范宏

（承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河北承德067000）

LC-MS/MS 法測(cè)定豬肉中泰妙菌素及8-α-羥基泰妙菌素

范宏

（承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河北承德067000）

采用磷酸緩沖液-乙酸乙酯混合提取、正己烷除脂、MCX柱凈化，采用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）建立了同時(shí)測(cè)定豬肉中泰妙菌素及8-α-羥基泰妙菌素殘留量的分析方法。結(jié)果表明：在泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素加標(biāo)濃度5.0 μg/kg～500.0 μg/kg范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8和0.999 7，線性關(guān)系良好；檢測(cè)限（LOD）分別為1.5 μg/kg和3.0 μg/kg，定量限（LOQ）分別為5.0 μg/kg和10.0 μg/kg；平均回收率為83.4%～97.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.4%～5.3%。

泰妙菌素；8-α-羥基泰妙菌素；液相色譜-質(zhì)譜法；豬肉

泰妙菌素（pleuromulin），又稱泰妙霉素、泰妙靈，分子式為C28H47NO4S，CAS號(hào)為55297-95-5，是一種雙萜烯類畜禽專用抗生素[1-2]，其抗菌譜與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素相近，用于畜禽呼吸道疾病及支原體關(guān)節(jié)炎等疾病的防治，目前是被全球廣泛應(yīng)用的主要獸用抗生素[2-4]。低劑量的泰妙霉素可提高飼料利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，但過(guò)量使用可導(dǎo)致泰妙霉素在體內(nèi)殘留或蓄積，并可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康。美國(guó)、歐盟、日本都明確規(guī)定了泰妙菌素最高殘留限量（MRL），我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)規(guī)定了泰妙菌素及其代謝產(chǎn)物8-α-羥基泰妙菌素的總量，在豬體內(nèi)組織最高殘留限量：肌肉100 μg/kg，肝臟500 μg/kg[5]。但目前缺乏關(guān)于8-α-羥基泰妙菌素的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。

當(dāng)前關(guān)于泰妙菌素的檢測(cè)方法主要有微生物法[3]、氣相色譜法（GC）[2]、液相色譜法（HPLC）[6-7]、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[8-11]，其中微生物法前處理繁瑣，準(zhǔn)確度差；GC需要衍生化，操作復(fù)雜，精密度差；HPLC盡管儀器普及面廣、定量準(zhǔn)確，但是檢出限高，無(wú)法用于低濃度獸藥殘留檢測(cè)；LC-MS/MS具有檢出限低，選擇性高、靈敏度強(qiáng)等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用。本文采用磷酸緩沖液-乙酸乙酯混合提取、正己烷除脂、MCX柱凈化，采用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定豬肉中泰妙菌素及8-α-羥基泰妙菌素殘留量，該方法檢出限低，精密度好，準(zhǔn)確度高，可用于進(jìn)出口豬肉中泰妙菌素及其代謝產(chǎn)物8-α-羥基泰妙菌素殘留量檢驗(yàn)檢測(cè)的要求，并為畜禽食品中泰妙菌素殘留量檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的制修訂提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑材料

Waters Acquity UPLC XEVO TQ MS型超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀：沃特世科技（上海）有限公司；Maxi Mix II型漩渦震蕩器：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；XT-NS 1型全自動(dòng)氮吹濃縮儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；Milli-Q REFERENCE型超純水系統(tǒng)：密理博中國(guó)有限公司；R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琦有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥99%)：瑞士CARBOGEN AMCIS AG公司；8-α-羥基泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥99%）：山德士（中國(guó)）制藥有限公司；甲醇、丙酮、正己烷、甲酸（均為色譜純)：默克投資（中國(guó)）有限公司；濃鹽酸、二氯甲烷、氫氧化鈉（均為分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 溶液配制

分別稱取泰妙菌素、8-α-羥基泰妙菌素各100.0mg（精確至0.1 mg），用適量甲醇溶解后，置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻線，配制成各目標(biāo)物濃度為2.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-20℃避光保存。分別吸取適量泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，先用甲醇配制成各目標(biāo)物濃度為100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用20%甲醇溶液逐級(jí)稀釋配制濃度為5、10、50、100、200 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃避光保存。

