沙 莎， 曲 樂， 曹云鵬

Aβ3-10基因疫苗對幼年鼠腦內(nèi)老年斑沉積及記憶障礙預防作用的研究

沙 莎1， 曲 樂2， 曹云鵬3

目的 構建表達重復10次的Aβ3-10肽段的DNA疫苗，并探討其對幼年APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ沉積的預防及對其延遲記憶障礙的作用。方法 將該疫苗用體外電穿孔的方法肌肉免疫3月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠，并分別做行為學、Aβ抗體、脾細胞培養(yǎng)上清細胞因子、腦內(nèi)Aβ沉積及星型膠質(zhì)細胞測定。結果 p(Aβ3-10)10-MT和Aβ42組免疫一次后即產(chǎn)生抗體，并隨著免疫次數(shù)增多而增加，類型主要為IgG1，IgG1/IgG2a明顯高于Aβ42組。在Morris水迷宮中，p(Aβ3-10)10-MT和Aβ42組潛伏期明顯減短，空間探索實驗在平臺象限所在時間均較pcDNA3.1組長。p(Aβ3-10)10-MT和Aβ42組脾細胞培養(yǎng)上清IL-4和IFN-γ均增高，而在p(Aβ3-10)10-MT組，IL-4較高，IFN-γ較低。免疫組化結果提示皮質(zhì)和海馬區(qū)老年斑沉積減少。結論 DNA疫苗p(Aβ3-10)10-MT免疫幼年APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠后能產(chǎn)生高滴度的抗體，免疫反應為Th2型，預防腦內(nèi)Aβ的聚集的同時延緩了記憶障礙的發(fā)生與發(fā)展，避免了副反應的發(fā)生，有待成為預防阿爾茨海默病的有效疫苗。

阿爾茨海默??； 免疫治療； Aβ抗體； IL-4； IFN-γ

淀粉樣蛋白(Aβ)在腦的沉著對阿爾茨海默病的發(fā)病起關鍵作用[1]。因此目前對防治AD的研究重點是抑制Aβ的生成或者增加Aβ在體內(nèi)的清除。

Check等首次在Ⅰ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)免疫治療可以減少動物模型腦內(nèi)老年斑的產(chǎn)生，而Ⅱ期臨床卻因不良腦膜腦炎和微出血的發(fā)生而終止，研究者考慮人類發(fā)生腦膜腦炎可能與目標抗原決定簇和佐劑有關[2]。

DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比反應性弱，免疫原性小，在體內(nèi)容易降解，轉(zhuǎn)化效率低下，因此，篩選合適的佐劑成為提高DNA疫苗免疫效應的重要措施[3]。據(jù)文獻報道[4]對有抗原刺激后的小鼠給予褪黑素后，可以明顯增強Th2型免疫反應，主要產(chǎn)生IL4和IgG1，同時降低了IL2，IFN-γ，IgG2a。褪黑素抑制Aβ毒性作用的同時能夠起到增強Th2型免疫反應的佐劑作用，決定了將其應用于AD疫苗的合理性。

為此，本研究選用pcDNA3.1作為載體，重復10次的Aβ3-10作為抗原片段，褪黑素(MT)作為佐劑來增強免疫原性，通過電穿孔的方法肌肉注射3月齡的Tg-APPswe/PSEN1dE9(Tg)鼠，來探討該疫苗是否能產(chǎn)生體液免疫反應，預防腦內(nèi)Aβ的沉積，預防幼年鼠記憶功能的減退，延緩AD的病理過程且減少誘發(fā)炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠購于中國醫(yī)科大學實驗動物部。

1.2 主要試劑 去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒(OMEGA)；抗Aβ抗體6E10(Signet)；Aβ42肽(AnaSpec)；完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑(Invitrogen)；羊抗鼠IgG1-HRP(Santa cruz)；羊抗鼠IgG2ab-HRP(Santa cruz)；羊抗鼠IgG2b-HRP(Santa cruz)；RPMI 1640培養(yǎng)液(HyClone)；小鼠白介素-4 ELISA試劑盒(R&D Systems China Co. Ltd. )；鼠γ干擾素ELISA試劑盒(R&D Systems China Co. Ltd. )；即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德)；DAB顯色試劑盒(武漢博士德)；人β淀粉樣蛋白1-42 ELISA檢測試劑盒(Invitrogen)。

