李棟，張康，馬曉蕓，袁維秀，劉曉燕

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院 麻醉手術中心，北京 100853；2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850）

真核表達載體pEGFP-N1-ASIC2a的構建及功能驗證*

李棟1，張康2，馬曉蕓2，袁維秀1，劉曉燕2

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院 麻醉手術中心，北京 100853；2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850）

目的 構建含大鼠ASIC2a全長互補脫氧核糖核酸（cDNA）的綠色熒光蛋白真核表達質粒pEGFPN1-ASIC2a并轉染至HEK293細胞，觀察其表達和分布情況。方法 設計、合成ASIC2a基因引物，利用聚合酶鏈反應（PCR）技術，以現(xiàn)有質粒pcDNA3.1-ASIC2a為模板擴增出含有限制性內切酶（XhoⅠ與EcoRⅠ）酶切位點的ASIC2a基因片段與載體pEGFP-N1酶切后連接形成重組質粒pEGFP-N1-ASIC2a，并瞬時轉染至HEK293細胞中，利用細胞膜片鉗方法觀察其表達電流的情況。為進一步明確其亞細胞定位，將質粒EGFPN1-ASIC2a、pDsRed-Monomer-Mem和pDsRed2-ER共同轉染至HEK293細胞中。結果 PCR擴增得到正確的ASIC2a基因片段，酶切鑒定和測序證實獲得重組質粒pEGFP-N1-ASIC2a，并將其瞬轉至HEK293細胞后，成功記錄到ASIC2a同聚體電流。然后利用共轉染的方法觀察到，pEGFP-N1-ASIC2a主要在HEK293細胞內質網表達，細胞膜表達較少。結論 重組綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP-N1-ASIC2a構建成功，且在HEK293細胞中主要表達于內質網，為下一步研究ASIC2a的功能，特別是為ASIC2a在缺血性神經元損傷中的作用及其機制的研究奠定基礎。

ASIC2a；載體構建；真核表達載體；綠色熒光蛋白

酸感受離子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）屬于上皮鈉通道/退變素超家族中的一員，是一類質子（H+）激活對陽離子選擇性通透的非電壓依賴的配體門控性離子通道。目前，已經克隆出6種ASIC 的 亞 基 ：ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4。ASICs廣泛分布于哺乳動物的神經系統(tǒng)，參與體內包括疼痛、學習、記憶、突觸傳遞和可塑性調節(jié)等在內的多種生理和病理過程[1]。近年來，ASICs在腦缺血神經元損傷中的作用越來越受到人們的關注。

目前，針對ASIC1a和腦缺血神經元損傷的研究較多，普遍認為ASIC1a對腦缺后神經元損傷的發(fā)生具有促進作用，阻斷或下調其表達都能起到一定的神經保護作用[2-3]。但是，ASIC2a作為另一種在中樞神經系統(tǒng)中大量表達的ASICs亞基，關于其在腦缺血神經元損傷過程中的作用機制的研究還不是很多，且觀點不一。有文獻報道，在腦缺血后ASIC2a通道可能在缺血損傷過程中具有一定的腦保護作用[4]。有報道認為，ASIC2a通過促進ASIC1a的表達和上膜反而加重神經元的損傷[5]。本實驗擬構建含大鼠ASIC2a全長互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）的重組綠色熒光蛋白表達質粒，并將其轉染至HEK293細胞，使其表達有生物學活性的融合蛋白，觀察ASIC2a蛋白在細胞的表達和分布情況，為進一步研究ASIC2a在缺血性神經元損傷過程中的作用及其機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人HEK293細胞（由本室保存），質粒pcDNA3.1-ASIC2a（由本室保存[6]），pEGFP-N1、pDsRed-Monomer-Mem、pDsRed2-ER載體（購自美國Clontech公司），瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、質粒小量快速提取試劑盒和Top10感受態(tài)細胞（購自北京博邁德公司），脂質體LipofectamineTM2000（購自美國Invitrogen公司），高保真聚合酶及其他實驗中用到的限制性內切酶（購自遼寧省大連寶生物工程有限公司），DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，PBS）（購自美國Gibco公司產品），RIPA裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）配置試劑盒（購自北京康維世紀公司），苯甲基磺酰氟、各種蛋白酶抑制劑（購自美國Sigma公司），硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，NC）（購自美國Pall公司），小鼠抗綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）單克隆抗體（購自美國Affinity公司），二抗山羊抗小鼠IRDye 800CW（購自美國Li-Cor公司），其余常用化學試劑均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳槽、DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀和WD-9413B型凝膠圖像成像分析系統(tǒng)（均購自北京六一儀器廠），2720聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（美國Applied Biosystems公司），Biochrom Libra紫外分光光度計（英國Biochrom公司），BX-51型熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司），Mini-PROTEAN 3電泳系統(tǒng)（美國BioRad公司），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國Li-Cor公司），Axopatch-200B型膜片鉗放大器（美國Axon Instrument公司），Digidata-1322A型數(shù)模轉換器（美國Axon Instrument公司），P-97型玻璃記錄電極水平拉制儀（美國Sutter Instrument公司），BH-2型壓力給藥儀（美國Medical System公司）。

