劉宏達 任靜華 譚顯惠 呂增祿 王淑梅

摘要：目的：研究奧拉西坦連續(xù)多次灌胃給藥對大鼠CYP3A酶活性的影響。方法：40只SD大鼠隨機分為2組，實驗組大鼠每天一次奧拉西坦（200mg·kg-1）灌胃，對照組每天1次蒸餾水灌胃（1.5mL）；連續(xù)5日，于第6日，2組大鼠均單劑量尾靜脈注射咪達唑侖10mg·kg-1，后由眼底靜脈叢取血，高效液相色譜法測定血藥濃度，以DAS 2.1.1 藥物動力學(xué)程序擬合藥動學(xué)參數(shù)，以SPSS18.0 軟件對組間各參數(shù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：咪達唑侖標準曲線方程為：Y=0.0752X-0.0042（r=0.9999），線性范圍為0.1-30mg·L-1；；方法回收率高中、低濃度分別為（104.9±4.30）%、（101.6±3.28）%和；（109.8±4.54）%，對照組與實驗組主要藥動學(xué)參數(shù)：t1/2、Cmax、AUC0-12h無顯著性差異。結(jié)論：合用奧拉西坦前后，咪達唑侖在大鼠體內(nèi)主要藥動學(xué)參數(shù)無明顯變化，提示奧拉西坦對大鼠體內(nèi)CYP3A4無影響。

促智藥奧拉西坦（oxiracetam，ORC）具有很好的改善記憶和學(xué)習(xí)功能，臨床常用于理化因素所致腦缺氧、慢性腦功能不全及智能、記憶力障礙等的治療[1]。奧拉西坦對對肝微粒體酶影響研究尚少，其代謝途徑尚不清晰。本研究將咪達唑侖作為探針藥物[2]，探討奧拉西坦對CYP3A 酶活性的影響[3-4]，為與其他臨床藥物聯(lián)合用藥合理性提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：奧拉西坦；咪達唑侖；CYP3A4；高效液相色譜法；藥動學(xué)

1 儀器與材料

1 儀器與材料

1.1 儀器

Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，美國Waters公司）；渦旋混合器（XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；冷凍離心機（GL-20G-Ⅱ，上海安亭科學(xué)儀器廠）；高效液相色譜系統(tǒng)。

1.2試驗用藥

乙腈（天津市康科德科技有限公司，批號：111203）。奧拉西坦對照品（中諾藥業(yè)有限公司-石藥集團，純度99.60%，批號：128101207）；咪達唑侖對照品（宜昌人福藥業(yè)責任有限公司，含量100.8%，批號MD111106）；咪達唑侖注射液（規(guī)格5ml：5mg，江蘇恩華藥業(yè)集團有限公司，批號20110825）注射用奧拉西坦（規(guī)格1.0g，批號262120318）石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，

1.3 實驗動物

雄性SD大鼠，清潔級，體重（300±10）g，動物許可證號SCXK（晉）2009-0001，由山西省動物實驗中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（62：38，V/V）；進樣量：20μL，柱溫：30℃；檢測波長：225nm；流速：1.0mL·min-1。

2.2 血漿樣品處理

室溫下自然解凍血漿樣品，以10000r·min-1速度離心5min后取200μL上清液于塞離心管中，加入20μl內(nèi)標溶液混勻后（150μg/ml地西泮溶液為內(nèi)標液），加提取劑（異丙醇：乙酸乙酯=2：8）500μl，渦旋震蕩1min，10000rpm離心5min，取上清液500μl，37℃水浴下氮氣流吹干，殘渣用100μl甲醇復(fù)溶后進樣處理。

2.3 方法學(xué)

2.3.1專屬性試驗

取咪達唑侖和內(nèi)標地西泮對照品溶液進樣。然后取空白血漿及灌胃后給咪達唑侖的血漿樣品進樣處理、測定并記錄色譜圖。結(jié)果提示我們在相應(yīng)色譜條件下，咪達唑侖保留時間為6.7min。且峰形良好，內(nèi)標保留時間為8.2min峰形良好，，咪達唑侖的測定未受大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)干擾。見圖1.

2.3.2 標準曲線

按“2.1.2”項下方法，將濃度分別為30，20，10，5，1，0.25，0.1，μg /ml的咪達唑侖模擬血漿樣品，進行處理測定。以測得的咪達唑侖峰面積與內(nèi)標的峰面積之比（Y）對血漿藥物濃度（X）進行線性回歸，得到標準曲線方程為Y=0.0752X-0.0042（r=0.9999，n=7），在0.1～30mg·L-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。。

2.3.3 回收率

咪達唑侖及內(nèi)標提取回收率：將空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備20μg/ml、5μg/ml、0.25μg/ml的咪達唑侖模擬血漿樣品，按照2.2血漿樣品處理進行測定并記錄峰面積值。咪達唑侖提取回收率計算為咪達唑侖峰面積與直接進樣的對照品溶液峰面積比值；內(nèi)標提取回收率為地西泮峰面積與直接進樣的對照品溶液峰面積比值。