1.3 p(Aβ3-10)10重組表達質(zhì)粒的構建、表達與提取 GenBank查找Aβ3-10的cDNA序列。人工合成重復10次的Aβ3-10基因片段，5’端加入GCCACC kozak序列并引入HindⅢ(AAGCTT)的酶切位點，3’端去掉TAG的終止密碼子，加入linker GGGGS的堿基序列GGAGGCGGAGGCTCC，并引入BamHⅠ(GGATCC)的酶切位點。(Aβ3-10)10基因合成后克隆載入pcDNA3.1載體，經(jīng)測序和酶切鑒定正確，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。將0.8 μg空載體pcDNA3.1(+)和表達載體p(Aβ3-10)10分別加入到50 μl無血清培養(yǎng)基中。將上述質(zhì)粒與稀釋好的Lipofectamine2000室溫下孵育，培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，次日提取蛋白Western blot技術檢測。按照去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒說明書步驟進行。

1.4 動物免疫 21只3月齡雙轉(zhuǎn)基因鼠APPswe/PSEN1dE9購于中國醫(yī)科大學動物部，并將其分為3組：分別為p(Aβ3-10)10-MT組，Aβ42組，pcDNA3.1組，每組7只。免疫劑量均為100 μg，肌肉注射部位為小鼠左側(cè)股四頭肌，第一次免疫后每2 w免疫1次，之后每3 w免疫1次，共免疫10次。小鼠被腹腔注射10%水合氯醛(0.03 mg/kg)麻醉后，用ECM830對其進行電穿孔增強免疫原性，具體方法為將一對電極以間距5 mm覆蓋DNA質(zhì)粒注射位點，調(diào)整電穿孔儀脈沖電壓為75 V，每個脈沖的速度為200 ms。Aβ42每次注射50 μg，免疫前后1 w從小鼠眶后內(nèi)眥靜脈叢取血，留取上清，-70 ℃凍存。最后一次免疫后2 w，脾細胞培養(yǎng)后灌流處死小鼠，迅速取出大腦。

1.5 Morris水迷宮檢測鼠的學習記憶功能

1.5.1 定位航行試驗(place navigation test) 每天訓練8次，將小鼠面向池壁，分別從4個入水點放入水中，記錄從入水到找到平臺并站立其上的時間，即潛伏期。如小鼠在60 s仍未找到平臺，則由實驗者將其引向平臺，其潛伏期記為60 s。3～7 d進行隱藏平臺訓練。將平臺隱藏于水下1 cm，實驗方法同上。根據(jù)小鼠在水中搜索平臺的游泳軌跡確定其每次的搜索策略，以此判斷其學習能力。

1.5.2 空間探索實驗(spacial probe test) 實驗8 d，撤去平臺，選擇平臺相對象限的入水點，將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在60s的游泳軌跡，記錄小鼠穿越平臺的次數(shù)，以此判斷小鼠的記憶能力。

1.6 抗體及分型檢測 (1)抗原包被96孔板，4 ℃孵育過夜。(2)用含有0.05% TW20的1×PBS(200 μl每孔)洗板3次。(3)每孔中加入200 μl封閉緩沖液，用封板膜蓋上孔板，輕輕搖晃，室溫下孵育1 h。(4)免疫前和免疫后的血清以1∶1000(1 μl加入1 ml封閉緩沖液)稀釋。(5)用封閉緩沖液封閉1 h后，棄液，洗板3次。(6)孔中加入50 μl稀釋的血清和標準抗體(6E10：320 ng/ml，160 ng/ml，80 ng/ml，40 ng/ml，20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，0 ng/ml)，然后室溫孵育3 h。(7)棄去孵育的血清和標準抗體。洗板3次。(8)加入稀釋的二抗孵育1 h。(9)洗板5次。(10)每孔中加入100 μl TMB，室溫下孵育15 min。(11)每孔中加入100 μl終止液(2N H2SO4)。讀取450 nm處的OD值。

