劉穎 唐家年 黃川騰 劉國(guó)選 林詩(shī)婉 高美芳 吳東霖 陳建平

摘要 [目的]建立促進(jìn)麻瘋樹(shù)再生不定芽生根的組培體系。[方法] 通過(guò)在誘導(dǎo)麻瘋樹(shù)再生不定芽分化生根的培養(yǎng)基（MS+0.3 mg/L IBA）中添加一定濃度的L-谷氨酰胺（Gln）來(lái)達(dá)到促進(jìn)芽條生根的效果。[結(jié)果] 在誘導(dǎo)麻瘋樹(shù)再生不定芽分化生根的培養(yǎng)基中添加20 mg/L Gln，可以顯著提高芽條的生根率，生根率可達(dá)40%～50%。同時(shí)，可以在短時(shí)間內(nèi)就獲得較高的生根率，顯著縮短了獲得完整植株的周期。此外，還減少了生根過(guò)程中常見(jiàn)的再生植株葉片發(fā)黃、容易脫落現(xiàn)象的發(fā)生，顯著提高了所獲得的再生完整植株的質(zhì)量。[結(jié)論] 麻瘋樹(shù)生根培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為添加0.3 mg/L IBA和20 mg/L Gln的MS培養(yǎng)基，應(yīng)用該研究建立的組培體系可顯著改善麻瘋樹(shù)再生不定芽的生根效果。

關(guān)鍵詞 麻瘋樹(shù)；L-谷氨酰胺；再生不定芽；生根

中圖分類號(hào) S184；Q949.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）07-0125-05

Effect of L-Glutamine on the Rooting of Regenerated Shoot Buds of Jatropha curcas

LIU Ying1，TANG Jia-nian1，HUANG Chuan-teng2，CHEN Jian-ping3* et al （1.Faculty of Agricultural Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088；2.Hainan Provincial Forestry Institute，Haikou，Hainan 571100；3.Faculty of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract [Objective] To establish a tissue culture system for promoting rooting of regenerated buds of Jatropha curcas.[Method] L-glutamine （Gln） was added into rooting medium （MS+0.3 mg/L IBA） for improving the rooting efficiency of regenerated buds of J.curcas.[Result]When 20 mg/L Gln was supplemented into rooting medium，the rooting efficiency of regenerated shoot buds could be significantly increased （raised up 40%-50%）.In addition，satisfactory rooting rate was obtained in a short time （10～20 days），and the cycle of gaining a complete plant was shortened significantly.Moreover，reducing the chances of this happening that the leaves were easy to be yellowing and fall down from regenerated plants in the process of rooting，and then the quality of regenerated whole plants was obviously improved.[Conclusion] The optimal combination of rooting medium was MS medium supplemented with 0.3 mg/L IBA and 20 mg/L Gln.The rooting effect of regenerated buds of J.curcas could be significantly enhanced via application of the tissue culture system established in this study.

Key words Jatropha curcas；L-glutamine；Regenerated shoot buds；Rooting

麻瘋樹(shù)（Jatropha curcas L.）又名小桐子、黃腫樹(shù)，為大戟科（Euphorhiaceae）麻瘋樹(shù)屬（Jatropha）多年生的落葉灌木或小喬木[1]。麻瘋樹(shù)原產(chǎn)于中美洲，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[2]，在我國(guó)主要生長(zhǎng)在四川、云南、貴州、廣東、廣西、海南和臺(tái)灣等?。▍^(qū)）。麻瘋樹(shù)組織提取物中的毒蛋白、麻瘋酮等活性成分可以被開(kāi)發(fā)為藥物，常用于消腫散淤、清熱解毒等，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)具有顯著的抗癌活性[3-4]，還可用于生物病蟲害防治[5]。麻瘋樹(shù)種子含油量高達(dá)40%～60%，提取的種子油可用于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的“生物柴油”[6-8]，有利于緩解當(dāng)前全球石油能源短缺的問(wèn)題。麻瘋樹(shù)被認(rèn)為是一種重要的可再生能源，受到世界各國(guó)科學(xué)家的廣泛關(guān)注[7-8]。然而，麻瘋樹(shù)生長(zhǎng)區(qū)域有限以及種子產(chǎn)量低限制了麻瘋樹(shù)生物柴油產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。通過(guò)遺傳改良可以提高麻瘋樹(shù)種子含油量以及改變油脂的組分，增強(qiáng)麻瘋樹(shù)的抗病害能力和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，擴(kuò)大其種植面積[9]。