方法回收率：將空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備20μg/ml 、5μg/ml、0.25μg/ml的咪達唑侖模擬血漿樣品，依照上面2.2血漿樣品處理方法測定后記峰面積數(shù)值。方法回收率為計算測得濃度與加入濃度的比值。

2.3.4精密度

取空白血漿15份，分3組，每組5份，依次制備20μg/ml0、 5μg/ml、25μg/ml的咪達唑侖模擬血漿樣品，同樣依照2.2血漿樣品處理方法處理，并在一天的不同時間段測定，計算日內(nèi)精密度；于0，1，2，3，4日處理并測定，計算日間精密度。模擬血漿樣品三種不同濃度的日內(nèi)精密度、日間精密度的RSD值分別為6.38%，3.23%、11.05%、均在規(guī)定范圍內(nèi)，表明該方法精密度良好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗

根據(jù)需要，分別考察了樣品室溫放置的穩(wěn)定性，長期冷凍保存穩(wěn)定和反復(fù)凍融穩(wěn)定性。結(jié)果表明：室溫下陰暗干燥處放置4h，-40℃低溫避光保存10d，反復(fù)凍融3 次，RSD< 6.4%，能夠很好的滿足血清樣品測定的需要。

2.4藥動學(xué)實驗

2.4.1溶液的制備

濃度為10mg·L-1咪達唑侖原液即用。另將奧拉西坦注射液2支，注入50ml量瓶中，用蒸餾水定容，然后制備成為40mg·L-1濃度的奧拉西坦溶液。

2.4.2分組與給藥

40只健康SD大鼠備隨機分成2組，每組20只，設(shè)為對照組和實驗組。對照組每天一次1.5mL蒸餾水灌胃；實驗組每天一次奧拉西坦溶液灌胃（200mg·kg-1），連續(xù)5天達穩(wěn)態(tài)后，兩組大鼠均以10mg·kg-1的比值尾靜脈注射咪達唑侖。并分別以給藥后0min，5min，10min，20min，30min，1h，1.5h，2h，4h，6h為時間點眼內(nèi)眥取血，每次取血0.5mL，置于肝素鈉抗凝的離心管中，以10000r·min-1的速度離心5min，取上層血漿，保存在-40℃冰箱待測。

2.4.3血樣測定與數(shù)據(jù)處理

將自然解凍的待測SD大鼠血漿樣品，按照2.2血漿樣品處理方法進行處理，測定數(shù)值。按照標準曲線方程對每只動物各個時間點的血漿藥物濃度進行計算，將血藥濃度-時間數(shù)據(jù)用DAS2.1.1藥代動力學(xué)軟件處理，得到對照組與實驗組大鼠的藥動學(xué)參數(shù)，使用SPSS13.1統(tǒng)計學(xué)軟件進行計算，比較兩組間參數(shù)差異有無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組大鼠體內(nèi)咪達唑侖的藥-時曲線見圖2，主要藥物參數(shù)見表2

計學(xué)處理，結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗組的t1/2、Cmax、AUC（0-12）、AUC（0-∞）、CL/F和V/F與對照組相比沒有顯著性差異（P>0.05）。

3討論

文獻報道[5]，觀察被影響藥物體內(nèi)藥動學(xué)的變化情況，先給予能夠產(chǎn)生影響的藥物，使其體內(nèi)達到穩(wěn)態(tài)水平。對肝微粒體酶系統(tǒng)的影響充分體現(xiàn)出來，再給予被影響藥物。奧拉西坦使用后，在腦、肝、腎、及皮膚等全身組織藥物廣泛分布，3-5天可達穩(wěn)態(tài)；在研究奧拉西坦對咪達唑侖的相互作用時，首先應(yīng)確保體內(nèi)是否達到穩(wěn)態(tài)。而后尾靜脈給予咪達唑侖注射，密切觀察其藥動學(xué)變化情況，如實反映奧拉西坦對咪達唑侖藥動學(xué)的影響。

參考文獻：

[1]紀立偉，胡欣，促智藥奧拉西坦研究進展[J ].中國藥物與臨床，2003，3（4）：354-356.

[2]趙娜萍，余露山，HPLC法測定大鼠血漿中咪達唑侖的含量及其在藥物相互作用研究中的應(yīng)用[J].藥物分析雜志，2007，（6）465-467

[3]劉昌孝，顧以保，李全勝等，奧拉西坦在大鼠和小鼠的藥代動力學(xué)研究[J]藥學(xué)學(xué)報，1999，34（2）：85.

[4]劉秀菊，張志清，楊秀嶺等.HPLC法測定大鼠血漿中奧拉西坦的濃度[J].中國藥房，2012.23.（5）：403

[5]Linda E G，Jeanette F K，Anthony L E，et al. Effect of omeprazole on concentrations of clarithromycin in plasma and gastric tissue at steady state[J]. Antimicrobial agents and chemotherapy，1995，39（9）：2078-2083.