姜濤，崔穎，倪松

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300461；2.天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

MAE-LC-AFS測定雞蛋中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸

姜濤1，2，崔穎2，倪松2

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300461；2.天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

建立微波輔助萃取-液相色譜-原子熒光光譜法（Microwave Assisted Extraction-Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry，MAE-LC-AFS）測定雞蛋中阿散酸（Arsanilic，ASA）、洛克沙砷（Roxarsone，ROX）、硝苯砷酸（Nitarsone，NIT）的分析方法。研究并優(yōu)化液相色譜和原子熒光的工作條件。在0～2.0 mg/L范圍內阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷的線性關系良好，線性相關系數(shù)大于0.999，阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷檢出限（S/N=10）分別為0.1、0.2、0.2 mg/kg。阿散酸在0.1、0.2、0.5 mg/kg 3個加標水平下的平均回收率為80.5%～91.0%，相對標準偏差為3.14%～3.77%；硝苯砷酸和洛克沙砷在0.2、0.5、2 mg/kg，3個加標水平下平均回收率為81.0%～91.1%和82.5%～104.9%，相對標準偏差為2.72%～4.02%和1.81%～7.52%。

微波輔助萃??；液相色譜-原子熒光；雞蛋；阿散酸；硝苯砷酸；洛克沙砷

砷是一種有毒的非金屬元素，按其存在形式分為無機砷和有機砷，其中部分有機砷毒性較小而作為一種飼料添加劑廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)，如阿散酸（Arsanilic，ASA）、洛克沙砷（Roxarsone，ROX）、硝苯砷酸（Nitarsone，NIT）。有機砷在畜禽產品中存在蓄積作用，過量的砷會導致畜禽多重器官組織功能紊亂和器質性病變，其蓄積作用也會通過生物鏈間接對人類健康造成影響[1-3]，所以砷含量是國家衛(wèi)生標準的一項重要指標。目前對有機砷的研究主要集中在飼料[4-6]和肉類食品[7]中，對蛋類中有機砷含量的研究較少，蛋類在人類食物結構中占有極其重要的位置，所以測定蛋類中的有機砷含量對于提高百姓餐桌上的安全性以及保障人民群眾的身體健康有著重要意義。

食品中有機砷的測定方法有原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質譜法（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS）、原子吸收光譜法、比色法等，其中原子熒光光譜法是近幾年發(fā)展起來的一種新型痕量元素分析技術[8]，具有簡便快速、靈敏度高[9]、共存元素干擾少[10]、適用于多元素同時分析[11]等優(yōu)點，廣泛應用于食品中砷元素的檢測。樣品測定前需要預先消化，微波消解作為一種新型的消解方式，具有空白值低、消解速度快、待測元素損失率低和樣品被污染的可能性低等優(yōu)點，同時降低了勞動強度及分析成本，并改善了工作環(huán)境。目前在各種樣品的消解處理中已得到廣泛應用[12-14]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-AFS9800液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀：北京海光儀器公司，由液相色譜儀（包括液相色譜泵和進樣裝置）與原子熒光光譜儀組成；Explorer48微波輔助萃取儀：美國CEM公司；T18均質器：德國IKA公司；LD4-2型離心機：北京醫(yī)用離心機廠；超純水儀、0.45 μm濾膜：美國Millipore公司；反相C18色譜柱：（1）250 mm×4.60mm，5μm，DIKMA公司，型號Cat.no：99603；（2）250 mm×4.60 mm，5 μm，Waters公司，型號WAT054275；（3）250 mm×4.60 mm，5 μm，phenomenex公司，型號00G-425-E0。

阿散酸（p-Arsanilic acid，CAS編號：2045-00-3，C6H8AsNO3）標準品（純度大于等于99%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，德國）；洛克沙砷（3-Nitro-4-hydroxy-phenylarsonic acid，CAS編號：121-19-7，C6H6AsNO6）標準品（純度大于等于97.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，德國）；硝苯砷酸（4-Nitrophenylarsonic acid，CAS編號：98-72-6，C6H6AsNO5）標準品（純度大于等于95%，日本和光純藥工業(yè)株式會社）；甲醇為色譜純；鹽酸為優(yōu)級純；三氟乙酸、氫氧化鈉、硼氫化鉀、磷酸二氫鉀均為分析純；試驗用水為超純水，雞蛋為市售。