目前，植物遺傳改良主要是采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，但是進(jìn)行此類遺傳轉(zhuǎn)化，需要一個(gè)良好的植株組織培養(yǎng)再生體系。植物組織培養(yǎng)技術(shù)在麻瘋樹(shù)的遺傳改良和良種繁育方面得到了廣泛應(yīng)用。現(xiàn)已建立起來(lái)的誘導(dǎo)麻瘋樹(shù)再生不定芽生根的方法仍然存在芽條生根效率低、再生不定根的質(zhì)量較差、所獲得再生植株生長(zhǎng)狀態(tài)不佳、整個(gè)培養(yǎng)周期較長(zhǎng)等缺點(diǎn)，難以滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

L-谷氨酰胺（Gln）是一種在植物生命活動(dòng)中起著重要作用的氨基酸。它是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)氨基酸，又是合成含氮生物物質(zhì)的氮源，與組織生長(zhǎng)和發(fā)育有著密切的關(guān)系。在不同植物組織中Gln具有不同的代謝作用，起著非常重要的生理作用。Gln常常被當(dāng)作有機(jī)氮源應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)[10]。許多研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加適宜濃度的Gln可以改善外植體的再生效果[11-13]。還有研究報(bào)道，培養(yǎng)基中添加一定濃度的Gln可能會(huì)對(duì)一些植物再生不定芽的生根產(chǎn)生積極作用[14-16]。截至目前，關(guān)于Gln對(duì)麻瘋樹(shù)再生不定芽分化生根影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)添加一定濃度的Gln來(lái)考察其誘導(dǎo)麻瘋樹(shù)再生不定芽生根效率的影響，為解決麻瘋樹(shù)再生不定芽生根困難提供一種方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料

研究采用的麻瘋樹(shù)種子（M-19）均采自海南省?？谑袞|山林場(chǎng)[17]。將這些種子剝殼后進(jìn)行表面滅菌，在培養(yǎng)基上進(jìn)行12 d萌發(fā)培養(yǎng)后，從實(shí)生苗上獲得子葉葉柄外植體[18-21]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Gln母液的配制。準(zhǔn)確稱取一定量的Gln粉末，用去離子水充分溶解后，再用去離子水定容，配制成2 mg/mL的Gln母液。使用前用0.22 μm的水系濾膜對(duì)已配制好的Gln母液進(jìn)行過(guò)濾滅菌。

1.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

該研究所有試驗(yàn)都是在相同培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行。培養(yǎng)基均使用1 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH至5.8～6.0，然后在121 ℃，0.1 MPa的條件下高壓滅菌20 min。組織培養(yǎng)室培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2 000 lx、光照時(shí)間12 h/d和培養(yǎng)溫度（25±1）℃。在無(wú)特殊說(shuō)明情況下，所用培養(yǎng)基均添加了100 mg/L肌醇、3%蔗糖和0.6%瓊脂。

1.2.3 麻瘋樹(shù)再生不定芽的獲取。采用實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道的方法[18-21]，利用高濃度TDZ溶液誘導(dǎo)麻瘋樹(shù)子葉葉柄外植體再生不定芽，從而獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的麻瘋樹(shù)再生不定芽，然后將帶有再生不定芽的外植體接種至添加了0.5 mg/L BA（芐氨基腺嘌呤）、0.2 mg/L KT（激動(dòng)素）、0.4 mg/L GA3（赤霉素）和0.2 mg/L IAA（吲哚乙酸）的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行15 d不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)，之后從培養(yǎng)瓶中取出高度大于1 cm且至少有2個(gè)伸展葉片的不定芽外植體，用滅過(guò)菌的手術(shù)刀對(duì)伸長(zhǎng)的再生不定芽進(jìn)行橫向切割，切去其他部分，只保留長(zhǎng)度約為1 cm的不定芽芽條。注意切割的方向與伸長(zhǎng)的再生不定芽的中軸相垂直，切口平齊。

