張琳，陳俊華，王小雪，馬明蘭，譚珺雋，劉陽(yáng)

（武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430223）

南瓜糖蛋白的分離純化及其糖鏈結(jié)構(gòu)鑒定

張琳，陳俊華，王小雪，馬明蘭，譚珺雋，劉陽(yáng)*

（武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430223）

采用水提醇沉法從南瓜粉中提取南瓜糖蛋白，分別用硫酸銨、乙醇分級(jí)沉淀及瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)南瓜糖蛋白進(jìn)行分離純化，定性檢測(cè)后用堿性β-消除反應(yīng)及核磁共振氫譜（Proton Nuclear Magnetic Resonance，1H NMR）、核磁共振碳譜（Carbon 13Nuclear Magnetic Resonance，13C NMR）技術(shù)測(cè)定糖肽鍵的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：純化后的糖蛋白不含游離還原糖和淀粉，其在紫外240 nm附近南瓜糖蛋白堿水解液吸光度值發(fā)生了明顯的變化，證明南瓜糖蛋白的糖肽鍵主要為O-糖肽鍵；其多糖的1H NMR和13C NMR譜圖表明，該多糖組分的單糖殘基中包含α-和β-兩種糖苷鍵類型，且南瓜多糖主要含有3種端基碳分別為→4）-α-D-半乳糖-（1→、T-α-D-半乳糖-（1→和→2）-α-L-鼠李糖-（1→，在175.57和171.25處的共振吸收峰說(shuō)明多糖中含有糖醛酸和脂類結(jié)構(gòu)。

南瓜；糖蛋白；瓊脂糖凝膠電泳；核磁共振

南瓜Cucurbita moschata（Duch.ex Lam.）Duch.ex Poiret）為葫蘆科南瓜屬植物。南瓜作為藥食兩用佳品，一直以來(lái)在臨床上都是治療糖尿病人的首選輔助食物[1]。根據(jù)臨床實(shí)踐證實(shí)，南瓜中的南瓜多糖是防治糖尿病的活性成分，它直接參與了降血糖、調(diào)血脂等相關(guān)活動(dòng)[2]。熊學(xué)敏等[3]分析了南瓜多糖降血糖作用的機(jī)理，南瓜多糖可能是以糖蛋白的形式存在，并含有豐富的多種氨基酸，可刺激胰島素分泌，產(chǎn)生降糖效果。糖蛋白是一類有糖類同多肽或蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵連接而成的結(jié)合蛋白，其結(jié)構(gòu)中含有肽鏈、糖肽鍵和糖鏈，具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、降低血糖、血酯、抗氧化、防衰老等作用，在保健食品及新藥開(kāi)發(fā)方面具有較大的應(yīng)用價(jià)值[4-5]。但是，到目前為止，有關(guān)南瓜糖蛋白的分離純化及其結(jié)構(gòu)研究罕見(jiàn)報(bào)道。對(duì)南瓜粉中糖蛋白進(jìn)行了提取分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定研究，以期為后續(xù)南瓜糖蛋白降血糖作用的深入研究乃至產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

南瓜粉：江蘇頂能食物有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水乙醇、偏重亞硫酸鈉、活性炭、硫酸銨、蔗糖：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醚、鹽酸高碘酸、氯仿：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖：武漢市華順生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（D2500-50）：北京索萊寶生物科技有限公司。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、RE-201C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PHSJ-4A雷磁實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；JY96-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；UPT-11-10T優(yōu)普系列超純水器：成都超純科技有限公司；BS 224 S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；J-26XP Beckman高速冷凍離心機(jī)：貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司；EPS-300穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：上海天能科技有限公司；Bruker Avence300/600核磁共振儀：布魯克（北京）科技有限公司；透析袋（分子截留量3000）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 南瓜糖蛋白的提取

稱取180 g南瓜粉加入300 mL無(wú)水乙醚40℃水浴回流2 h，過(guò)濾，待殘?jiān)械囊颐褤]發(fā)后加1∶16的0.1 mol/L NaCl溶液，用磁力攪拌器攪拌均勻，再調(diào)節(jié)pH值為8.5，然后在60℃下超聲輔助浸提50 min，浸提液于5 000 r/min離心10 min，取上清液（顏色為淡黃色）加入少量活性炭進(jìn)行脫色，過(guò)濾得提取液并進(jìn)行減壓濃縮，調(diào)節(jié)pH值到南瓜粉蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pH= 4.2），再將其置4℃冰箱過(guò)夜，抽濾得沉淀，將其用無(wú)水乙醚洗滌3次[6]，即得粗品糖蛋白33.14 g。

