曾 榮 何艷艷 惠 云 李志量 徐浩翔 李 岷

·論著·

表皮松解性掌跖角皮癥一家系KRT9基因新突變

曾 榮1何艷艷1惠 云2李志量1徐浩翔1李 岷1

目的：檢測表皮松解性掌跖角皮癥一家系患者角蛋白9(KRT9)基因突變。方法：收集家系成員的臨床資料和血樣，提取家系中4例患者和3名正常人及50名與本家系無關(guān)的正常對照外周血DNA,采用PCR技術(shù)擴增KRT9基因所有編碼區(qū)并進(jìn)行測序，分別檢測家系中的突變情況。結(jié)果：該家系中所有患者均存在KRT9基因錯義突變(c.484T>C)，導(dǎo)致第162位密碼子由TCT(絲氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)镃CT(脯氨酸)(p.S162P)，家系中3名正常個體和50名健康對照均未發(fā)現(xiàn)上述突變。結(jié)論：KRT9基因c.484T>C錯義突變是導(dǎo)致該家系發(fā)生表皮松解性掌跖角皮癥的遺傳基礎(chǔ)。

表皮松解性掌跖角皮癥； KRT9基因； 基因突變

表皮松解性掌跖角皮癥(epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK)是一種相對常見的常染色體顯性遺傳性皮膚病[1]，不同人種均可出現(xiàn)本病，在北愛爾蘭人群中其患病率是4.4/100 000[2]。EPPK主要臨床特征為發(fā)病初期掌跖部位皮膚發(fā)紅，然后發(fā)生肥厚的黃色角化過度，逐漸擴展累及手足側(cè)面，皮損表面可以平滑呈蠟狀，也可呈不規(guī)則狀或疣狀，皮膚病理可見表皮松解性角化過度。

1901年，Vorner首次報道了該病是一種常染色體顯性遺傳性疾病，1992年Reis等[3]通過遺傳連鎖分析后將EPPK的候選基因定位于染色體17q12-q21。1993年，Langbein等[4]首先報道角蛋白9突變是本病的致病基因。目前為止，不同研究者已在多個家系或散發(fā)病例中發(fā)現(xiàn)了包括錯義突變、缺失突變等近30種不同的KRT9突變。本研究通過對1個中國漢族EPPK家系的KRT9基因進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)了1個新的錯義突變。

1 對象與方法

1.1 對象 對家系中4代人進(jìn)行調(diào)查，共有患者5例，其中男4例，女1例(圖1)，均在出生后4周左右無明顯誘因開始發(fā)病。先證者(IV4)為男性，3歲，出生后1個月開始雙手手指及雙足出現(xiàn)紅斑，繼而皮膚逐漸粗糙、增厚，隨著年齡增長皮損泛發(fā)至整個手掌、足跖，表現(xiàn)為境界清楚的彌漫性角化過度性斑塊，皮損表面呈疣狀增生(圖2)?；純簽樽阍马槷a(chǎn)，父母否認(rèn)近親結(jié)婚，家系中其他患者可見類似皮損。

圖1 家系圖

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 獲得知情同意后，分別采集家系成員靜脈血各3 mL，其中患者4例和非患者3人；同時提取50名與本家系無關(guān)的正常人DNA作為對照。采用美國Promega公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計 選擇在EPPK致病基因KRT9突變熱點外顯子1區(qū)域設(shè)計引物，引物序列為：上游引物：5'-TTGGCTACAGCTACGGCGGAGGAT-3'，下游引物：5'-TGGTCCTTGAGATCATCAATAGTG-3'。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增 94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性1 min，56℃～62℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)。72℃延伸2 min，最后延伸5 min。擴增結(jié)束后用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后直接在ABI 377型全自動測序儀(美國Applied Biosystem公司)上測序，所有測序結(jié)果與NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析比對。

圖2 患者掌跖部位皮損。雙手足掌跖部位彌漫性對稱性皮膚增厚，表面輕度脫屑，部分區(qū)域皮損表面呈蠟狀平滑。a，b為先證者；c為先證者父親(III7)

2 結(jié)果

以家系中4例患者和3名非患者的基因組DNA為模板，利用設(shè)計的引物擴增出的產(chǎn)物，產(chǎn)物純化后測序，將患者全部外顯子直接測序結(jié)果與上述數(shù)據(jù)庫中所公布的序列進(jìn)行比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該家系中所有患者KRT9基因第一個外顯子第484位胸腺嘧啶突變?yōu)榘奏?c.484T>C)，導(dǎo)致密碼子出現(xiàn)TCT(絲氨酸)→CCT(脯氨酸)的改變，使得第162位氨基酸從絲氨酸(S)突變?yōu)楦彼?P)(p.S162P)(圖3)，家系中非患者以及50名無親緣關(guān)系的正常人對照未見該改變。