1.2.4 麻瘋樹(shù)再生不定芽生根培養(yǎng)。

1.2.4.1 采用傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)麻瘋樹(shù)再生不定芽生根。將獲取芽條以豎插方式（使芽條的中軸與培養(yǎng)基表面相垂直，芽條的形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基中的深度為0.2～0.4 cm）接種至6種傳統(tǒng)生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)10、20、30、40 d后分別統(tǒng)計(jì)再生不定芽的生根情況[22]。

6種生根培養(yǎng)基分別為無(wú)激素MS培養(yǎng)基[23]，無(wú)激素1/2MS培養(yǎng)基[24]，添加了3.0 mg/L IBA（吲哚丁酸）、1.0 mg/L IAA和1.0 mg/L NAA（萘乙酸）的1/2MS培養(yǎng)基[25]，添加了0.1 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基[24]，添加了1.0 mg/L NAA的1/2MS培養(yǎng)基[23]，添加了0.5 mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基[26]。

1.2.4.2 采用在培養(yǎng)基中添加Gln的方法誘導(dǎo)麻瘋樹(shù)再生不定芽生根。將獲取芽條以豎插方式（使芽條的中軸與培養(yǎng)基表面垂直，芽條的形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基中的深度為0.2～0.4 cm）分別接種至添加了0、5、10、20、40、80、160 mg/L Gln和0.3 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)10、20、30、40 d后分別統(tǒng)計(jì)再生不定芽的生根情況。

1.2.5 麻瘋樹(shù)再生植株的馴化移栽。

從培養(yǎng)瓶中小心取出麻瘋樹(shù)再生小植株，在自來(lái)水下洗去植株根部所帶有的培養(yǎng)基后，將其種植在已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)（土∶沙礫=1∶1）中，保鮮膜覆蓋保濕培養(yǎng)14～21 d后，將植株移栽至盛有土壤的培養(yǎng)盆中繼續(xù)生長(zhǎng)。

1.2.6 試驗(yàn)結(jié)果記錄與數(shù)據(jù)處理。該研究所有試驗(yàn)處理均重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)包括30個(gè)外植體，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 采用傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)麻瘋樹(shù)再生不定芽生根的效果

將獲取芽條以豎插方式接種至6種傳統(tǒng)生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)10、20、30和40 d后進(jìn)行生根效果統(tǒng)計(jì)。由表1可知，在6種誘導(dǎo)芽條生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)芽條生根效果最好的是添加了0.5 mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基，芽條在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d后，生根率為18.07%，平均每個(gè)芽條上的根數(shù)為2.61條，平均根長(zhǎng)為2.27 cm，都為最大值；而培養(yǎng)30 d后，其生根率為16.15%，平均每個(gè)芽條上的根數(shù)為2.56條，平均根長(zhǎng)為2.14 cm（圖1Ⅵ），所獲得的結(jié)果與40 d時(shí)都沒(méi)有差異顯著性。因此為了縮短培養(yǎng)時(shí)間，更快地獲得再生植株，采用30 d的培養(yǎng)時(shí)間為宜。芽條在無(wú)激素培養(yǎng)基（MS和1/2MS）中都不能產(chǎn)生不定根（圖1Ⅰ和Ⅱ），而在添加較高濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基（1/2MS+3.0 mg/L IBA+1.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA、1/2MS+1.0 mg/L NAA和1/2MS+0.1 mg/L IAA）上生根率較低（圖1Ⅲ～Ⅴ），這說(shuō)明添加過(guò)高濃度的生長(zhǎng)素會(huì)對(duì)芽條生根產(chǎn)生一定的抑制作用。此外，在試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，采用常見(jiàn)生根培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)麻瘋樹(shù)再生不定芽生根，培養(yǎng)后所獲得完整植株上的葉片容易發(fā)黃甚至脫落。

綜上所述，采用傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)麻瘋樹(shù)再生不定芽生根的效果不佳，存在生根率較低、培養(yǎng)周期較長(zhǎng)、生根質(zhì)量較差、難以獲得生長(zhǎng)狀態(tài)良好的再生植株等問(wèn)題。

