許旭，李全福，張立廣

（河北省保定市第二醫(yī)院 肝膽外科，河北 保定 071051）

內(nèi)鏡保膽膽囊組織結(jié)石復(fù)發(fā)易感基因調(diào)控研究

許旭，李全福，張立廣

（河北省保定市第二醫(yī)院 肝膽外科，河北 保定 071051）

目的 采用高通量測序技術(shù)通過對膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)患者膽囊黏膜中基因表達(dá)譜的檢測及生物信息學(xué)的分析，初步了解基因在膽囊結(jié)石發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。方法用Illumina HiSeq 2500新一代高通量測序技術(shù)對7例膽囊結(jié)石及2例膽囊息肉復(fù)發(fā)患者進(jìn)行mRNA表達(dá)譜差異篩選分析，并對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行Gene Ontology（GO）和京都基因與基因組（KEGG）顯著性富集統(tǒng)計(jì)。結(jié)果高通量測序結(jié)果顯示，差異表達(dá)的mRNA差異基因共有150條。通過GO功能顯著性富集分析，發(fā)現(xiàn)分子功能的GO功能顯著富集是抗原結(jié)合；而對于生物過程，富集的GO功能是免疫應(yīng)答；對于細(xì)胞成分，富集的GO功能是細(xì)胞外區(qū)域。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)最顯著的途徑是細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體作用途徑（P =0.000）。結(jié)論目前的研究表明，研究膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)易感基因，可以為預(yù)防內(nèi)鏡保膽術(shù)后膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)的科學(xué)研究工作及臨床治療提供一個重要的參考。

易感基因；高通量測序；結(jié)石復(fù)發(fā)；差異表達(dá)基因

膽囊疾病通常表現(xiàn)為膽結(jié)石、膽囊息肉和膽囊癌。膽石通常發(fā)生率為世界人口的10%～20%，其隨著年齡增加并且在女性中高于男性。膽結(jié)石一般是認(rèn)為由于膽汁內(nèi)的化學(xué)成分平衡失調(diào)所造成的。當(dāng)患者膽汁中的膽固醇含量超出極限時，其化學(xué)成分析出，形成膽固醇結(jié)晶，最終形成膽結(jié)石[1]。除了上述因素外，膽汁中膽固醇過度分泌的分子遺傳因素在膽囊結(jié)石形成中起到重要作用，例如LITH基因家族，能在基因水平引起膽囊內(nèi)膽汁中膽固醇的病理性過飽和，最終導(dǎo)致膽囊結(jié)石的形成[2]。本研究采用Illumina HiSeq 2500新一代高通量測序技術(shù)對膽囊結(jié)石患者進(jìn)行基因表達(dá)譜差異篩選分析，并對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行Gene Ontology（GO）和京都基因與基因組（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）顯著性富集統(tǒng)計(jì)，通過基因功能的研究，探索膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)的分子基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集保定市第二醫(yī)院2009年1月-2014年1月收治的內(nèi)鏡微創(chuàng)保膽治療膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)患者7例，膽囊息肉復(fù)發(fā)患者2例，收集患者膽囊底部膽囊壁組織。其中，男2例，女7例，年齡36～64歲，中位年齡54歲。所有患者均無病毒性肝炎、糖尿病及代謝性疾病，臨床均未使用過抗生素。膽囊壁組織迅速放入裝有RNA樣本保存液的凍存管內(nèi)，凍存管置于-80℃液氮罐中，待樣本全部收集完畢后，放置于干冰保存箱內(nèi)。提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。測序文庫的構(gòu)建和序列測定使用Illumina公司的HiSeq 2500高通量測序平臺完成。

1.2 差異表達(dá)基因的檢測

收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后，Trizol法提取組織RNA。按照標(biāo)準(zhǔn)Illumina說明書構(gòu)建cDNA文庫，進(jìn)行上機(jī)測序。測序后得到的原始讀?。≧aw reads）進(jìn)行差異表達(dá)基因的檢測：將下載的Ensembl GTF文件和通過TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度，檢測差異表達(dá)。在Cuffidff輸出中只有q ＜0.01，測試顯示成功的比較才被認(rèn)為是差異表達(dá)。

1.3 差異表達(dá)基因的功能富集分析

DAVID v6.7是一套基于網(wǎng)絡(luò)的功能注釋工具。分別將差異表達(dá)基因和所有表達(dá)基因（所有樣品的列表和背景）提交到網(wǎng)路界面，將錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）設(shè)定為 ＜5%（即P ＜0.05），只有GO FAT（Gene Ontology）和KEGG通路被選擇作為此次分析的功能注釋目錄。

1.4 差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

本研究采用的PPI數(shù)據(jù)來源于BioGRID數(shù)據(jù)庫，這個數(shù)據(jù)庫包含的PPIs從文獻(xiàn)中手動搜索獲得，且經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)質(zhì)量足夠用于構(gòu)建PPI預(yù)測模型。基于BioGRID數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，利用Cytoscape軟件中對表達(dá)差異顯著的7個上調(diào)基因以及前20個下調(diào)基因進(jìn)行搜索，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)由節(jié)點(diǎn)（Node）和連線（Edge）構(gòu)成，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，線代表它們之間的相互作用。