阿散酸標準儲備溶液：準確稱取適量的阿散酸標準品，用去離子水配成濃度為500 μg/mL的標準儲備液。根據(jù)需要用去離子水稀釋成適當濃度的標準工作液。

洛克沙砷標準儲備溶液：準確稱取適量的洛克沙砷標準品，用去離子水配成濃度為500 μg/mL的標準儲備液。根據(jù)需要用去離子水稀釋成適當濃度的標準工作液。

硝苯砷酸標準儲備溶液：準確稱取適量的硝苯砷酸標準品，用去離子水配成濃度為500 μg/mL的標準儲備液。根據(jù)需要用去離子水稀釋成適當濃度的標準工作液。

1.2 液相色譜-原子熒光聯(lián)用分析條件

液相色譜條件為色譜柱：反向C18色譜柱（柱長250 mm，粒徑4.6 mm），或相當者；流動相為甲醇-磷酸二氫鉀溶液（5+95，體積比）；流速：1.2 mL/min；進樣量100 μL。

原子熒光工作條件為燈電流：100 mA；負高壓：320 V；載氣流速：400 mL/min；屏蔽氣流：950 mL/min。

1.3 樣品前處理

取一顆雞蛋，去殼，把蛋清蛋黃攪勻，放于均質器均質5 min，備用。

2 結果與討論

2.1 微波萃取條件的選擇

稱取試樣1 g（精確至0.001 g）于微波輔助萃取內罐中，加入10 mL甲醇溶液，按照微波輔助萃取儀的標準操作步驟進行提取。提取完畢，取出冷卻至室溫，10 000 r/min離心10 min。取4 mL上清液，氮氣吹掃，用甲醇溶液定容至2 mL，經0.45 μm有機濾膜過濾后進行測定。按同一操作方法作空白試驗。

2.1.1 萃取劑濃度的選擇

分別用濃度為10%、20%、30%、40%、50%的甲醇溶液，測試加0.2 mg/kg阿散酸、洛克沙砷和硝苯砷酸的混合標液的雞蛋樣品的加標回收率。微波萃取儀萃取時間為40 min，萃取溫度為50℃。不同濃度的甲醇溶液提取效率如圖1。

圖1 甲醇溶液濃度對萃取率的影響Fig.1 Effect of methanol concentration on extraction rate

由圖1可知，隨著甲醇溶液濃度的增加，提取效果逐漸提高，但是當甲醇溶液提高到一定程度時，提取效率反而下降。因此最終選擇甲醇溶液體積分數(shù)為30%。

2.1.2 萃取時間的選擇

萃取時間是影響萃取效果的重要因素。試驗分別選擇20、40、60、80、100 min的萃取時間，微波萃取儀萃取濃度為30%，萃取溫度為50℃，有機砷混合標液萃取效果如圖2。由圖2可知，隨著萃取時間的增加，萃取效果越高，萃取時間超過60 min后，萃取效果提高不明顯。為提高工作效率，最終選擇萃取時間為60 min。

圖2 萃取時間對萃取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate

2.1.3 萃取溫度的選擇

微波萃取儀的使用溫度范圍為-80℃～300℃。試驗分別設定45、55、65、75、85℃的萃取溫度，甲醇溶液濃度為30%，提取時間為60 min，不同萃取溫度效果如圖3。由圖3可知，最佳萃取溫度為65℃。

圖3 萃取溫度對萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate

經過對影響萃取效果的3個因素的試驗，最終選擇萃取劑濃度為30%甲醇溶液，萃取時間為60 min，萃取溫度為65℃。

2.2 液相色譜條件的選擇

2.2.1 流動相的選擇

圖4 不同濃度流動相對應砷形態(tài)的相對峰面積Fig.4 Relative peak area of arsenic species in different mobile phases

2.2.2 色譜柱的選擇

試驗使用了3種反相C18色譜柱進行測試，規(guī)格為250 mm×4.60 mm，5 μm。試驗結果表明（1）組分分離情況不好；（2）柱效好，分離時間短；（3）分離效果好，價格便宜，能滿足實際需要。從實用性和性價比考慮，最終選擇（3）作為試驗色譜柱。

2.3 原子熒光工作條件的選擇

2.3.1 光電倍增管負高壓和燈電流的選擇

增大光電倍增管負高壓可提高熒光強度，但噪聲也相應增大，當負高壓增大到一定程度時，信噪比反而開始下降。試驗考察了負高壓為300、310、320、330、340 V時的各砷形態(tài)信噪比，如表1。結果表明當負高壓為320 V時，各砷形態(tài)信噪比最高。

表1 負高壓對砷形態(tài)信噪比的影響Table 1 Effect of negative high voltage on signal-to-noise ratio of arsenic species

