王江峰，石 梁，夏建新

（紅安縣人民醫(yī)院，湖北 黃岡 438400）

不同結(jié)核桿菌檢測方法的臨床應(yīng)用價(jià)值

王江峰，石 梁，夏建新

（紅安縣人民醫(yī)院，湖北 黃岡 438400）

目的探討羅氏培養(yǎng)、熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）、痰涂片試驗(yàn)、增菌聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）四種檢測方法對結(jié)核桿菌檢測的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法選取我院2015年6月～2016年6月收治的結(jié)核病患者60例分為觀察組，將同期收治的非結(jié)核病患者40例作為對照組。采集所有患者的痰液標(biāo)本先后進(jìn)行羅氏培養(yǎng)、PCR技術(shù)、痰涂片試驗(yàn)、增菌PCR技術(shù)檢測，記錄檢測結(jié)果，比較不同檢測方法的檢測價(jià)值。結(jié)果觀察組患者檢測結(jié)果顯示，羅氏培養(yǎng)檢出痰液標(biāo)本陽性14例，陽性率為23.33%；PCR技術(shù)檢出痰液標(biāo)本陽性33例，陽性率為55.00%；痰涂片試驗(yàn)檢出痰液標(biāo)本陽性19例，陽性率為31.67%；增菌PCR技術(shù)檢出痰液標(biāo)本陽性40例，陽性率為66.67%。對照組患者檢測結(jié)果顯示，四種檢測方法對痰液標(biāo)本陽性檢出率均為0。增菌PCR技術(shù)對痰液標(biāo)本陽性檢出率＞PCR技術(shù)＞羅氏培養(yǎng)＞痰涂片試驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論臨床檢測結(jié)核桿菌的方法眾多，增菌PCR技術(shù)、PCR技術(shù)對結(jié)核桿菌的特異性強(qiáng)，敏感度高，操作簡單，檢測時(shí)間短，適合作為對結(jié)核桿菌檢測的實(shí)驗(yàn)室首選檢測方法。

羅氏培養(yǎng)；PCR技術(shù)；痰涂片試驗(yàn)；增菌PCR技術(shù)；結(jié)核桿菌檢測

結(jié)核病是一種因感染結(jié)核桿菌（TB）引起的慢性疾病，具有強(qiáng)傳染性。會侵犯主要臟器，引起肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎、腎結(jié)核等多種疾病，不同發(fā)病階段的癥狀有所差異，增加了診斷難度[1]。我國是肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家，結(jié)合病患者人數(shù)已經(jīng)超過千萬，且25%的結(jié)核病患者具有傳染性。不僅增加了患者的痛苦，給患者及其家庭帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)壓力，還威脅他人安全，成為社會公共衛(wèi)生問題。盡早明確診斷，及時(shí)規(guī)范治療多數(shù)患者可以治愈。實(shí)驗(yàn)室結(jié)核桿菌檢測方法眾多，尋找檢測特異性強(qiáng)，操作簡單、快捷的檢測方法是臨床關(guān)注的重點(diǎn)[2]。本文就增菌PCR技術(shù)、羅氏培養(yǎng)、PCR技術(shù)、痰涂片試驗(yàn)對TB檢測情況進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2015年6月～2016年6月收治的60例結(jié)核病患者（觀察組）及同期收治的40例非結(jié)核病患者（對照組）。觀察組中男38例，女22例，年齡38～72歲，平均（54.6±4.1）歲。所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會關(guān)于結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者均簽署《知情同意書》。對照組中男25例，女15例，年齡36～71歲，平均（54.3±4.0）歲，疾病類型：支氣管肺炎20例，間質(zhì)性肺炎9例，細(xì)菌性肺炎5例，肺癌4例，肺膿瘍2例。

1.2 方法

1.2.1 檢測材料

在患者入院后次日清晨，分別采集兩組患者的痰液標(biāo)本進(jìn)行TB檢測。培養(yǎng)基為本院自制的酸性改良羅氏培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基為美國Becton Dickinson公司提供的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基+10% OADC營養(yǎng)添加劑。不同結(jié)合桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由上海肺科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供，結(jié)合桿菌試劑盒由博奧生物有限公司負(fù)責(zé)提供。PCR擴(kuò)增試劑盒由上海生工生物工程股份有限公司提供，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。

1.2.2 檢測方法

痰涂片、羅氏培養(yǎng)：用4%氫氧化鈉將痰液標(biāo)本進(jìn)行液化后加入PBS，在離心機(jī)中以3000 r/min的速離心5 min，去除上清液。PBS重懸后再次離心5 min，洗滌兩次后沉淀。用PBS重懸、混勻后吸出0.1 mL，依次進(jìn)行增菌PCR、羅氏培養(yǎng)、PCR、痰涂片試驗(yàn)。