2 結(jié)果

2.1 高通量測序結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

成功構(gòu)建了膽囊結(jié)石患者和膽囊息肉患者黏膜組織兩個cDNA文庫。經(jīng)過Illumina Hiseq 2500高通量測序及數(shù)據(jù)分析處理，從膽囊結(jié)石和膽囊息肉這兩組樣品中分別得到4.46×107，3.41×107個讀段對。利用TopHat將讀段匹配到UCSC參考人基因組（hg19），唯一匹配的讀段對應(yīng)范圍在4.17×107～3.21×107之間，匹配到Ensembl參考基因的讀段比例為93%～94%。檢測到膽囊結(jié)石與息肉之間有150個差異表達(dá)基因。值得注意的是在膽囊結(jié)石組織中有143個上調(diào)，而在膽囊息肉組織中只有7個基因上調(diào)。見表1。

2.2 基因本體論對于失調(diào)基因的富集分析

為了更好地理解差異表達(dá)基因的功能，進(jìn)行了基因本體論對于失調(diào)基因的富集分析。GO類別分為3組：生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。為了識別豐富的功能類別，首先使用DAVID的在線工具對顯著差異調(diào)節(jié)的基因進(jìn)行富集測試。選擇了顯著富集來自膽結(jié)石和膽囊息肉的失調(diào)基因的GO類別。膽結(jié)石和膽囊息肉之間的差異表達(dá)基因分為20個功能類別。見表2。本研究發(fā)現(xiàn)分子功能的GO功能顯著富集是抗原結(jié)合（GO：0003823，P =0.000），而對于生物過程，富集的GO功能是免疫應(yīng)答（GO：0006955，P =0.000），對于細(xì)胞成分，富集的GO功能是細(xì)胞外區(qū)域（GO：0005576，P =0.000）。為進(jìn)一步評價(jià)差異表達(dá)基因的生物學(xué)意義，還進(jìn)行了KEGG通路富集分析。在KEGG分析中最重要的途徑是細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（P =0.000）。此外，發(fā)現(xiàn)趨化因子信號通路（P =0.008）和NOD樣受體信號通路（P =0.010）是高度富集的。

2.3 差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建只獲得了2個上調(diào)基因和7個下調(diào)基因的PPI數(shù)據(jù)，共得到了差異表達(dá)基因相關(guān)的140條連線和121個節(jié)點(diǎn)，其中S100A9、RN7SK和CR2是連結(jié)度最高的3個節(jié)點(diǎn)。S100A9通過95條連線與87個節(jié)點(diǎn)相連接，為下調(diào)基因之間互相連接的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。差異表達(dá)基因中的免疫球蛋白通過其他節(jié)點(diǎn)與S100A9相連構(gòu)成了較長的通路，例如IGHA2/IGKV3-20-HMG20-S100A-RP11-297A16.3-IGKV4-1。而上調(diào)的RN7SK和CR2之間以及與下調(diào)基因之間沒有已驗(yàn)證的蛋白質(zhì)相互作用。見附圖。

表1 在膽囊結(jié)石中上調(diào)的前15個基因列和下調(diào)的前4個基因列Table 1 Top significantly up-regulated 15 genes and down-regulated 4 genes about cholecystolithiasis

表2 差異表達(dá)基因GO功能分析Table 2 Significantly enriched GO terms of differentially expressed genes

附圖 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Attached fig. The constructed protein-protein interaction networks of differentially expressed genes

3 討論

膽囊結(jié)石和膽囊息肉是最常見的膽囊疾病類型，兩者都是膽囊癌的危險(xiǎn)因素。然而，膽結(jié)石和膽囊息肉的潛在發(fā)病機(jī)制在很大程度上仍然未知，這對于藥物開發(fā)和這些疾病的治療具有重要的意義。RNA-Seq是一種強(qiáng)大的工具，用于在全基因組規(guī)模上鑒定數(shù)千個基因轉(zhuǎn)錄的差異。本研究擬發(fā)現(xiàn)一些膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)候選基因，并且提供這些基因在膽囊結(jié)石的發(fā)展中的作用。

本研究檢測到膽囊結(jié)石與息肉之間有150個差異表達(dá)基因（143例膽囊結(jié)石上調(diào)，僅有7例膽囊息肉上調(diào)）。研究顯示，在生物學(xué)功能上，差異性表達(dá)的基因多富集于與脂蛋白結(jié)合相關(guān)的生物學(xué)功能上，其大致與平滑肌收縮和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體相關(guān)，估計(jì)他們參與膽囊的收縮運(yùn)動和膽汁濃縮[3]。通過比較膽囊結(jié)石患者和正常人的膽囊上皮組織，對表達(dá)差異顯著地前200個基因整理分類后發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)翻譯和合成類，離子通道及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類W及發(fā)育相關(guān)類占據(jù)前列[4]。LAMMERT等[5]于2001年首先提出了45條膽石病候選基因，它們主要是脂類代謝相關(guān)蛋白及膽囊相關(guān)蛋白。本研究的高通量測序膽囊結(jié)石易感基因基本上能涵蓋這45條候選基因，間接上證明測序結(jié)果的可靠性。