1.7 免疫組化染色檢測老年斑、星形膠質(zhì)細胞 (1)腦組織在4%多聚甲醛中固定過夜，常規(guī)制備石蠟切片。(2)烤片1 h。(3)切片常規(guī)脫蠟至水。二甲苯(Ⅰ、Ⅱ各35 min)、乙醇系列(無水Ⅰ、無水Ⅱ、95%Ⅰ、95%Ⅱ各5 min)脫蠟至水，(4)30%H2O21份加蒸餾水10份混合，蒸餾水洗3次。(5)熱修復抗原。(6)血清封閉液，室溫20 min。(7)滴加一抗6E10，1∶1000稀釋或1∶500稀釋的GFAP，37 ℃ 1 h。PBS洗3次。(8)滴加二抗，洗3次。(9)滴加試劑SABC，37 ℃ 20 min。PBS洗4次。(10)DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。(11)蘇木素輕度復染。脫水、透明、封片。顯微鏡觀察

2 結 果

2.1 免疫后產(chǎn)生抗體情況 p(Aβ3-10)10-MT組和Aβ42組第一次免疫后即產(chǎn)生了抗體，在第8次免疫后達到最高水平，并分別維持在(92.43±7.50) μg/ml和(55.05±4.72) μg/ml，而空載體組抗體則保持在基線水平(見圖1A)。Aβ42組產(chǎn)生了廣度的抗體類型(IgG1，IgG2a，和IgG2b)，但p(Aβ3-10)10-MT組以IgG1為主(見圖1B)。p(Aβ3-10)10-MT(9.26 ± 1.86)組IgG1/IgG2a比率為Aβ42 組(2.34 ± 1.49；P<0.05)的4倍(見圖1C)。

2.2 免疫后學習記憶功能得到改善 可視平臺訓練中，3組小鼠的潛伏期無統(tǒng)計學差異。隱藏平臺試驗中，Aβ42組和p(Aβ3-10)10-MT組潛伏期遠遠小于空質(zhì)粒組(P<0.05)，而Aβ42組和p(Aβ3-10)10-MT組之間差別無意義(見圖2A)。在空間探索試驗中，Aβ42組和p(Aβ3-10)10-MT組小鼠在平臺所在象限時間及穿越平臺的次數(shù)要遠遠大于空載體組(P<0.05)，而Aβ42組和p(Aβ3-10)10-MT組之間差別無意義(P>0.05) (見圖2B，C，D)。圖D中a-c顯示隱藏平臺三組之間運動軌跡的比較，d-f示空間探索試驗中3組小鼠的運動軌跡的比較。

2.3 免疫后鼠腦內(nèi)老年斑的改變 質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-MT免疫成功地預防了APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的老年斑產(chǎn)生與空質(zhì)粒組比，p(Aβ3-10)10-MT組皮質(zhì)和海馬區(qū)老年斑分別降低了40.9%和49.6%，而Aβ42組分別降低皮質(zhì)和海馬中老年斑沉積量43.6%和52.4%?？召|(zhì)粒組皮質(zhì)和海馬區(qū)老年斑形態(tài)呈黑褐色、密集、粗糙分布，而p(Aβ3-10)10-MT與Aβ42組老年斑呈淺褐色，分散分布。

3 討 論

Holmes等認為老年斑的清除不足以中止AD神經(jīng)退行性變，從而對淀粉樣瀑布假說提出質(zhì)疑，因為升高的Αβ水平及腦內(nèi)淀粉樣改變已經(jīng)進入病理性致病過程，疫苗免疫時間太晚可能不會產(chǎn)生太大的效應[5]。預防免疫治療被認為是最有利的方法來延緩或者阻止AD的病理性進展[6]。

褪黑素、MT、系松果體和淋巴細胞分泌的吲哚酸，在免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的作用[7]。有報道顯示吲哚酸能夠調(diào)節(jié)自然殺傷細胞的細胞毒性，抑制淋巴細胞的增殖反應[8]。 現(xiàn)有的結果證實褪黑素作用于Th2型細胞，以分泌IL-4和IgG1抗體為主，而不是IL-2，IFN-γ和IgG2a[9]。褪黑素具有水溶性和脂溶性使其易于分布于各個細胞，且能通過血腦屏障容易進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[10]。雖然目前沒有關于MT應用于AD相關報道，但其作為佐劑已經(jīng)被廣泛應用于癌癥疫苗來增強其免疫原性[11]。

圖1A：免疫后產(chǎn)生的血清抗體滴度。B：血清抗體分型。C：Aβ42組和p(Aβ3-10)10-MT組血清抗體IgG1/IgG2a值

A：隱藏平臺實驗中3組潛伏期的比較。B：空間探索實驗中3組小鼠在平臺所在象限的時間的比較。C：空間探索實驗中3組小鼠穿過平臺所在位置的次數(shù)。D：隱藏平臺實驗(a，b，c)及空間探索實驗(d，e，f)中3組小鼠運動軌跡圖