1.3 重組表達質粒載體的構建

1.3.1 目的片段的擴增及純化 根據基因庫（Gen-Bank）所提供的基因ASIC2a序列及pEGFP-N1提供的酶切位點設計引物。正向引物：5'-GCGCTCGA GATGGACCTCAAGGAGAGCCCCAG-3'，反向引物：5'-CGCGAATTCGGCAGGCAATCTCCTCCAGGGTGC-3'。應用上述引物擴增出ASIC2a。PCR反應液為：10×Pyrobest緩沖液Ⅱ 2 μl；Pyrobest DNA 聚合酶（5 u/μl）0.1 μl；正向引物（20 μmol）1 μl，反向引物（20 μmol）1 μl；dNTP 混合物（各 2.5 mmol）1.6 μl；模板pcDNA3.1-ASIC2a質粒0.5 ng，加滅菌去離子水至20 μl。PCR反應條件為：95℃下預變性5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min。35 個循環(huán)后72℃延時延伸7 min。PCR產物跑1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定，紫外燈下切下含有目的條帶的凝膠塊，按操作說明書用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的DNA片段。在回收的目的基因片段和pEGFP-N1載體中分別加入 1μlEcoRⅠ、1 μl XhoⅠ和2 μl 10×H buffer溶液，加去離子水至20 μl?；靹蚝笾糜?7℃水浴酶切3 h，酶切片段中加入適量溶膠液后轉移至吸附柱中進行目的基因片段和載體片段的回收。

1.3.2 連接、轉化、質粒提取和鑒定 將PCR產物酶切處理后得到的目的片段ASIC2a與pEGFP-N1載體片段進行連接：ASIC2a（XhoⅠ/EcoRⅠ）2 μl，pEGFP-N1（XhoⅠ/EcoRⅠ）1 μl，連接酶（SolutionⅠ）5 μl混勻后置于16℃連接1 h。連接產物轉化至感受態(tài)細胞TOP10，涂布于有氨芐青霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落，適量擴增后提取質粒用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗證。將酶切行為正確的克隆送至北京博邁德公司測序，測序結果與數(shù)據庫中序列進行比對。序列確認無誤后命名為pEGFP-N1-ASIC2a。

1.4 質粒pEGFP-N1-ASIC2a轉染至HEK293細胞或與pDsRed-Monomer-Mem和pDsRed2-ER共轉染至HEK293細胞

轉染前1天，將常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中的HEK293細胞按2×105個/孔接種于預先放置細胞爬片的無菌6孔板中，置于37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)。待細胞生長至90%～95%融合度時，用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗2次后換用無血清的DMEM培養(yǎng)，并按LipofectamineTM2000說明書進行轉染。具體方法如下：先將重組質粒 pEGFP-N1-ASIC2a、pDsRed-Monomer-Mem、pDsRed2-ER和脂質體LipofectamineTM2000分別溶于無血清的DMEM中，5min后將兩者混合室溫靜置20 min，然后逐滴加入質粒-脂質體混合物，搖晃均勻后，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，6 h后更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后Western blot檢測ASIC2a蛋白表達情況、用膜片鉗記錄細胞的表達電流或用熒光顯微鏡觀察細胞ASIC2a表達和分布情況。

1.5 Western blot檢測重組質粒pEGFP-N1-ASIC2a在HEK293細胞中的表達

冰上收集轉染質粒的HEK293細胞，常規(guī)提取蛋白，加熱變性后取50μg蛋白上樣至預先配置的SDS-PAGE凝膠，進行電泳。電泳后將蛋白電轉至NC，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，小鼠抗GFP單克隆抗體1∶5 000，4℃孵育過夜，然后用TBST洗膜，再用山羊抗小鼠IRDye 800CW二抗37℃避光孵育1 h。用TBST洗膜后用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描分析。