1.2.2 南瓜糖蛋白的純化

1.2.2.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

取步驟1.2.1所得南瓜糖蛋白粗品30 g，溶于蒸餾水，配成5 g/100 mL溶液，過(guò)濾去除不溶物。濾液不斷攪拌下緩慢加入硫酸銨至其濃度為35%，攪拌均勻。4℃冰箱靜置12 h，5 000 r/min離心10 min，取上清液繼續(xù)在攪拌條件下加硫酸銨至其濃度達(dá)75%，攪拌均勻。4℃冰箱靜置過(guò)夜，離心得沉淀。

1.2.2.2 乙醇的分級(jí)沉淀

將步驟1.2.2.1所得沉淀全部溶解在蒸餾水中，配成溶液。在溶液中緩慢加入95%的乙醇至其濃度為45%，4℃冰箱靜置12 h，5 000 r/min離心10 min得沉淀，45℃下干燥。得糖蛋白精品0.53 g。

1.2.3 南瓜糖蛋白的定性檢測(cè)

采用碘－碘化鉀反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)、十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，CTAB）反應(yīng)、斐林試劑檢測(cè)對(duì)以上純化所得精品糖蛋白（CMII）進(jìn)行定性測(cè)定[7]。

1.2.4 南瓜糖蛋白的糖肽鍵的測(cè)定

稱取純化所獲取的精品糖蛋白（CMII）0.5 g，配制成溶液，并經(jīng)0.2 mol/L NaOH溶液2 h水解處理，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得處理前和堿處理2.0 h后240 nm處吸光值。

1.2.5 南瓜糖蛋白的糖鏈的釋放和脫蛋白質(zhì)（肽鏈）

將蛋白堿水解樣品與氯仿和正丁醇混勻，體積比為25∶4∶1，劇烈振蕩20 min，5 000 r/min離心15 min，分為3層，由上到下為水層、蛋白層、有機(jī)層。取水層，按體積比為1∶9加入95%的乙醇，4℃冰箱靜置12 h，離心得沉淀，加水溶解，用截留分子量為3000的透析袋去離子水中透析1 d，冷凍干燥得南瓜多糖（CMIII）0.132 g。

1.2.6 南瓜糖蛋白的糖鏈的純化

1.2.6.1 南瓜糖蛋白（CMIII）糖鏈在電泳上定位

采用瓊脂糖凝膠電泳，用pH=9.4的硼砂-NaOH的緩沖系統(tǒng)，電極緩沖液電壓為50 V，電泳后割膠，于搖床（轉(zhuǎn)速為85 r/min）上用高碘酸-Schiff試劑（PAS）染色，定位。首先用10%三氯乙酸（Trichloroacetic Acid，TCA）處理10 min，固定多糖的位置，蒸餾水反復(fù)洗3次后，加1%高碘酸進(jìn)行氧化處理15 min，蒸餾水反復(fù)洗3次，接著加Schiff試劑進(jìn)行室溫避光染色30 min，用0.5%新配偏重亞硫酸鈉洗膠3次（5 min/次），置于7%的醋酸溶液中保存，觀察染色結(jié)果并且測(cè)定位移距離。（Schiff試劑的配制：稱取1 g堿性品紅，在200 mL沸水中溶解5 min，冷卻至40℃～50℃，加入1.37 g偏重亞硫酸鈉和20 mL 1 mo1/L HCl，冷卻至室溫，加入2匙活性炭攪拌直到溶液變成無(wú)色透明為止，過(guò)濾，4℃冰箱避光保存。）

1.2.6.2 電泳樣品的回收

重復(fù)步驟1.2.6.1多次，在定位點(diǎn)進(jìn)行割膠，用D2500-50試劑盒集中進(jìn)行樣品的回收，得樣品（CMIV）。

1.2.7 南瓜多糖的核磁共振檢測(cè)

