張功亮，彭芳，王建，郭廣秀，王志

(贛州市人民醫(yī)院病理科，江西贛州341000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)方法在非小細(xì)胞肺癌靶向治療中意義的研究

張功亮，彭芳，王建，郭廣秀，王志

(贛州市人民醫(yī)院病理科，江西贛州341000)

目的為病人進(jìn)行靶向治療提供準(zhǔn)確可靠、方便快捷檢測方法。方法收集非小細(xì)胞肺癌患者細(xì)針穿刺、電子支氣管鏡刷檢液和胸水病例40例。用細(xì)針吸取標(biāo)本、電子支氣管鏡刷檢液和胸水離心標(biāo)本制作細(xì)胞塊、HE染色和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測標(biāo)本中的EGFR和ALK表達(dá)情況。結(jié)果40例細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：EGFR陽性15例（陽性率37.5%）；ALK陽性3例（陽性率7.5%）。結(jié)論細(xì)胞學(xué)可制備高質(zhì)量的細(xì)胞塊，能夠?yàn)椴∪诉M(jìn)行靶向治療提供準(zhǔn)確可靠、方便快捷檢測方法。

細(xì)胞塊；免疫細(xì)胞化學(xué)；肺癌；靶向治療

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，死亡率居惡性腫瘤之首。我國肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。近年來，隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)的發(fā)展和大量靶向藥物的研究和應(yīng)用，肺癌的治療已經(jīng)從傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化手術(shù)治療模式走上了以基因?yàn)閷?dǎo)向的個(gè)體化治療之路[1]。

目前單純的組織分型已不能滿足肺癌個(gè)體化治療的需求，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對不同組織亞型的肺癌再進(jìn)行EGFR和ALK蛋白的檢測，根據(jù)肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變譜指導(dǎo)靶向個(gè)體化治療已經(jīng)成為了現(xiàn)實(shí)[2-5]。

肺癌病人，特別是晚期病人無法對原發(fā)灶進(jìn)行活檢，多以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或胸腹水為表現(xiàn)的，我們通過細(xì)針穿刺、電子支氣管鏡刷檢液和胸水離心細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測EGFR和ALK，為病人進(jìn)行靶向治療指標(biāo)的病人提供準(zhǔn)確可靠、方便快捷檢測指導(dǎo)靶向用藥[6]。

我們收集我院非小細(xì)胞肺癌患者細(xì)針穿刺、電子支氣管鏡刷檢液和胸水病例40例。用細(xì)針吸取標(biāo)本、電子支氣管鏡刷檢液和胸水離心標(biāo)本制作細(xì)胞塊、HE染色和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測標(biāo)本中的EGFR和ALK表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集贛州市人民醫(yī)院醫(yī)院病理科2014年7月-2015年12月間，在我院非小細(xì)胞肺癌患者細(xì)針穿刺、電子支氣管鏡刷檢液和胸水病例40例?；颊吣行?8例，女性12例，年齡41~77歲，平均年齡62歲，所有病例均無放療、化療病史。

1.2 細(xì)胞塊的制備臨床懷疑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌的患者，穿刺前應(yīng)詳細(xì)詢問病史，仔細(xì)檢查腫物位置，大小，硬度，活動(dòng)度。穿刺時(shí)用左手固定腫物，右手持10ml注射器刺入腫物，保持針管內(nèi)負(fù)壓，快速提插10~30余次，以針尖斜面利刃對病變多次切割，并同時(shí)借助針管內(nèi)的持續(xù)負(fù)壓將切割獲得的標(biāo)本吸入針芯和針管內(nèi)，當(dāng)看到針芯有乳向色或血性成分抽出時(shí)既拔針，直接涂片2張，瑞氏染色作細(xì)胞學(xué)診斷[7-12]。