為了更好地理解差異表達(dá)基因的功能，本研究進(jìn)行了基因本體論對于失調(diào)基因的富集分析。細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體信號通路中包括15個差異表達(dá)基因，其中5個基因?qū)儆贑XC超家族，5個基因?qū)儆贑C超家族，CXC超家族和CC超家族都屬于趨化因子，而IL-6、OSM為促紅細(xì)胞生成素，TNFSF9為TNF超家族，IL-1B為TGF-β超家族。這些基因在膽囊息肉中表達(dá)下調(diào)，在膽囊結(jié)石中表達(dá)上調(diào)。趨化因子信號通路中包括11個差異表達(dá)基因，其中CXCL1、CCL3、CCL2、IL-8、CCL20、CXCL3、CXCL2、CCL8、CCL4L1均為趨化因子，CXCR1，CXCR2為趨化因子受體，這些基因在膽囊息肉中表達(dá)下調(diào)，在膽囊結(jié)石中表達(dá)上調(diào)。6個基因參與NOD樣受體信號通路，其中IL-8、CXCL1、CXCL2、CCL2為趨化因子，IL-6及IL-1B為炎癥細(xì)胞因子，這些因子可能通過參與T-cell分化、抗原特異的T細(xì)胞及B細(xì)胞免疫應(yīng)答調(diào)控膽囊疾病的發(fā)生，這些基因在膽囊息肉中表達(dá)下調(diào)，在膽囊結(jié)石中表達(dá)上調(diào)。

PPI研究可以揭示蛋白質(zhì)在分子水平的功能，并揭示細(xì)胞活動的規(guī)則，包括生長、發(fā)育、代謝、分化和凋亡[6]。全基因組規(guī)模的PPI的識別解釋細(xì)胞控制機(jī)制是非常重要的[7]。本研究只獲得了2個上調(diào)基因和7個下調(diào)基因的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，其中S100A9、RN7SK和CR2是連結(jié)度最高的3個節(jié)點(diǎn)。在膽囊結(jié)石中上調(diào)的基因中大部分為免疫球蛋白，說明這些免疫球蛋白可能通過參與免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)等參與膽囊結(jié)石的發(fā)病。而且值得關(guān)注的是已有研究證明S100A9在結(jié)石性膽囊炎中表達(dá)升高，并隨著炎癥反應(yīng)的加劇而升高[8]。研究顯示，S100A9和其他S100蛋白（包括S100A8和S100A12）與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)嚴(yán)格相關(guān)，其在急性和慢性炎性疾病和腫瘤中觀察到，更重要的是，顯示S100A8和S100A9蛋白在急性膽囊炎中比在慢性疾病中具有更高的量[9-10]，這表明這些基因通過參與炎癥在膽囊結(jié)石形成中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，通過RNA-Seq比較膽囊結(jié)石和膽囊息肉之間的基因表達(dá)譜，鑒定出150個差異表達(dá)基因，研究基因在免疫應(yīng)答和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用的功能，可以幫助了解膽囊結(jié)石的形成機(jī)制。下一步將擴(kuò)大樣本例數(shù)，進(jìn)一步深入研究，有望明確關(guān)鍵基因的定位、功能和調(diào)節(jié)，將有助于實(shí)現(xiàn)膽囊結(jié)石和膽囊息肉的預(yù)防和治療。

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（吳靜 編輯）

Integrating of the gene expression profiles in gallbladder stone and identify regulatory networks

Xu Xu, Quan-fu Li, Li-guang Zhang
(Department of Hepatobiliary Surgery, the Second Hospital, Baoding, Hebei 071051, China)

Objective The gene expression profile of gallbladder stone and gallbladder polyp were analyzed by high-throughput sequencing technology to explore the roles of the gene in the development of gallstone and their molecular mechanism in the occurrence and development of gallbladder stone.Methods7 patients with gallstones and 2 patients with gallbladder polyp was enrolled for RNA-Seq.Results150 DEGs was identified between gallstones and gallbladder polyps. We found GO terms for molecular functions significantly enriched in antigen binding, while for biological processes, the enriched GO terms were immune response, and for cellular component,the enriched GO terms were extracellular region. The most significant pathway in our KEGG analysis was Cytokinecytokine receptor interaction (P = 0.000).ConclusionThis present study suggests some promising genes may provide a clue to the role of these genes played in the development of gallstones and gallbladder polyps.

susceptibility gene; high-throughput sequencing; stone recurrence; differentially expressed genes

Q786

A

10.3969/j.issn.1007-1989.2017.07.015

1007-1989（2017）07-0071-05

2016-12-12

李全福，E-mail：xuxu8041230@163.com；Tel：15603211539