3 討論

掌跖角皮癥是以手掌/足跖部位出現(xiàn)角化過度性斑塊為特征的一組疾病，其中表皮松解性掌跖角皮癥(EPPK)最常見，主要特征包括：(1)掌跖部位彌漫性角化性斑塊，境界清楚，有紅色邊緣，表面光滑呈黃色，伴有皸裂、脫屑等；(2)多在出生后數(shù)月發(fā)病，持續(xù)終生；(3)組織病理示表皮角化過度、顆粒層增厚、棘層和顆粒層有較多裂隙，裂隙處細(xì)胞界限不清，有淡染的物質(zhì)或透明角質(zhì)顆粒組織，可見表皮松解；(4)有家族史，呈常染色體顯性遺傳。我們所采集的這個家系，盡管沒有皮損的病理學(xué)證據(jù)，但是，結(jié)合先證者和該家系中其他患者的表現(xiàn)以及疾病遺傳方式，可診斷EPPK，目前體內(nèi)外實驗均已證實，該病的發(fā)生與KRT9基因突變相關(guān)。

a：先證者；b：正常對照。箭頭所指處為突變點圖3 KRT9基因測序圖

人類KRT9基因相對分子量約為62 kDa，全長4492 kb，含8個外顯子和7個內(nèi)含子，其cDNA全長2353 bp，其基因結(jié)構(gòu)包括一個氨基酸末端的頭功能區(qū)域、一個羧基尾功能區(qū)域和中間由高度保守序列構(gòu)成的棒狀結(jié)構(gòu)，其中棒狀結(jié)構(gòu)功能域由4個α-螺旋序列片段(1A、2A、1B、2B)和3個非螺旋連接片段(L1、L12、L3)組成[5]。我們對上述家系研究發(fā)現(xiàn)，KRT9基因的第一個外顯子第484位胸腺嘧啶突變?yōu)榘奏?c.484T>C)，檢索近年的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，未見該位點出現(xiàn)相同突變的報道，而已發(fā)現(xiàn)的該病突變形式包括錯義突變、插入突變、缺失突變等，這些突變大多存在于1A桿狀區(qū)域頭端和2B桿狀尾端，這兩個區(qū)域是目前發(fā)現(xiàn)的與EPPK相關(guān)的角蛋白熱點突變區(qū)[6-8]，并有學(xué)者提出，這兩個區(qū)域作為桿狀結(jié)構(gòu)的起始端和終末端可能直接參與角蛋白的組裝相關(guān)，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生，我們所報道的突變位點出現(xiàn)在熱點突變區(qū)的1A桿狀區(qū)域頭端，引起氨基酸出現(xiàn)改變，可能影響了角蛋白的組裝或功能，從而引發(fā)疾病。

迄今為止，關(guān)于EPPK家系中KRT9突變研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近30種，我們首次發(fā)現(xiàn)了該基因的1號外顯子第484位胸腺嘧啶(T)突變?yōu)閴A基胞嘧啶(C)的突變(c.484T>C)，該突變將導(dǎo)致第162位密碼子由絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?p.S162P)。脯氨酸(Pro)是非極性、疏水性氨基酸，而絲氨酸(Ser)是極性、中性氨基酸。這種氨基酸的變化將通過改變蛋白質(zhì)構(gòu)象影響其功能。我們的報道不是熱點突變。目前p.R163W突變在多個家系中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是熱點突變[9-11]。我們的研究結(jié)果豐富了突變譜，這將有助于揭示角蛋白9的異常參與EPPK的發(fā)病機制，并可為患者的優(yōu)生咨詢提供依據(jù)。

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(收稿：2017-02-26 修回：2017-04-13)

Identification of a novel mutation of KRT9 gene in a family with epidermolytic palmoplantar keratoderma

ZENGRong1,HEYanyan1,HUIYun2,LIZhiliang1,XUHaoxiang1,LIMin1.

1.InstituteofDermatology，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,JiangsuKeyLaboratoryofMolecularBiologyforSkinDiseases&STDs,Nanjing210042,China; 2.DepartmentofDermatology,JinlingHospital,NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210002,China

s:XUHaoxiang,E-mail:xbpipi@163.comLIMin,E-mail:drlimin@sina.cn

Objective: To detect the mutation of keratin 9 gene (KRT9) in a family with epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK). Methods: Clinical data and blood samples of patients in the family were collected. Genomic DNA was extracted from the peripheral blood of the family members (including 4 patients and 3 unaffected members) and 50 healthy controls. All the exons of KRT9 gene and their flanking intronic sequences were amplified by PCR and direct sequencing was performed to screen the mutations in gene. Results: A missense mutation of c.484T>C was found in the patients, but absent in other 3 healthy members of the family and 50 unrelated healthy controls. Conclusion: The missense mutation of KRT9 gene (c.484T>C; p.S162P) is possible the molecular basis of pathogenesis of EPPK in this family.

Epidermolytic palmoplantar keratoderma; KRT9 gene; gene mutation

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院重大疾病創(chuàng)新研究(編號：2016ZX320014) 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院青年教師培養(yǎng)基金(編號：2015zlgc0749) 江蘇省自然科學(xué)基金(編號：BK20150068) 國家自然科學(xué)基金(編號：81472905，81502739)

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，江蘇省皮膚性病學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室,江蘇南京，210042 2南京軍區(qū)總醫(yī)院皮膚科，江蘇南京，210002

徐浩翔, E-mail: xbpipi@163.com 李 岷, E-mail: drlimin@sina.cn