1.6 全細胞膜片鉗記錄電流

電流用放大器進行記錄，采樣軟件為pClamp 8.2（美國Axon Instruments公司），數(shù)模轉換器轉換。玻璃記錄電極使用水平拉制儀拉制。玻璃電極中灌有細胞內液：門冬酸鉀鎂110 mmol/L，氯化鈉NaCl 10mmol/L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）10mmol/L，三磷酸腺苷鎂5 mmol/L，鳥苷三磷酸0.5 mmol/L，乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）10mmol/L，氯化鈣 CaCl21mmol/L，酸堿度（pondus hydrogenii，pH）7.35；電極電阻為3～5 MΩ。將種有轉染HEK 293細胞的玻片放入記錄槽中，記錄槽中加入細胞外液：NaCl 140 mmol/L，氯化鉀 KCl 2.7 mmol/L，CaCl22.5mmol/L，氯化鎂 MgCl21mmol/L，HEPES 15mmol/L，磷酸二氫鈉1 mmol/L，pH 7.35。將細胞膜電位鉗制在-70 mV，形成高阻封接、破膜后，利用放大器gapfree模式記錄ASIC2a同聚體電流。低通濾波頻率設為2kHz，采樣頻率為10kHz。將pH值為4.0的細胞外液灌充于單管給藥玻璃電極內，其直徑為10～15 μm，通過壓力給藥儀向細胞噴射給藥。將壓力給藥儀的壓力固定在5 psi，調節(jié)噴射時間為2～5 s。阿米洛利母液（Amiloride，100mmol）溶于細胞外液中，工作液濃度為100μmol灌流給藥。所有電流記錄都在室溫下進行。

1.7 熒光顯微鏡觀察pEGFP-N1-ASIC2a和熒光蛋白的表達

將轉染后的HEK293細胞用PBS洗滌3次，自然風干后，滴加500 ml/L甘油緩沖液封片后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用Origin 8.0軟件對記錄的電流進行作圖，Prism 5軟件將電流峰值進行統(tǒng)計分析，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示。相對電流幅值百分數(shù)（relative amplitude%）=應用阿米洛利后的電流幅值/應用阿米洛利前的電流幅值×100%，使用自身配對的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCR產物的電泳結果及重組質粒pEGFP-N1-ASIC2a的酶切鑒定結果

以pcDNA3.1-ASIC2a質粒為模板擴增出的PCR產物進行電泳分析，在約1 600 bp處擴增出特異性目的基因條帶，分子量大小基本與ASIC2a理論值相符，且條帶清晰整齊。ASIC2a的PCR產物與載體pEGFP-N1連接后形成重組質粒pEGFP-N1-ASIC2a，經XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，可見2條清晰的條帶，其中1條的分子量與目的基因相符（1 600 bp），另一條與空載體分子量相符（4 700 bp），說明可能已獲得需要的重組質粒（見圖1）。將上述質粒送公司測序，結果顯示其序列完全與已發(fā)表的序列相符，提示已成功獲得重組質粒。

2.2 重組質粒pEGFP-N1-ASIC2a在HEK293細胞中的表達

裂解HEK293細胞提取蛋白后進行Western blot檢測，結果所示（見圖2），在分子量為82 kD左右處可見一清晰條帶，正好與GFP分子量（26 kD）和ASIC2a分子量（56 kD）之和相符，而未轉染重組質粒的HEK293細胞在相應分子量區(qū)域未檢測到蛋白表達，證明質粒pEGFP-N1-ASIC2a轉染HEK293細胞后成功表達。

圖1 PCR產物的電泳結果及重組質粒pEGFP-N1-ASIC2a的酶切鑒定

圖2 重組質粒pEGFP-N1-ASIC2a在HEK293細胞中的表達

2.3 pEGFP-N1-ASIC2a在HEK293細胞表達后的ASIC2a同聚體電流情況

利用全細胞膜片鉗方式記錄轉染pEGFP-N1-ASIC2a質粒的HEK293細胞電流。共記錄6個細胞，當細胞膜電位鉗制在-70 mV，胞外pH值從7.4下降至4.0時，其中4個細胞記錄到明顯的內向電流，當同時加入酸感受離子通道非特異性阻斷劑阿米洛利（100 μmol）時，內向電流峰值明顯變小，產生阻斷作用，阻斷作用為（81±4.6）%（P=0.001），提示重組質粒pEGFP-N1-ASIC2a轉染HEK293后在細胞膜上成功表達為ASIC2a通道。未轉染pEGFP-N1-ASIC2a質粒的HEK293細胞，當進行壓力噴射給藥時未記錄到內向電流（見圖3）。