樣品（CMIV）溶解在D2O中形成濃度大約為30 mg/mL的溶液。所有的NMR試驗(yàn)都是在Bruker Avence300/600譜儀用5 mm[H-C-N]三共振探頭測(cè)得。測(cè)試溫度為室溫25℃，所有脈沖前的弛豫等待時(shí)間為1.5 s，用DSS作為內(nèi)標(biāo)，測(cè)得樣品1H NMR和13C NMR譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 南瓜糖蛋白的定性檢測(cè)

南瓜糖蛋白CMII的定性測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 南瓜糖蛋白的定性檢測(cè)Table 1 Qualitative detection of glycoprotein from pumpkin

由表1可知，雙縮脲反應(yīng)呈陽(yáng)性表明所得南瓜糖蛋白（CMII）中含有蛋白質(zhì)；CTAB反應(yīng)呈陽(yáng)性表明含有酸性多糖；而斐林試劑檢測(cè)顯示樣品中不含游離多糖，碘-碘化鉀反應(yīng)呈陰性表明該糖蛋白制品中不含淀粉。綜合檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，試驗(yàn)所得南瓜糖蛋白不含游離還原糖和淀粉，而為較純的酸性糖蛋白。

2.2 南瓜糖蛋白的糖肽鍵的確定

將試驗(yàn)所得南瓜糖蛋白（CMII）0.53 g，配制成溶液，經(jīng)NaOH溶液水解處理，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得處理前和堿處理2.0 h后240 nm處吸光值，結(jié)果如表2。

能夠構(gòu)成O-糖肽鍵的氨基酸經(jīng)過(guò)堿處理后在240 nm處存在特征吸收，由表2可知南瓜糖蛋白（CMII）水溶液經(jīng)NaOH溶液處理后，在240 nm附近吸光度值發(fā)生了明顯的變化，說(shuō)明南瓜糖蛋白（CMII）中糖和蛋白是通過(guò)O-糖肽鍵連接的[8]。

表2 南瓜糖蛋白水解液紫外吸光值Table 2 The UV absorbance values of hydrolyzed glycoprotein from pumpkin

2.3 南瓜糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的NMR測(cè)定

南瓜多糖的1H NMR譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 南瓜多糖（CMIV）的1H NMR譜圖Fig.1 The1H NMR spectrum of pumpkin polysaccharide（CMIV）

在1H NMR圖中，以DSS為基準(zhǔn)物的基準(zhǔn)峰化學(xué)位移在1.5左右，多糖的化學(xué)位移主要在δ 4.0～5.5范圍之間。其中糖端基H信號(hào)集中在δ 4.8～5.5（2號(hào)峰）范圍內(nèi)，H2～H6上的質(zhì)子信號(hào)主要在δ 4.0～4.8（1號(hào)峰）范圍內(nèi)。往往可以通過(guò)1H NMR譜圖判定多糖殘基構(gòu)型[9]。通常來(lái)講H1上的質(zhì)子δ大于5.0為α型吡喃糖，而在H1上的質(zhì)子δ小于5.0的是β型吡喃糖[10]。從圖1中可以看出，南瓜多糖在H1質(zhì)子信號(hào)區(qū)總共有4個(gè)吸收峰依次為4.86、5.08、5.32和5.50，說(shuō)明該多糖組分的單糖殘基中同時(shí)含α-和β-兩種糖肽鍵的結(jié)構(gòu)類型[12]。

南瓜多糖的13C NMR譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 南瓜多糖（CMIV）的13C NMR譜圖Fig.2 The13C NMR spectrum of pumpkin polysaccharide（CMIV）

在13C NMR圖中，以DSS為基準(zhǔn)物的基準(zhǔn)峰在化學(xué)位移在18左右，多糖的端基碳出峰主要集中在100處。從圖2中可以看出，南瓜多糖端基碳C1的共振峰分別為99.4、99.7和100.4（3號(hào)峰），說(shuō)明該組分主要含有3種單糖[12]，C2～C6的信號(hào)主要集中于δ68.58～79.15（2號(hào)峰）。通過(guò)文獻(xiàn)查詢，在171.3和175.6處的吸收峰分別是酯化的半乳糖醛酸的C=O和未酯化的C=O[13]（4號(hào)峰）。另查文獻(xiàn)可知，圖中100.4處C1吸收峰可能是T-α-D-半乳糖-（1→結(jié)構(gòu)；而99.7處的C1吸收峰可能是→4）-α-D-半乳糖-（1[14]；果膠主鏈中的常見(jiàn)重復(fù)單元有→4）-α-D-半乳糖-（1→2）-α-L-鼠李糖-（1→結(jié)構(gòu)，99.4處C1吸收峰可能是這個(gè)結(jié)構(gòu)中的→2）-α-L-鼠李糖-（1→。13C譜圖中的53.3吸收峰（1號(hào)峰）為酯化半乳糖醛酸中甲酯的特征吸收峰[15]。由于南瓜多糖的糖醛酸含量比較高，植物中的酸性多糖多為果膠類似物，所以結(jié)合多糖1H NMR和13C NMR推測(cè)南瓜多糖的結(jié)構(gòu)也為果膠類似結(jié)構(gòu)[16]。