圖2 水迷宮實驗結果

圖3 免疫組化示小鼠腦內(nèi)(A～F：皮質(zhì)，G～L：海馬)老年斑的形態(tài)比較；M：3組免疫后的老年斑含量的比較

肌肉注射p(Aβ3-10)10-MT產(chǎn)生了較空載體組較高的高滴度的抗體，但較低于Aβ42組的抗體水平，這一點與其他基因疫苗相似[12]，這種高滴度的抗體主要以IgG1類型為主，這對于提高行為學能力，降低小鼠腦內(nèi)老年斑沉積及星型膠質(zhì)細胞增生起著至關重要的作用。p(Aβ3-10)10-MT組IgG1/ IgG2a比率較Aβ42組明顯增高，預示著Th2型反應，這是基因疫苗的一個明顯優(yōu)勢，它能夠避開Aβ42免疫引起的腦膜腦炎等副反應。

用p(Aβ3-10)10-MT或Aβ42免疫轉(zhuǎn)基因鼠降低了腦內(nèi)Aβ沉積的同時逆轉(zhuǎn)了行為學的缺失。Aβ沉積顯著下降主要以不溶性Aβ為主，可溶性Aβ沒有改變甚至有所升高。小膠質(zhì)細胞數(shù)量也隨著老年斑的減少而減少，小膠質(zhì)細胞介導的FcR段清除[13]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Aβ外流到外周血[14]，由Aβ抗體導致Aβ聚集的破壞及促進其解聚，能夠解釋Aβ的下降[15]。本研究的發(fā)現(xiàn)和曾經(jīng)的報道相一致，報道述Aβ特異性抗體提高了認知功能，機制可能是關于可溶性Aβ產(chǎn)生的細胞反應，促進神經(jīng)因子的產(chǎn)生，最終促使了突觸的增生來增強突觸正常生理功能以提高記憶和認知[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)疫苗p(Aβ3-10)10-MT能夠在雙轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的抗Aβ抗體，產(chǎn)生的免疫反應類型為Th2型，延緩了小鼠的學習及記憶功能的進展，腦內(nèi)Aβ水平顯著降低，老年斑明顯減少，伴隨著星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的減少，沒有微出血的發(fā)生，沒有明顯的T細胞浸潤，成為預防阿爾茨海默病的有效的疫苗。

[1]Hardy J，Selkoe DJ. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease：progress and problems on the road to therapeutics[J]. Science，2002，297：353-356.

[2]Cribbs DH，Ghochikyan A，Vasilevko V，et al. Adjuvant-depandent modulation of Th1 and Th2 responses to immunization with beta-amyloid[J]. Int Immunol，2003，15(4)：505.

[3]Donnelly JL，Wabren B，Liu MA. DNA vaccines：progress and challenges[J]. J Imunnol，2005，175：633-639.

[4]Shaji AV，Kulkarni SK，Agrewala JN. Regulation of secretion of IL-4 and IgG1 isotype by melatonin-stimulated ovalbumin-specific T cells[J]. Clin Exp Immuno，1998，111：181-185.

[5]Holmes C，Boche D，Wilkinson D，et al. Long-term effects of Ab42 immunisation in Alzheimer’s disease：follow-up of a randomised，placebo-controlled phase I trial[J]. Lancet，2008，372：216-223.

[6]St George-Hyslop PH，Morris JC. Will anti-amyloid therapies work for Alzheimer’s disease[J]. Lancet，2008，372：180-182.

[7]Rosenberg RN. Immunotherapy for Alzheimer disease：the promise and the problem[J]. Arch Neurol，2005，62：1506-1507.

[8]Finocchiaro LM，Nahmod VE，Launay JM. Melatonin biosynthesis and metabolism in peripheral blood mononuclear leucocytes[J]. Biochem J，1991，280：727-731.

[9]Shaji AV，Kulkarni SK，Agrewala JN. Regulation of secretion of IL-4 and IgG1 isotype by melatonin-stimulated ovalbumin-specific T cells[J]. Clin Exp Immunol，1998，111：181-185.