圖3 100 μmol阿米洛利阻斷HEK-293細胞表達的ASIC2a同聚體電流 （n=4，±s）

2.4 pEGFP-N1-ASIC2a和熒光蛋白的表達和分布

將質粒pEGFP-N1-ASIC2a、pDsRed-Monomer-Mem（胞膜特異性marker）和pDsRed2-ER（內質網特異性marker）共轉染至HEK293細胞，置于熒光顯微鏡下觀察，可見HEK293細胞轉染質粒pEGFP-N1-ASIC2a表達后呈綠色熒光（見圖 4A、D）。轉染pDsRed2-ER（見圖4B）和pDsRed-Monomer-Mem（見圖4E）表達后呈紅色熒光。轉染質粒pEGFP-N1-ASIC2a表達的熒光蛋白與轉染pDsRed2-ER表達的熒光蛋白呈黃色，提示具有共定位（見圖4C）。轉染pEGFP-N1-ASIC2a與pDsRed-Monomer-Mem表達的熒光蛋白僅有少量的共定位（見圖4F），提示在HEK293細胞中ASIC2a蛋白僅有少量表達在膜上，大量表達在內質網內。

圖4 質粒轉染的HEK293細胞 （熒光顯微鏡×1 000）

3 討論

ASIC2a作為一種在哺乳動物外周和中樞神經系統(tǒng)廣泛分布的酸感受離子通道亞基，在體內多種病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。曾有報道稱ASIC2a可能與皮膚觸覺、痛覺和味覺的產生相關[7-8]。然而隨著對酸感受離子通道研究的深入，特別是近幾年，人們開始關注ASIC2a與腦缺血損傷的關系，對其在缺血后神經元損傷過程中發(fā)揮的作用也進行一定的探索。JOHNSON等人[4]研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后ASIC2a在海馬和皮層神經元的表達升高，這種現(xiàn)象與抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）與B細胞淋巴因子-w（B-cell lymphoma-w，Bcl-w）參與神經保護作用非常相似，提示ASIC2a通道可能在缺血損傷過程中具有一定的腦保護作用；并且一些傳統(tǒng)的腦保護方法和藥物也能在腦缺血發(fā)生時上調ASIC2a的表達水平，筆者認為其可能是通過對ASIC2a的調節(jié)而發(fā)揮神經保護作用[9-10]。但是，JIANG等人[5]最近的報道卻稱ASIC2a能通過增強ASIC1a亞基的N-連接糖基化來促進ASIC1a的表達和上膜，從而加重神經元的損傷。因此，關于ASIC2a在缺血性腦損傷病理生理過程中到底發(fā)揮怎樣的作用目前仍不清楚，需要人們進一步的探索和研究。

質粒pEGFP-N1因其自身攜帶有能表達綠色熒光蛋白的EGFP報告基因，并且其基因片段長度為717 bp，易于構建融合蛋白，常常被人們用來作為目的基因片段的載體，構建重組質粒。筆者將表達ASIC2a的基因片段與載體pEGFP-N1連接，成功構建出表達綠色熒光蛋白和ASIC2a蛋白的pEGFPN1-ASIC2a質粒，將其轉染至HEK293細胞后記錄到能被阿米洛利阻斷的ASIC2a同聚體通道電流，提示ASIC2a具有一定的細胞膜表達量。為進一步研究其亞細胞定位，筆者將其與pDsRed2-ER和pDsRed-Monomer-Mem分別共轉染至HEK293細胞，觀察ASIC2a在細胞不同部位的表達，發(fā)現(xiàn)ASIC2a在HEK293細胞中主要表達于內質網，而在細胞膜表達較少。在本實驗條件下，雖然ASIC2a蛋白細胞膜表達量較少，但仍能記錄到ASIC2a同聚體電流，說明是否能記錄到電流與蛋白細胞膜表達量多少無關。

綜上所述，本實驗中pEGFP-N1-ASIC2a質粒的成功構建為下一步研究ASIC2a的功能，特別是對其在缺血性神經元損傷中的作用及其機制的研究奠定基礎。且質粒pEGFP-N1-ASIC2a轉染至HEK293細胞后在不同細胞部位的表達情況對筆者后續(xù)研究具有一定的指導意義。

[1]XU T L,XIONG Z G.Dynamic regulation of acid-sensing ion channels by extracellular and intracellular modulators[J].Current Medicinal Chemistry,2007,14(16):1753-1763.