磷酸緩沖液（pH=8.0)：稱取0.52 g KH2PO4，16.73 g K2HPO4，以三蒸水定容至500 mL。磷酸緩沖液（pH= 4.5)：在磷酸緩沖液（pH=8.0）中滴加磷酸使其pH值為4.5。

1.3 LC-MS/MS

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100mm，1.7μm）；柱溫為35℃；流動(dòng)相A為純甲醇；流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液；流速：0.2 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。梯度洗脫程序?yàn)?.0 min～0.1 min，20% A；0.1 min～3.5 min，90%A；3.5 min～4.5 min，20%A；4.5 min～5.0 min，20%A。

質(zhì)譜條件：電離方式為電噴霧電離，正離子模式ESI（+）；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源溫度為150℃；脫溶劑氣為氮?dú)?，氣?.5L/min，溫度350℃；錐孔氣為氮?dú)?，氣?.0 L/min；碰撞氣為氬氣；其它質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g樣品（精確至0.1 mg），加入5 mL磷酸緩沖液（pH=8.0），勻漿后置于50 mL離心管中，加入20 mL乙酸乙酯超聲提取20 min，以6 000 r/min離心10 min，收集有機(jī)相。再用20 mL乙酸乙酯超聲提取2次，合并有機(jī)相后，旋轉(zhuǎn)蒸干，加入5 mL磷酸緩沖液（pH=4.5）溶解殘?jiān)偌尤? mL正己烷渦旋振蕩去脂，8 000 r/min離心5 min，取下層提取液經(jīng)MCX固相萃取柱凈化，5 mL甲醇洗脫，45℃氮?dú)獯蹈珊? mL甲醇定容、溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，供LC-MS/ MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，考察0.1%甲酸水-乙腈，0.1%甲酸水-甲醇，5 moL/L乙酸銨（含0.1%甲酸）-甲醇，5 moL/ L乙酸銨（含0.1%甲酸）-乙腈等不同流動(dòng)相對(duì)泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的分離效果。結(jié)果顯示：以0.1%甲酸水-甲醇作為流動(dòng)相，經(jīng)梯度洗脫后，泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素與雜質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)很好的分離，峰形對(duì)稱，無(wú)拖尾和前延現(xiàn)象，響應(yīng)值高，在5 min內(nèi)全部出峰，節(jié)省了分析時(shí)間。豬肉加標(biāo)樣品中泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素MRM色譜圖見(jiàn)圖1所示。

圖1 豬肉加標(biāo)樣品中泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素MRM色譜圖Fig.1 Chromatogram of MRM of pleuromulin and 8-α-hydroxypleuromulin

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)目標(biāo)化合物泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的結(jié)構(gòu)特征，確定加合H+形成帶正電荷的母離子[M+H]+，因此選用ESI+為離子化模式，配制1 μg/mL的泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用流動(dòng)注射泵進(jìn)樣，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，確定準(zhǔn)分子離子峰。同時(shí)對(duì)離子源溫度、干燥氣溫度、霧化器壓力等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并以準(zhǔn)分子離子采用MRM監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，優(yōu)化碰撞能量，選擇兩個(gè)信噪比較高的特征子離子作為定量、定性離子對(duì)。結(jié)果顯示：泰妙菌素的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z 494.3，產(chǎn)生m/z 192.1、119.1的子離子；8-α-羥基泰妙菌素的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z 337.2，產(chǎn)生m/z 301.0、283.1的子離子，其具體質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 待測(cè)物部分質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of the analytes

2.3 萃取溶劑的選擇

根據(jù)相似相容原理，泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素偏弱極性，故考察了丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚等不同萃取溶劑對(duì)泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素提取效率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同萃取溶劑的提取率Fig.2 Extraction rate of different extraction solvents

從圖2中可知：按照泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素提取率高低順序依次為：乙酸乙酯（92.3%）＞二氯甲烷（89.4%）＞丙酮（83.7%）＞乙醚（78.6%），其中乙酸乙酯對(duì)泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素提取率最高，提取率分別為91.5%和93.1%，平均值92.3%；雖然乙酸乙酯對(duì)泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的萃取效率最高，可仍有部分油脂被萃取到提取液中，可對(duì)LCMS/MS儀器響應(yīng)值有明顯的抑制作用，影響靈敏度，但經(jīng)正己烷脫脂后，可有效提高其檢測(cè)響應(yīng)值，從而提高LC-MS/MS檢測(cè)靈敏度。故選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑。

