì)胞和IL-10表達(dá)的比較

2.4 外周血Treg細(xì)胞、IL-10與肝癌Child-Pugh評(píng)分的關(guān)系經(jīng)Pearson單因素分析可知，外周血Treg細(xì)胞、IL-10與肝癌Child-Pugh評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.352，-0.366，P=0.000）

3 討論

病毒引起肝硬化的致病機(jī)制至今尚不清楚，目前認(rèn)為涉及多種因素，隨著相關(guān)研究的不斷深入，最近幾年來(lái)免疫系統(tǒng)的紊亂引起了學(xué)者的注意，成為了研究該病的新型熱點(diǎn)[7]。Treg細(xì)胞能夠下調(diào)機(jī)體對(duì)異體抗原或自身抗原的免疫應(yīng)答水平，起到免疫抑制的作用，同時(shí)維持機(jī)體自身耐受[8，9]，而且作為肝硬化本身就是一種免疫耐受異常性的疾病，患者的免疫細(xì)胞在遭受病毒攻擊時(shí)也會(huì)相應(yīng)的損傷肝細(xì)胞，Tregs細(xì)胞可以通過(guò)T-T細(xì)胞間的相互接觸作用來(lái)降低CD8+T細(xì)胞的增殖和產(chǎn)生IFN-γ的能力[10，11]，這些都可以促進(jìn)組織纖維化的發(fā)生，本研究的結(jié)果顯示了肝硬化患者Tregs細(xì)胞比例顯著低于正常對(duì)照人群，IL-10是Tregs細(xì)胞分泌的主要效應(yīng)因子[12]，本研究也表明肝硬化患者IL-10表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，這提示肝硬化患者處于一種免疫抑制的狀態(tài)，這可能就是其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。

肝硬化Child-Pugh分級(jí)是綜合臨床、凝血、肝功能等實(shí)驗(yàn)室檢查的一種評(píng)價(jià)分級(jí)方法，分級(jí)與預(yù)后密切相關(guān)，A級(jí)預(yù)后最好，C級(jí)預(yù)后最差，B級(jí)介于中間[13]，本研究顯示A級(jí)、B級(jí)和C級(jí)患者Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)各級(jí)之間存在顯著性差異，其中A級(jí)顯著高于B級(jí)，B級(jí)顯著高于C級(jí)，經(jīng)Pearson單因素分析可知，外周血Treg細(xì)胞、IL-10與肝癌Child-Pugh評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明了Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)隨著患者病情的惡化而呈現(xiàn)減低的趨勢(shì)，Treg細(xì)胞的低表達(dá)可能參與了肝硬化病變的發(fā)展過(guò)程，Treg細(xì)胞的檢測(cè)可用于患者預(yù)后的評(píng)估[14，15]。導(dǎo)致肝硬化的病毒主要是乙型和丙型肝炎病毒，本研究顯示了Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)在乙肝病毒性肝硬化患者和丙肝病毒性肝硬化患者之間無(wú)顯著性差異，說(shuō)明了Treg細(xì)胞表達(dá)變化與病毒感染的類型無(wú)相關(guān)性，但病毒導(dǎo)致Treg細(xì)胞減低的原因有待進(jìn)一步的研究來(lái)探明。本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化組不只是CD4、CD25雙陽(yáng)的細(xì)胞減少了，CD25陰性CD4陽(yáng)性的細(xì)胞也少了，考慮可能原因?yàn)楦斡不颊咧蠺regs細(xì)胞可通過(guò)CTLA-4、TGF-β及GITR等與靶細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，并抑制靶細(xì)胞上IL-10Rα鏈的表達(dá)，降低靶細(xì)胞對(duì)IL-10的反應(yīng)性從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖有關(guān)[16]。

總之，本文研究結(jié)果顯示病毒性肝硬化患者外周血中Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)顯著減低，提示其可能參與了肝硬化的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，改善肝臟的抑制性微環(huán)境可能有助于肝硬化的治療。

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The Rose of CD4+CD25+Regulatory T cells in the Pathogenesis of Liver Cirrhosis

ZHOU Zhimin.Department of Laboratory，Xuchang People's Hospital，Xuchang Henan，461000，China.

Objective To detect the changes of Treg cells and the expression of IL-10 in the pathogenesis of liver cirrhosis and explore its clinical significance.Methods A total of 84 patients with virous liver cirrhosis from June 2014 to June 2016 were enrolled in this study，and 40 cases were chosen from the medical examination as normal control.The number of Treg cells in liver cirrhosis patients and normal control was analyzed by floe cytometry，and the expression of IL-10 was detected by Real-time PCR analysis.Results The percent of Treg cells and expression of IL-10 in control group were 5.14±1.82%and 21.14±4.22ng/L，which were respectively higher than 2.56±1.02%and 9.53±2.61ng/L in liver cirrhosis group(P＜0.05，P＜0.01).There was a significant difference in the expression levels Treg cells and IL-10 among Child-Pugh score grade A，B，and C group(P＜0.05)，the levels of which in grade B were significantly lower and higher than those in grade A and B(P＜0.05)，respectively.The ratio of Treg cells and expression of IL-10 were not significant between patients with hepatitis B virus and hepatitis C virus cirrhosis(P＞0.05).Conclusion The number of Treg cells and expression of IL-10 in PMBC of viral liver cirrhosis were decreased.It’s suggested that Treg cells and IL-10 might play a major role of in the pathogenesis and progress of liver cirrhosis，which could provide a new approach to the treatment.

∶Viral liver cirrhosis；Treg cells；IL-10

R446.62，R657.3+1

A

1674-1129(2017)04-0492-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.012

2016-12-06；

2017-06-10)

周志敏，女，1975年生，學(xué)士學(xué)位，本科，副主任技師，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，微生物及免疫學(xué)檢驗(yàn)。