[10]Reiter RJ，Cabrera J，Sainz RM，et al. Melatonin as a pharmacological agent against neuronal loss in experimental models of Huntington’s disease，Alzheimer’s disease and parkinsonism[J]. Ann NY Acad Sci，1999，890：471-485.

[11]Connor TP. Melatonin as an adjuvant to therapeutic prostate cancer vaccines[J]. J Pineal Res，2008，45：224.

[12]Lambracht-Washington D，Qu BX，F(xiàn)u M，et al. DNA betaamyloid(1-42) trimer immunization for Alzheimer disease in a wild-type mouse model[J]. JAMA，2009，302：1796-1802.

[13]Wilcock DM，Munireddy SK，Rosenthal A，et al. Microglial activation facilitates Abeta plaque removal following intracranial anti-Abeta antibody administration[J]. Neurobiol Dis，2008，15：11-20.

[14]DeMattos RB，Bales KR，Cummins DJ，et al. Peripheral anti-A beta antibody alters CNS and plasma A beta clearance and decreases brain A beta burden in a mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98：8850-8855.

[15]Solomon B，Koppel R，F(xiàn)rankel D，et al. Disaggregation of Alzheimer beta-amyloid by site-directed mAb[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：4109-4112.

[16]Dodart JC，Bales KR，Gannon KS，et al. Immunization reduces memory deficits without reducing brain Abeta burden in Alzheimer’s disease model[J]. Nat Neurosci，2002，5：452-457.

In vivo electroporation of a new gene vaccine encoding ten repeats of Aβ3-10 efficiently prevents brain Aβ deposition and delays cognitive impairment in young Tg-APPswe/PSEN1dE9 mice

SHASha，QULe，CAOYunpeng.

(Departmentofgeriatric，thefirstaffiliatedhospitalofchinamedicaluniversity，Shenyang110001，China)

Objective To construct a new DNA vaccine，ten tandem repeats of B cell-activating epitope Aβ3-10 as an antigen was used. To demonstrate that immunization with this vaccine will elicit a high titer of anti-Aβ antibodies which efficiently prevents brain Aβ deposition and delays cognitive impairment in young Tg-APPswe/PSEN1dE9 mice. Methods DNA vaccine were chemically synthesized intramuscularly injected into three-month-old APPswe/PSEN1dE9 mice by vivo eletroporation. The Morris water maze test was performed to determine the cognitive impairment. Enzyme-linked immunoabsorbent assays(ELISA)were used to monitor anti-Aβ42 antibody levels，IFN-γ and IL-4.Amyloid burden and cerebral amyloid astrocytosis in the brain of immunized and control mice were detected using immunohistochemistry. Results Anti-Aβ antibodies were detectable and increased with each booster injection. The induced anti-Aβ antibodies in our plasmid group were predominantly of IgG1 isotype，IgG1/IgG2a ratio was greater than that for the Aβ42 group. The escape latency，was signi?cantly shorter. Mice immunized with Aβ42 peptide or p(Aβ3-10)10-MT spent significantly more time in the target quadrant and crossed the platform more often than mice immunized with the empty vector. Ex vivo cultured splenocytes isolated from mice immunized with p(Aβ3-10)10-MT exhibited high IL-4 and low IFN-γ response. Immunohistochemistry showed Aβ burden in both cortex and hippocampus were reduced. Conclusion Intramuscular administration of our novel vaccine p(Aβ3-10)10-MT by in vivo electroporation in young double transgenic mice can induce high levels of anti-Aβ antibodies and subsequently results in a more robust Th2-polarized humoral immune response as well as decreased Aβ accumulation and deposition in the brain and improved memory and cognition. Thus，p(Aβ3-10)10-MT is a safe and effective DNA vaccine for the immunotherapy of AD.

Alzheimer’s disease； Immune therapy； Aβ antibody； IL-4； IFN-γ

1003-2754(2017)07-0580-04

2017-01-12；

2017-04-18

國家自然基金面上項目(No. 81371227)；國家自然科學基金項目(No. 81602741)；遼寧省科技廳博士啟動基金(No. 201501013)；中國醫(yī)科大學校內(nèi)科研基金新教師基金項目(No. XZR20160006)

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學科，遼寧 沈陽 110001；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，遼寧 沈陽 110001；3.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001) 通訊作者：曹云鵬，E-mail：ypengcao@yahoo.com

R741.05

A