2.3.2 燈電流的選擇

增大空心陰極燈的燈電流，熒光強度也隨著增強，但是當燈電流過大時會發(fā)生自吸現(xiàn)象，此時熒光強度反而減弱，并且過大的燈電流會縮短燈的使用壽命。試驗考察燈電流為80、90、100、110、120 mA時的熒光強度，結果表明當燈電流為100 mA時，熒光強度最高。

我國對于企業(yè)財務風險管理的研究起步較晚，最早開始于19世紀八十年代左右。最早開始研究財務風險的學者是劉恩祿，初版的刊物《論財務風險管理》首次闡明財務風險存在的特性和管理上的重難點，以及管控財務風險對于企業(yè)經營的重要意義。之后，許多學者開始重視企業(yè)的財務風險管理，先后出版了許多關于財務管理的論著。1998年開始，隨著中國保險行業(yè)的興起，學者的注意力開始轉向保險企業(yè)，主流觀點包括：我國保險行業(yè)處于逐步成長過程中，相關的風險管理體制還尚未完全同步；中國保險企存在償付能力不足的問題，并且保險行業(yè)缺乏一定的市場競爭力，等等。

2.3.3 載氣流速的選擇

載氣在氫化反應過程中起著將氫化物帶入到原子化器中和提供氬氫火焰燃燒需要的氬氣的作用。當載氣流量較小時，形成的氬氫火焰不夠穩(wěn)定，導致測量的重現(xiàn)性不好。當載氣流量增大到一定程度時又會沖淡稀釋氫化物，導致熒光強度降低，過大的載氣流量甚至會沖斷氬氫火焰，導致測量不到熒光信號。試驗考察了載氣流速為200 mL/min～600 mL/min時對熒光強度的影響，結果見圖5，可知，當載氣流速為400 mL/min的時候，熒光強度最高。因此，試驗選擇400 mL/min的載氣流速。

圖5 載氣流量對砷形態(tài)熒光信號強度的影響Fig.5 Effect of carrier gas flow on fluorescence signal intensity of arsenic species

2.3.4 屏蔽氣流速的選擇

屏蔽氣作為氬氫火焰的外圍保護氣體，能夠防止周圍空氣將原子蒸汽氧化，從而使氬氫火焰保持穩(wěn)定狀態(tài)。試驗考察屏蔽氣流速為750、850、950、1 050、1 150 mL/min時對熒光強度的影響，結果見圖6。

圖6 屏蔽氣流量對砷形態(tài)熒光信號強度的影響Fig.6 Effect of shield gas flow rate on fluorescence signal intensity of arsenic species

由圖6表明，當屏蔽氣流量達到950 mL/min時，熒光強度最高。因此，試驗選擇屏蔽氣的最佳流速為950 mL/min。

2.3.5 硼氫化鉀質量濃度的選擇

當硼氫化鉀濃度較低時，氫化反應不完全，而當硼氫化鉀濃度過高時產生了過多的氫氣，導致樣品的氫化物濃度被稀釋，靈敏度下降。試驗考察了硼氫化鉀質量濃度在5.0 g/L～30.0 g/L范圍內對0.2 mg/kg混合標準溶液熒光強度的影響，結果見圖7。從圖7可以看出，當達到20.0 g/L時，熒光強度最大。之后隨著硼氫化鉀濃度再升高，熒光強度開始降低。試驗選擇硼氫化鉀溶液的濃度為20.0 g/L。

圖7 硼氫化鉀濃度對砷形態(tài)氫化物發(fā)生的影響Fig.7 Effect of KBH4concentration on arsenic hydride formation

2.4 檢出限、線性范圍及線性關系

在優(yōu)化條件下，以峰面積對濃度作圖，得到阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷的線性范圍、相關系數(shù)、線性方程及檢出限見表2。

表2 阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷的線性范圍、線性方程和相關系數(shù)Table 2 The linear range，linear equation and correlation coefficient of ASA，ROX and NIT

在所測定的濃度范圍內，3種有機砷形態(tài)化合物的線性相關系數(shù)均大于0.999。

2.5 加標回收率

在雞蛋樣品添加不同濃度的阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷，通過MAE-LC-AFS的分析結果見表3。由表3可知，阿散酸的加標回收率在80.5%～91.0%之間，硝苯砷酸的加標回收率在81.0%～91.1%之間，洛克沙砷的加標回收率在82.5%～104.9%之間，阿散酸的相對標準偏差小于7.52%。