電子支氣管鏡刷檢液和胸水，靜置30min，倒去上清，取15ml液體離心，將沉渣涂片2張，瑞氏染色作細(xì)胞學(xué)診斷。

細(xì)胞塊制作：⑴標(biāo)本移出：借助空氣壓力將針管內(nèi)的穿刺標(biāo)本噴至載璃片上。⑵乙醇固定：用穿刺針將載玻片上的標(biāo)本聚集成一小團(tuán)，吸除多余的血液，將標(biāo)本放置2~5min，然后連同載玻片浸入95%的乙醇中2min。再用穿刺針將載玻片上標(biāo)本聚集成更小的團(tuán)塊，再次浸入95%的乙醇中2min，注意觀察制做的團(tuán)塊應(yīng)與載班片緊密連接，不從載玻片滑脫。⑶甲醛固定：將已經(jīng)凝固在載玻片上的標(biāo)本塊移至盛有中性甲醛的固定液的器皿中固定2h。⑷用手術(shù)刀片水平角度從載玻片上切下、平移已經(jīng)固定好的細(xì)胞塊，至普通包埋盒和正常組織一樣完成脫水和蠟過程。對細(xì)胞塊進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)切片，厚3～5μm，行常規(guī)HE染色和免疫組化標(biāo)記。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)方法免疫細(xì)胞化學(xué)試劑一抗采用福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)的EGFR和ALK。檢測系統(tǒng)采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。細(xì)胞塊石蠟切片厚度3～4μm，60℃烤箱烤片1h，梯度二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸泡5min，3%過氧化氫室溫孵育10min阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性，PBS液沖洗，高壓鍋抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫。加入二步法Elivision試劑盒中試劑A，室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次5min，加入試劑盒中試劑B，室溫下孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。鏡下控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗返藍(lán)，脫水，透明，中性樹膠封片，每次均做陽性對照及PBS代替一抗做陰性對照

1.4 結(jié)果判定免疫細(xì)胞化學(xué)判斷的標(biāo)準(zhǔn)：定位準(zhǔn)確，有棕黃色顆粒判讀為陽性，EGFR陽性定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜，ALK陽性定位于細(xì)胞質(zhì)核旁：腫瘤細(xì)胞核陽性細(xì)胞數(shù)的比例＜10%為陰性，＞10%為陽性，結(jié)果判定采用雙盲對照法觀察。

2 結(jié)果

穿刺細(xì)胞學(xué)制作細(xì)胞塊和電子支氣管鏡刷檢液和胸水離心后制作細(xì)胞塊檢查獲取的細(xì)胞量較多，并含有微小顆粒，保留部分組織結(jié)構(gòu)，可制備高質(zhì)量的細(xì)胞塊(圖1)，有助于做出細(xì)胞病理診斷。免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示細(xì)胞分布較均勻，陽性著色部位準(zhǔn)確，背景清晰（圖2）。40例細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：EGFR陽性15例（陽性率37.5%）；ALK陽性3例（陽性率7.5%）。

圖1 細(xì)胞塊HE染色×200

圖2 細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)EGFR×400

3 討論

EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，為cerbB(HER)家族中4個(gè)成員之一。非小細(xì)胞肺癌中EGFR突變率在在亞裔、女性、非吸煙、腺癌中EGFR突變率最高。針對EGFR的小分子酪氨酸激酶吉非替尼、厄洛替尼及?？颂婺帷Ｆ溆行灾饕憩F(xiàn)在對外顯子19缺失或外顯子2l L858R突變的肺腺癌治療中[1，13，14]。

ALK位于2號染色體短臂發(fā)生異位重排，與EML4基因融合，形成具有癌基因?qū)傩缘腅ML4-ALK，約有4%的非小細(xì)胞肺癌患者EML4-ALK融合基因陽性?；颊叨酁槟贻p、男性、不吸煙或少量吸煙腺癌患者。目前針對該靶點(diǎn)的藥物有Crizotini。

肺癌病人，特別是晚期病人無法對原發(fā)灶進(jìn)行活檢，多以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或胸腹水為表現(xiàn)的，我們通過細(xì)針穿刺、電子支氣管鏡刷檢液和胸水離心細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測EGFR和ALK，為進(jìn)行靶向治療的病人提供準(zhǔn)確可靠、方便快捷檢測指標(biāo)指導(dǎo)靶向用藥[15]。

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R446.8，R734.2

A

1674-1129(2017)04-0479-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.007

2017-02-22；

2017-05-29)

張功亮，男，1960年生，副主任醫(yī)師，從事病理診斷工作。

彭芳，女，1985年生，主治醫(yī)師，碩士研究生，病理與病理生理學(xué)專業(yè)。