2.4 SPE凈化柱的選擇

通過(guò)樣品加標(biāo)試驗(yàn)，考察不同SPE凈化柱（MCX、SCX、C18、HLB、MAX、WAX）對(duì)泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的凈化效果見(jiàn)圖3。

圖3 不同凈化柱的凈化回收效果Fig.3 Purification and recovery effect of different purification column

結(jié)果表明，強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱（MCX和SCX）對(duì)泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的具有較好的凈化和濃縮作用，特別是MCX柱凈化回收率高達(dá)97.2%；弱陽(yáng)離子交換柱（HLB、C18）回收率適中；而弱陰離子交換柱（MAX和WAX）凈化回收率較差。因此，選擇MCX固相萃取柱作為凈化柱。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的分析可產(chǎn)生顯著的干擾，稱之為基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME），嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)可直接影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本文研究對(duì)象豬肉組織中基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的內(nèi)源性化合物，所以考察了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)LC-MS/MS的影響。在純甲醇溶液、空白豬肉基質(zhì)中精確加入一定量的泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低、中、高3種濃度溶液，按上述所建方法進(jìn)行測(cè)定，比較純甲醇溶液和豬肉基質(zhì)中被測(cè)組分的峰面積，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（ME）=Ap/As，其中Ap指豬肉基質(zhì)中被測(cè)組分的峰面積；As指純甲醇溶液中被測(cè)組分的峰面積；當(dāng)ME＞1表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，當(dāng)ME＜1表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；M=1表示在曲線范圍濃度內(nèi)基質(zhì)對(duì)響應(yīng)強(qiáng)度無(wú)影響。基質(zhì)效應(yīng)ME值見(jiàn)表2。

表2 基質(zhì)效應(yīng)ME值Table 2 ME value of matrix effect

從表2中可知：泰妙菌素的基質(zhì)效應(yīng)ME值在0.921～0.963，8-α-羥基泰妙菌素的基質(zhì)效應(yīng)ME值在0.923～0.984，即表明沒(méi)有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。

2.6 線性范圍與檢出限

在豬肉空白樣品中，分別加入適量的泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度依次為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、500 μg/kg的試樣，按上述所建方法進(jìn)行測(cè)定，以色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，被測(cè)組分的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)；根據(jù)6個(gè)空白豬肉樣品的基線噪音求其平均值，按信噪比（RS/N=3）計(jì)算其方法檢測(cè)限（LOD），信噪比（RS/N= 10）計(jì)算其方法定量限（LOQ）（表3）。結(jié)果說(shuō)明：泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素在加標(biāo)濃度為5.0 μg/kg～ 500.0μg/kg范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)分別為0.9998和0.9997，線性關(guān)系良好；LOD分別為1.5 μg/kg和3.0 μg/kg，LOQ分別為5.0 μg/kg和10.0 μg/kg，這說(shuō)明該方法靈敏度高，低于我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)中關(guān)于動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量要求。線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限見(jiàn)表3。

2.7 回收率與精密度

在豬肉空白樣品中分別加入線性范圍內(nèi)低、中、高3種濃度的泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次，泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）如表4所示。

表3 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限Table 3 Linear relationship，correlation coefficients，LOD and LOQ

結(jié)果表明：泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的平均回收率為83.4%～97.6%，RSD為2.4%～5.3%，符合獸藥殘留分析的準(zhǔn)確度和精密度要求。

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

隨即選取河北承德市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)銷售的各種新鮮豬肉30份，按上述所建方法進(jìn)行測(cè)定豬肉中泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素殘留量的測(cè)定。結(jié)果顯示：1份試樣中檢出含有泰妙菌素（213.8 μg/kg），陽(yáng)性檢出率為3.3%；4份試樣中檢出含有8-α-羥基泰妙菌素（56.7 μg/kg～314.2 μg/kg），陽(yáng)性檢出率為13.3%；8-α-羥基泰妙菌素陽(yáng)性檢出率高于泰妙菌素陽(yáng)性檢出率，這可能是由于部分豬肉中泰妙菌素經(jīng)新陳代謝生成8-α-羥基泰妙菌素所導(dǎo)致的。檢測(cè)結(jié)果表明豬肉中存在一定量的泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素殘留。