3 結論

采用微波輔助萃取（Microwave Assisted Extraction，MAE）的前處理方法，液相色譜-原子熒光（Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry，LCAFS）聯(lián)用技術測定雞蛋中阿散酸、洛克沙砷和硝苯砷酸3種有機砷形態(tài)，阿散酸在0.1、0.2、0.5 mg/kg 3個加標水平下的平均回收率為80.5%～91.0%，相對標準偏差為3.14%～3.77%；硝苯砷酸和洛克沙砷在0.2、0.5、2mg/kg，3個加標水平下平均回收率為81.0%～91.1%和82.5%～104.9%，相對標準偏差為2.72%～4.02%和1.81%～7.52%。本方法操作簡單快速、檢出限低、重現(xiàn)性好，是一種適用于雞蛋中砷形態(tài)檢測的有效方法。

表3 阿散酸、洛克沙砷和硝苯砷酸回收率和相對標準偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviation of ASA，ROX and NIT

[1]Xueping Liu,Wenfeng Zhang,Yuanan Hu,et al.Arsenicpollution of agricultural soils by concentrated animal feeding operations(CAFOs) [J].Chemosphere,2015,119(1)：273-281

[2]劉英俊,朱曉華,蘭方菲,等.飼料中的砷制劑和氟化物對畜禽的作用及其對環(huán)境的影響[J].畜牧與獸醫(yī),2013,45(2)：87-90

[3]唐志剛,溫超,周巖民.動物源性食品重金屬污染現(xiàn)狀及其飼料控制技術[J].糧食與飼料工業(yè),2012,12(5)：42-44,48

[4]季偉.一種檢測飼料中無機砷含量的方法[J].中外食品工業(yè),2015 (8)：58

[5]賴亮陽,華永標,黃冬蘭,等.微波消解-ICP-AES法測定飼料中的鉛、鉻和砷[J].廣東化工,2016,43(1)：124-125

[6]杜英秋.AFS法和ICP-MS法測定飼料中砷和汞的比較[J].糧食與飼料工業(yè),2015(5)：62-64

[7]肖亞兵,高健會,曾宇,等.HPLC-ICP-MS法對動物源性食品中阿散酸、硝苯砷酸與洛克沙砷殘留量的同時測定[J].分析測試學報,2008,27(11)：1206-1209

[8]郭同兵,黃謙,劉劍波.微波消解氫化物原子熒光法測定食品中的砷和汞[J].食品與機械,2011,27(4)：87-89,108

[9]趙國品,魏永義,張莉.午餐肉罐頭中砷含量的測定[J].肉類工業(yè), 2011(12)：23-24

[10]姚煥英,祝保林.氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定淡水魚中砷和汞[J].光譜實驗室,2009,26(3)：499-503

[11]駱斌,胡星云.劉金娥,等.氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法同時測定環(huán)境水中的砷和汞的研究[J].西南民族大學學學報(自然科學版）,2009,35(2)：319-322

[12]李俊玲,徐燕,王家保.保健食品中鉛、砷、汞微波消解前處理方法的研究[J].職業(yè)與健康,2005,21(9)：1317-1319

[13]張磊,王曉艷,李波.微波消解技術在金屬分析中的應用[J].光譜實驗室,2010,27(3)：953-957

[14]聶容春,羅樂,徐初陽,等.不同消解方法對定量研究樣品中有毒有害元素的影響[J].現(xiàn)代化工,2012,32(8)：112-115

Determination of Arsanilic，Nitarsone and Roxarsone in Eggs by MAE-LC-AFS

JIANG Tao1，2，CUI Ying2，NI Song2
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300461，China；2.Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

A method for determination of arsanilic（ASA），nitarsone（NIT）and roxarsone（ROX）residues in eggs was developed by Microwave Assisted Extraction-Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry（MAE-LC-AFS）.The working conditions of liquid chromatography and atomic fluorescence were studied and optimized.The linearity of arsanilic，nitarsone and roxarsone in the range of 0-2.0 mg/L was good，linear correlation coefficient was greater than 0.999.The detection limits of ASA，NIT and ROX were 0.1，0.2，0.2 mg/kg，respectively.The average recoveries of arsanilic were 80.5%-91.0%at the levels of 0.1，0.2，0.5 mg/kg，RSDs were 3.14%-3.77%.The average recoveries of nitarsone and roxarsone were 81.0%-91.1%and 82.5%-104.9%at the levels of 0.2，0.5，2.0 mg/kg，RSDs were 2.72%-4.02%and 1.81%-7.52%.

Microwave Assisted Extraction（MAE）；Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry（LCAFS）；eggs；arsanilic（ASA）；nitarsone（NIT）；roxarsone（ROX）

2016-11-18

姜濤（1987—），男（漢），助理農藝師，本科，主要從事食品檢測。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.035