[2]SIMON R,XIONG Z.Acidotoxicity in brain ischaemia[J].Biochemical Society Transactions,2006,34(6):1356-1361.

[3]YANG Z J,NI X,CARTER E L,et al.Neuroprotective effect of acid-sensing ion channel inhibitor psalmotoxin-1 after hypoxia-ischemia in newborn piglet striatum[J].Neurobiology of Disease,2011,43(2):446-454.

[4]JOHNSON M B,JIN K,MINAMI M,et al.Global ischemia induces expression of acid-sensing ion channel 2a in rat brain[J].Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism,2001,21(6):734-740.

[5]JIANG N,WU J,LENG T,et al.Region specific contribution of asic2 to acidosis-and ischemia-induced neuronal injury[J].Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism,2017,37(2):528-540.

[6]戴薇薇,劉曉燕,馬曉蕓,等.大鼠酸感受離子通道亞基2a表達質粒的構建及生物學特性考察[J].沈陽藥科大學學報,2008,25(2):153-157.

[7]BOHLEN C J,CHESLER A T,SHARIF-NAEINI R,et al.A heteromeric texascoralsnake toxin targetsacid-sensing ion channels to produce pain[J].Nature,2011,479(7373):410-414.

[8]PRICE M P,LEWIN G R,MCILWRATH S L,et al.The mammalian sodium channel bnc1 is required for normal touch sensation[J].Nature,2000,407(6807):1007-1011.

[9]ZHANG Y,ZHOU L,ZHANG X,et al.Ginsenoside-Rd attenuates trpm7 and asic1a but promotes asic2a expression in rats after focal cerebral ischemia[J].Neurological Sciences,2012,33(5):1125-1131.

[10]MIAO Y,ZHANG W,LIN Y,et al.Neuroprotective effects of ischemic preconditioning on globalbrain ischemia through up-regulation of acid-sensing ion channel 2a[J].International Journal of Molecular Sciences,2010,11(1):140-153.

Construction of rat pEGFP-N1-ASIC2a eukaryotic expression vector and its functional verification*

Dong Li1,Kang Zhang2,Xiao-yun Ma2,Wei-xiu Yuan1,Xiao-yan Liu2
(1.Anesthesia and Operation Centre,Chinese PLA General Hospital,Beijing,100853,China;2.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing,100850,China)

ObjectiveTo construct the eukaryotic green fluorescent protein expression vector pEGFP-N1-ASIC2a,and to observe its expression and distribution in the HEK293 cells.MethodsASIC2a gene primers were designed and synthesised.ASIC2a gene sequence withXhoⅠ,EcoRⅠ restriction enzyme cutting site was amplified from the plasmid pcDNA3.1-ASIC2a by reversed transcription-polymerase chain reaction PCR and inserted into the eukaryotic green fluorescent protein expression vector pEGFP-N1 to form a recombinant plasmid pEGFP-N1-ASIC2a.And the plasmid pEGFP-N1-ASIC2a was transfected into HEK293 cells to observe the protein expression of current situation by cell patch clamp technique.The plasmid pEGFP-N1-ASIC2a,pDsRed-Monomer-Mem,pDsRed2-ER were transfected into the HEK293 cells,and the distribution of the protein was observed.ResultsThe correct ASIC2a gene fragment was amplified by PCR.The successful insertion of ASIC2a into the pEGFP-N1 vector was confirmed by restriction and sequence analysis.The recombinant plasmid pEGFP-N1-ASIC2a was successfully constructed in HEK293 cells.The ASIC2a homopoly－mer channel current was successfully recorded.And more pEGFP-N1-ASIC2a protein expressed in endoplasmic reticulum than in cell membrane were found.ConclusionsThe recombinant eukaryotic green fluorescent protein expression vector pEGFP-N1-ASIC2a was successfully constructed,and mainly expressed in the endoplasmic reticulum in HEK293 cells.It will be contributed to the further research on the function of ASIC2a,especially help for the studies on the effect of ASIC2a in ischemic neuronal injury and its mechanism of action.

ASIC2a;vector construction;eukaryotic expression vector;green fluorescent protein

Q782

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.002

1005-8982（2017）11-0008-06

2016-11-29

國家自然科學基金（No：31400917）

劉曉燕，E-mail：lxy3002@163.com