PCR：將0.1 mL處理后的待檢標(biāo)本進(jìn)行裂解液（蛋白酶K+Chelex）提取DNA，取一直單管PCR反應(yīng)管，依次加入樣品、陰性質(zhì)控品、2 μL陽性質(zhì)控品。在離心機(jī)中以8000 r/min的速離心10 s后放入PCR儀。PCR擴(kuò)增溫度為94°C，變性5 min，94°C時(shí)變性1 min，68°C時(shí)變性1 min，72°C時(shí)變性1 min，循環(huán)35次。再72°C延伸5 min，通過PCR-ELISA鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物加入包被有結(jié)核桿菌包被的生物素標(biāo)記探針的ELISA波板上，0.1 mL/孔。在37°C溫度中孵育1小時(shí)后洗板5次，加入有鏈霉親和素標(biāo)記的過氧化物酶。在37°C條件下作用15 min，洗板5次后完全去除上清液。再加入TMB顯色液0.1 mL，在37°C條件下反應(yīng)10 min后加入終止液0.1 mL，通過酶標(biāo)儀判定反應(yīng)物在450 nm時(shí)的吸光值，記錄檢測結(jié)果。

增菌PCR試驗(yàn)：將0.1 mL處理后的待檢標(biāo)本接種于1 mL血平板培養(yǎng)基，溫度為37°C，PH值維持在6.5～7.0，培養(yǎng)4～7天后判定PCR檢測結(jié)果

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同檢測方法的檢測結(jié)果

羅氏培養(yǎng)、痰涂片試驗(yàn)、PCR技術(shù)、增菌PCR檢測除觀察組痰液標(biāo)本陽性率分別為23.33%、31.67%、55.00%、66.67%；四種檢測方法對對照組痰液標(biāo)本陽性率均為0；增菌PCR技術(shù)對痰液標(biāo)本陽性檢出率＞PCR技術(shù)＞羅氏培養(yǎng)＞痰涂片試驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同檢測方法的檢測結(jié)果（n，%）

2.2 細(xì)菌學(xué)檢查與PCR、增菌PCR檢測結(jié)果對比

觀察組60例患者細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果顯示涂陽培陽21例，涂陽培陰9例，涂陰培陽26例，涂陰培陰32例；7天增菌PCR檢測陽性率與細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；7天增菌PCR檢測陽性率明顯優(yōu)于PCR，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 細(xì)菌學(xué)檢查與PCR、增菌PCR檢測結(jié)果比較 [n（%）]

2.3 PCR的特異性、敏感性

將HE7RV結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株調(diào)制1 mg/mL后進(jìn)行稀釋，分別進(jìn)行PCR、增菌PCR（4d、7d）。陰性：檢測含有TB的DNA；陽性：樣品中含有TB基因或表達(dá)產(chǎn)物。利用增菌PCR對牛分支桿菌、結(jié)核分枝桿菌等多種病原菌培養(yǎng)物檢測結(jié)果顯示，12中非TB檢測結(jié)果均為陰性，牛分支桿菌、結(jié)核分枝桿菌為陽性，說明PCR對結(jié)合TB的特異性、敏感性強(qiáng)。

3 討 論

我國結(jié)核病患者人數(shù)眾多，其具有傳染性的特點(diǎn)給患者及社會帶來了巨大的挑戰(zhàn)。TB是結(jié)核病患者的主要致病因，盡早明確患者是否存在TB對疾病的診治十分重要[3]。主要通過細(xì)菌學(xué)檢查明確患者是否存在TB感染、傳染源，細(xì)菌學(xué)檢查是臨床診斷結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對結(jié)核疾病的診斷及治療方案的選擇具有重要作用[4]。實(shí)驗(yàn)室檢測TB的方法較多，不同檢測方法各具特色，尋找特異性強(qiáng)、敏感性強(qiáng)、操作簡單、準(zhǔn)確檢出率高的檢測方法是臨床檢驗(yàn)科醫(yī)師關(guān)注的重點(diǎn)。

