米亞雙++程傳波

草魚(yú)是我國(guó)重要的養(yǎng)殖淡水魚(yú)，其產(chǎn)量以及產(chǎn)值居于魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的前列。凝集素是一類(lèi)具有糖結(jié)合專(zhuān)一性，并與之非共價(jià)可逆結(jié)合的非酶、非免疫來(lái)源的蛋白質(zhì)，其中把活性依賴(lài)于Ca2+者稱(chēng)為C型凝集素。C型凝集素都具有一個(gè)或多個(gè)糖結(jié)構(gòu)識(shí)別域（Carbohydrate-recognition domain，CRD）。魚(yú)類(lèi)中所存在的天然凝集素分子在其非特異性免疫中占據(jù)重要地位，是魚(yú)類(lèi)抵御異己物質(zhì)入侵的一道防線。

材料與方法

材料。在超市購(gòu)買(mǎi)健康的草魚(yú)，體長(zhǎng)大約為30cm，體重為1.47kg。

方法。（1）草魚(yú)凝集素基因的克?。簭牟蒴~(yú)組織中提取草魚(yú)RNA，并通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆獲得草魚(yú)凝集素基因。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以草魚(yú)的cDNA為模板，根據(jù)已設(shè)計(jì)好的引物，運(yùn)用PCR技術(shù)獲得草魚(yú)凝集素基因。根據(jù)草魚(yú)凝集素的保守CRD設(shè)計(jì)引物，CILECF：ATGGAAGATATTGAAAATTACACCA，CILECR：GATATCATGTTAAGTGTGTGATAGGATCCATCTC。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s；56℃退火40s；72℃延伸40s；25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。最后，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。（2）TA克隆：將PCR產(chǎn)物與pEASY-T1Simple vector載體連接。鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。將鑒定的陽(yáng)性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。（3）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)：在GenBank中查找不同物種C型凝集素，下載其氨基酸序列。利用SMART對(duì)各物種凝集素的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了初步分析。用Clustalx軟件對(duì)所選物種的凝集素CRD的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。再結(jié)合分子生物學(xué)分析軟件MEGA4.0將比對(duì)結(jié)果以鄰接法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

結(jié)果

草魚(yú)凝集素基因克隆結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在草魚(yú)肝和腸組織中擴(kuò)增出800bp左右的片段，與預(yù)期一致。

草魚(yú)凝集素基因全長(zhǎng)序列分析。用生物信息學(xué)在線分析軟件對(duì)草魚(yú)凝集素基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析（如圖1），草魚(yú)凝集素基因的開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度為為795bp，編碼一個(gè)由264個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為29868.1，等電點(diǎn)為5.03，46～68aa為跨膜區(qū)，125～256aa為CRD。氨基酸序列上的第125、136、153、232、247、255位置上含有6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基（三角內(nèi)），并且該凝集素只有一個(gè)CRD（下劃線部分）。氨基酸序列還含有一個(gè)結(jié)合甘露糖的糖識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)即EPN基序（橢圓內(nèi)）和一個(gè)作為C型凝集素重要標(biāo)志的WIGL序列（矩形內(nèi)）。

草魚(yú)凝集素的系統(tǒng)進(jìn)化分析。用生物信息學(xué)MEGA4.0以鄰接法（NJ法）構(gòu)建草魚(yú)，斑馬魚(yú)，鯽魚(yú)，雀鱔，原雞，家鼠，牛，人等C型凝集素蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。從圖2可以看出系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分為三大支，草魚(yú)同斑馬魚(yú)，鯽魚(yú)，雀鱔，白斑狗魚(yú)，虹鱒，大西洋鮭進(jìn)化關(guān)系較近，處于一支，說(shuō)明C型凝集素在進(jìn)化過(guò)程中，草魚(yú)同硬骨魚(yú)的親緣關(guān)系較近，其中與斑馬魚(yú)的關(guān)系最近。

草魚(yú)凝集素基因的同源性分析。用DNAMAN對(duì)所選物種凝集素的CRD進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，草魚(yú)凝集素CRD與斑馬魚(yú)凝集素CRD的相似度達(dá)到90%，同鯽魚(yú)、雀鱔、大西洋鮭和虹鱒的相似度分別達(dá)到83%、63%、53%和51%。序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了在草魚(yú)的CRD中存在6個(gè)保守的半胱氨酸（用箭頭標(biāo)出）殘基和一個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)EPN基序（用棱形標(biāo)出），并且在這幾種硬骨魚(yú)凝集素的CRD中均存在WIGL序列。由此可以看出，草魚(yú)凝集素的CRD與斑馬魚(yú)的同源性最高。

討論

本研究用Trizol法從草魚(yú)組織中提取RNA，通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆獲得草魚(yú)凝集素基因的開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度為795bp，編碼了一個(gè)由264個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，用SMART對(duì)該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)草魚(yú)凝集素蛋白是由一個(gè)跨膜區(qū)（46～68aa）和一個(gè)CRD（125～256aa）組成，且CRD位于該蛋白的C端，含有六個(gè)保守的半胱氨酸殘基，由此可以判定草魚(yú)凝集素的CRD屬于標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)型CRD。從其序列分析來(lái)看，在草魚(yú)凝集素的CRD上存在一個(gè)WIGL基序和甘露糖結(jié)合位點(diǎn)即EPN基序，因此可以確定該凝集素是一種C型凝集素。同源性分析表明，草魚(yú)與斑馬魚(yú)的相似度最高，達(dá)到90%。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明草魚(yú)凝集素與斑馬魚(yú)的親緣關(guān)系最近?？衫靡勋@得的草魚(yú)凝集素基因作為重組表達(dá)的基礎(chǔ)，用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)純化，研究其蛋白質(zhì)的組成及功能，研發(fā)出新型的病害治療藥物，應(yīng)用于草魚(yú)的免疫和病害防御上，實(shí)現(xiàn)健康、可持續(xù)的養(yǎng)殖。

作者簡(jiǎn)介：

米亞雙（1991-），女，河南南陽(yáng)人，河南師范大學(xué)在讀研究生。