3 結(jié)論

本文采用磷酸緩沖液-乙酸乙酯混合提取、水飽和正己烷除脂、MCX柱凈化，采用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）法建立了同時(shí)測(cè)定豬肉中泰妙菌素及8-α-羥基泰妙菌素殘留量的分析方法。結(jié)果表明：泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素在加標(biāo)濃度為5.0 μg/kg～500.0μg/kg范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)分別為0.9998和0.9997，線性關(guān)系良好；LOD分別為1.5 μg/kg和3.0 μg/kg，LOQ分別為5.0 μg/kg和10.0 μg/kg；平均回收率為83.4%～97.6%，RSD為2.4%～5.3%，該方法檢出限低，精密度好，準(zhǔn)確度高，可用于進(jìn)出口豬肉中泰妙菌素及其代謝產(chǎn)物8-α-羥基泰妙菌素殘留量檢驗(yàn)檢測(cè)的要求，并為畜禽食品中泰妙菌素殘留量檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的制修訂提供參考。

[1]黃賀賢,曾振靈,黃顯會(huì).截短側(cè)耳素類抗生素一泰妙菌素的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志,2010,44(6)：42-45

[2]湯有志,遠(yuǎn)立國(guó),劉雅紅.截短側(cè)耳素類抗生素的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2012,48(5)：65-68

[3]黃賀賢,曾振靈,黃顯會(huì),等.泰妙菌素混懸注射液在豬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)及生物利用度研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(10)：2168-2173

[4]Rodger N,M S D.The pleuromutilin antibiotics：a new class for human use[J].Curr Opin Investig Drugs,2010,11(2)：182-191

[5]葉妮,尹暉,王亦琳,等.動(dòng)物性食品中泰妙菌素殘留標(biāo)志物檢測(cè)UPLC-MS/MS法研究[J].中國(guó)獸藥雜志,2016,50(11)：49-53

[6]程林麗,張素霞,沈建忠,等.高效液相色譜法快速檢測(cè)豬組織中泰妙菌素殘留[J].分析化學(xué),2009,37(5)：718-720

[7]張駿豪,譚艾娟,呂世明,等.HPLC法同時(shí)檢測(cè)豬肉中泰樂(lè)菌素和泰妙菌素[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2011,30(1)：87-90

[8]黃雅麗.固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定禽畜和水產(chǎn)品中沃尼妙林和泰妙菌素[J].分析試驗(yàn)室,2010,29(1)：103-106

[9]Siegrid De Baere,Mathias Devreese,An Maes,et al.Quantification of 8-α-hydroxy-mutilin as marker residue for tiamulin in rabbit tissues by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2015,407(15)：4437-4445

[10]耿士偉,朱志謙,曲斌,等.高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中泰妙菌素殘留的研究[J].中國(guó)家禽,2012,34(11)：28-33

[11]劉曉茂,李學(xué)民,葛娜,等.超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定肉類中沃尼妙林和泰妙菌素的殘留量[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38 (8)：182-186

Determination of the Content of Pleuromulin and 8-α-hydroxy-pleuromulin in Pork by LC-MS/MS

FAN Hong
（Chengde Nursing Career Academy，Chengde 067000，Hebei，China）

Extracting by using phosphate buffer and ethyl acetate mixed，and degreasing by n-hexane，and purifying by MCX column，the method was established for determination of the content of pleuromulin and 8-αhydroxy-pleuromulin in pork by liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）.The results showed that the correlation coefficients of pleuromulin and 8-α-hydroxy-pleuromulin were 0.999 8 and 0.999 7 in spiked concentration from 5.0 μg/kg to 500.0 μg/kg，and they had good linear relationsh.The limit of detection（LOD）were 1.5 μg/kg and 3.0 μg/kg，and the limit of quantification（LOQ）were 5.0 μg/kg and 10.0 μg/kg；the average recovery rate were from 83.4%to 97.6%，and relative standard deviations（RSD）were from 2.4%to 5.3%.

pleuromulin；8-α-hydroxy-pleuromulin；liquid chromatography mass spectrometry；pork

2016-11-16

范宏（1976—），女（漢），副教授，碩士，主要從事化學(xué)教學(xué)及研究工作。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.031