2.2 Gln對(duì)麻瘋樹(shù)再生不定芽生根效果的影響

將獲取芽條以豎插方式接種至添加了0.3 mg/L IBA和0、5、10、20、40、80、160 mg/L Gln的MS培養(yǎng)基以及2組對(duì)照培養(yǎng)基CK1（無(wú)激素MS培養(yǎng)基）和CK2（僅添加20 mg/L Gln的MS培養(yǎng)基）上培養(yǎng)，培養(yǎng)10、20、30、40 d后分別統(tǒng)計(jì)再生不定芽的生根情況。由表2可知，在未添加Gln的生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)芽條生根的效果較差，生根率最高為21.52%；而在添加Gln的生根培養(yǎng)基中，隨著添加Gln的濃度提高，芽條生根率先增加，到20 mg/L時(shí)，芽條的生根效果最佳，生根率最高為49.32%，平均每個(gè)芽條上的根數(shù)最多為6.52條，平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)為5.15 cm，繼續(xù)提高Gln的濃度，芽條的生根效果變差，生根率降低，到160 mg/L時(shí)，生根率最高僅為13.62%，平均每個(gè)芽條上的根數(shù)最多為2.02條，平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)為2.18 cm。由此可見(jiàn)，在培養(yǎng)基中添加Gln的濃度太低或者太高都不利于芽條不定根再生，Gln的最適添加濃度為20 mg/L。

培養(yǎng)時(shí)間為10 d時(shí)，芽條在添加10～40 mg/L Gln的生根培養(yǎng)基中，生根率為23.36%～29.31%，特別是在添加了20 mg/L Gln的生根培養(yǎng)基中芽條的生根效果最佳，生根率最大為29.31%，平均每個(gè)芽條上的根數(shù)為2.26條，平均根長(zhǎng)為1.32 cm（圖1Ⅶ）；而此時(shí)芽條在未添加Gln的生根培養(yǎng)基中的生根效果不佳，生根率僅為8.53%，平均每個(gè)芽條上的根數(shù)為1.32條，平均根長(zhǎng)為0.65 cm。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，芽條的生根率也逐漸增加，然而當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)30 d后，繼續(xù)增加培養(yǎng)時(shí)間，芽條的生根率并沒(méi)有顯著增加（圖1Ⅷ）。

此外，芽條在無(wú)激素MS培養(yǎng)基上不能再生出不定根，并且芽條的生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，葉片易發(fā)黃；而在只添加了20 mg/L Gln的MS培養(yǎng)基上生根效果也非常差，生根率最高僅為12.32%，平均每個(gè)芽條上的根數(shù)為1.67條，平均根長(zhǎng)為1.79 cm，此時(shí)芽條的生長(zhǎng)狀態(tài)也不好，葉片難以繼續(xù)伸展（表1、2）。

綜上所述，麻瘋樹(shù)再生不定芽在添加20 mg/L Gln的培養(yǎng)基中的生根效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法，且在較短時(shí)間內(nèi)（10 d）就可以達(dá)到較好的生根效果，生根率最高為29.31%，最后還可以獲得生長(zhǎng)狀態(tài)良好的再生植株（圖1Ⅸ）。

3 結(jié)論與討論

麻瘋樹(shù)再生不定芽條存在生根難的問(wèn)題，嚴(yán)重阻礙了其組培再生和遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展。生長(zhǎng)素是誘導(dǎo)芽條生根的強(qiáng)效激素[27-28]。IBA是一種常見(jiàn)的生長(zhǎng)素，常被用于誘導(dǎo)再生不定芽生根。在對(duì)麻瘋樹(shù)葉柄外植體再生不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)時(shí)，IBA也是一種常見(jiàn)的生長(zhǎng)素，常被用于誘導(dǎo)芽條不定根再生[29-30]。該研究結(jié)果表明，雖然麻瘋樹(shù)再生不定芽在添加0.3 mg/L IBA的培養(yǎng)基中可以形成不定根，但是生根效果較差，生根率最高僅為22.76%。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，伸長(zhǎng)芽條上的葉片容易發(fā)黃甚至脫落，并且這種現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生在將麻瘋樹(shù)再生芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)[31-32]。