痰涂片是細(xì)菌學(xué)檢查的基本方法，操作簡單，價(jià)格低廉，當(dāng)天即可獲得檢測結(jié)果[5]。明確痰細(xì)菌類型，對痰液中的細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，通過觀察生長情況了解細(xì)菌種類。同時(shí)能進(jìn)行藥敏分析，對合理用藥提供指導(dǎo)意見。但是，痰涂片不能分辨活菌、死菌，且細(xì)菌數(shù)量達(dá)到5000～1000條/mL時(shí)才能顯示陽性，當(dāng)細(xì)菌數(shù)量未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)時(shí)就會有假陽性結(jié)果，特異性差[6]。且多種抗酸桿菌進(jìn)行痰涂片時(shí)都會著色，難以辨別TB，需要通過進(jìn)一步試驗(yàn)才能確診，存在明顯的缺陷。細(xì)菌學(xué)檢測對TB敏感性強(qiáng)，但是需要1～2月才能得出檢測結(jié)果，不適用于急診檢測患者。TB、非TB菌株在細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)時(shí)均會生長，需要通過菌種鑒定才能明確是否存在TB，在臨床實(shí)際運(yùn)用中存在明顯的不足。隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，PCR技術(shù)在臨床的應(yīng)用得到了廣大醫(yī)務(wù)人員的肯定[7]。PCR具備分子生物診斷技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)，是生物學(xué)領(lǐng)域的先進(jìn)檢測方法，在結(jié)核病的診斷中發(fā)揮著明顯的優(yōu)勢。具有檢測速度快，靈敏度高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，TB桿菌生長速度慢，通過PCR可以迅速得出診斷結(jié)果，為患者的診治提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)。

PCR有常規(guī)PCR、增菌PCR兩種檢測方式，本文將PCR兩種檢測方法與痰涂片、羅氏培養(yǎng)對人體TB檢測情況進(jìn)行對比觀察發(fā)現(xiàn)，增菌PCR對觀察組痰標(biāo)本陽性檢出率為66.67%，PCR對觀察組痰標(biāo)本陽性檢出率為55.00%，明顯優(yōu)于痰涂片（31.67%）、羅氏培養(yǎng)（23.33%），由表1可知PCR對TB檢出率明顯優(yōu)于羅氏培養(yǎng)、痰涂片，尤其是增菌PCR對TB的陽性檢出率明顯高于其他方法，而無結(jié)核桿菌感染的對照組均未檢出陽性標(biāo)本，無假陽性結(jié)果，說明PCR對TB檢出率高，特異性強(qiáng)[8]。將PCR、增菌PCR檢測結(jié)果與細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行對比觀察發(fā)現(xiàn)，PCR兩種檢測方法對涂陽培陽、涂陽培陰、涂陰培陽檢出率幾乎達(dá)到100%，但是PCR對涂陰培陰痰液標(biāo)本陽性檢出率低，僅為18.75%，增菌PCR（4d）檢出率為31.25%，增菌PCR（7d）檢出率為56.25%，說明增菌PCR檢出率明顯優(yōu)于超過PCR。

增菌PCR在對痰液標(biāo)本進(jìn)行處理基礎(chǔ)上在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～7天后再進(jìn)行特點(diǎn)DNA片段擴(kuò)增進(jìn)行TB檢測的一種方法，對標(biāo)本進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)使細(xì)菌數(shù)量增加，加入液體培養(yǎng)基后稀釋了擴(kuò)增抑制物，使細(xì)菌高度表達(dá)，大大提高了陽性檢出率[9]。標(biāo)本中存在活菌時(shí)通過細(xì)菌培養(yǎng)后數(shù)量會明顯增多，標(biāo)本中不含活菌經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)后細(xì)菌數(shù)量不增加，從而保證了陽性檢出率的準(zhǔn)確性，減少假陽性結(jié)果。由表2可知，7天增菌PCR后對涂陰培陽、涂陰培陰陽性檢出率明顯優(yōu)于4d增菌PCR、常規(guī)PCR，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。增菌PCR的液體培養(yǎng)時(shí)間比常規(guī)PCR長，但是靈敏度更強(qiáng)[10]。常規(guī)PCR在進(jìn)行痰標(biāo)本檢測時(shí)，標(biāo)本中含有死菌時(shí)也會有陽性結(jié)果，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。但是，通過與羅氏培養(yǎng)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，增菌PCR的檢測時(shí)間相對較短，而結(jié)核病患者一般病程漫長，結(jié)核菌生長速度緩慢，可以作為TB檢測的常用方法。

綜上所述，在進(jìn)行TB檢測時(shí)，PCR技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢，能夠明確痰液標(biāo)本中是否含有TB。而且，增菌PCR技術(shù)在PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行痰液標(biāo)本培養(yǎng)，大大提升了對TB的特異性、敏感性陽性檢出率高。操作簡單，受外因污染少，檢測結(jié)果準(zhǔn)確率高，值得作為實(shí)驗(yàn)室檢測TB的常用方法。

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本文編輯：趙小龍

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ISSN.2095-8242.2017.029.5677.02