Gln作為一種參與植物新陳代謝的重要內(nèi)源性氨基酸組分，是合成生物體內(nèi)極其重要的抗氧化劑還原型谷胱甘肽的前體物質(zhì)，是構(gòu)成蛋白質(zhì)中氨基酸和合成含氨生物物質(zhì)的氮源，與組織生長(zhǎng)和修復(fù)有密切的關(guān)系，在生命活動(dòng)中起重要作用[33]，并且常常被當(dāng)作一種有機(jī)氮源添加到植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中[10]。有很多研究表明，在培養(yǎng)基中添加Gln可以提高外植體的再生效率和外植體的生物量[34-36]。氮的濃度和銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的相對(duì)含量可能對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)建成起著至關(guān)重要的作用[37-38]。雖然使用添加了氨基酸或者水解蛋白的培養(yǎng)基來(lái)促進(jìn)外植體增殖的報(bào)道比較常見(jiàn)，但是氨基酸是如何影響離體器官發(fā)生的機(jī)理還不清楚。還有些研究結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加Gln可以影響多種植物再生不定芽的生長(zhǎng)效果，如Kaur等[39]在誘導(dǎo)兒茶[Acacia catechu（Linn.f.） Willd]再生不定芽生根時(shí)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加150 mg/L Gln，可以明顯緩解芽條上葉片易發(fā)黃和脫落的現(xiàn)象，但是并沒(méi)有探究Gln對(duì)芽條生根效率的影響。

該研究結(jié)果表明，麻瘋樹(shù)再生不定芽在未添加IBA的MS培養(yǎng)基上沒(méi)有不定根再生發(fā)生，而在添加了IBA的培養(yǎng)基上有不定根發(fā)生，說(shuō)明IBA對(duì)于芽條再生不定根發(fā)生可能是必須的，然而芽條在只添加了0.3 mg/L IBA的培養(yǎng)基上雖然可以生根，但是生根效果較差，葉片容易發(fā)黃甚至脫落；如果在添加了0.3 mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基中再添加一定濃度的Gln，芽條的生根效率會(huì)有顯著提高并且葉片可以保持鮮綠，但是芽條在僅添加20 mg/L Gln而沒(méi)有添加IBA的MS培養(yǎng)基上的生根效果非常差，由此可以說(shuō)明Gln對(duì)芽條生根具有促進(jìn)作用并且芽條上葉片生長(zhǎng)的改善作用可能是由于Gln與IBA的協(xié)同作用所產(chǎn)生的效果。

此外，該研究還發(fā)現(xiàn)采用傳統(tǒng)方法對(duì)麻瘋樹(shù)再生不定芽進(jìn)行不定根誘導(dǎo)時(shí)，對(duì)芽條的質(zhì)量要求較高，一般是要求芽條的長(zhǎng)度至少達(dá)2 cm，帶有3～4個(gè)葉片[40-41]，這在一定程度上減少了可以用于進(jìn)行生根培養(yǎng)的芽條數(shù)量，因而會(huì)減少獲得完整再生植株的數(shù)量；而采用在生根培養(yǎng)基中添加適宜濃度Gln的方法可以促使質(zhì)量較差、長(zhǎng)度約為1 cm且只帶有2～3個(gè)葉片的芽條生根，這在一定程度上提高了可以用于生根培養(yǎng)的再生不定芽的利用效率，最終可以增加獲得完整再生植株的數(shù)量。如果將此方法應(yīng)用于麻瘋樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化，可能會(huì)提高獲得完整轉(zhuǎn)化苗的效率。在試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，添加了適宜濃度Gln的試驗(yàn)組中的芽條培養(yǎng)30 d后，不僅生根效果良好，所獲得再生植株的生長(zhǎng)狀態(tài)也良好，葉片鮮綠。另外，對(duì)于那些沒(méi)有生根的芽條還可以將其接種至添加了20 mg/L Gln的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行再次生根培養(yǎng)，這樣可以提高芽條的利用效率，增加完整再生植株的數(shù)量。

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