3 結(jié)論

本文采用水提醇沉法和硫酸銨分級(jí)沉淀、Sevage法脫蛋白及瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)南瓜糖蛋白進(jìn)行分離純化，得到精品糖蛋白（CMII），通過(guò)定性檢測(cè)，所得樣品不含游離還原糖和淀粉，而為較純的酸性糖蛋白。在240 nm紫外光附近南瓜糖蛋白的堿水解液吸光度值發(fā)生了明顯的變化，南瓜糖蛋白的糖肽鍵主要為O-糖肽鍵。南瓜多糖的1H NMR和13C NMR譜圖表明，該多糖組分的單糖殘基中包含α-和β-兩種糖苷鍵類型。且南瓜多糖主要含有3種端基碳，這3種端基碳的類型歸屬于→4）-α-D-半乳糖-（1→、T-α-D-半乳糖-（1→和→2）-α-L-鼠李糖-（1→。在175.6和171.3處的共振吸收峰說(shuō)明多糖中含有糖醛酸和脂類結(jié)構(gòu)。

4 討論

糖蛋白結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法較多，主要有層析法、紅外光譜法、質(zhì)譜法、氣相色譜法等。這些方法手續(xù)復(fù)雜，樣品用量多，因而受到一定限制。采用快原子轟擊和碰撞活化質(zhì)譜法可推測(cè)糖基連接序列，但是不能確定各糖基或糖基與甙元相連接的位置；用紅外光譜法測(cè)定糖鏈的苷鍵結(jié)構(gòu)時(shí)，必須與質(zhì)譜法聯(lián)用。因此本文采用核磁共振法檢測(cè)其糖鏈結(jié)構(gòu)。此法不需要對(duì)樣品進(jìn)行化學(xué)降解或衍生化，操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確，且不需要其它對(duì)照品能夠直接測(cè)定糖的連接順序和連接位置，結(jié)果可靠；另外，天然產(chǎn)物的產(chǎn)率較低，核磁共振儀的檢出限較其他波譜分析儀器高，因此核磁共振廣泛用于天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)解析。本文采用核磁共振法對(duì)南瓜糖蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)分析，準(zhǔn)確測(cè)定其糖肽鍵、苷鍵以及糖鏈結(jié)構(gòu)，旨在為后續(xù)南瓜糖蛋白降血糖作用的深入研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

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Separation，Purification and Sugar Chain Structural Identification of Pumpkin Glycoproteins

ZHANG Lin，CHEN Jun-hua，WANG Xiao-xue，MA Ming-lan，TAN Jun-jun，LIU Yang*
（School of Life Science，Wuchang University of Technology，Wuhan 430223，Hubei，China）

Pumpkin glycoproteins were extracted from pumpkin powder with water extraction and alcohol precipitation.The pumpkin glycoproteins were separated and purified in sequence with ammonium sulfate and ethanol precipitation and agarose gel electrophoresis.After qualitative investigation and alkaline β-elimination reaction，1H NMR and13C NMR were adopted to measure the structure of glycopeptide linkage.The experiments showed that：the purified glycoprotein did not contain the free reducing sugar and starch.In the spectrum near UV 240 nm，there was a significant change in the absorbance of the hydrolysate of the pumpkin glycoprotein，which proved that the glycopeptide linkage was mainly O-glycopeptide.Meanwhile，the1H NMR and13C NMR spectrogram of its polysaccharide showed that the monosaccharide residue of the polysaccharide contained both α-and β-glycoside bond types，while polysaccharides mainly contained three anomeric carbon which were→4）-α-D-GalpA-（1→，T-α-D-Galp-（1→and→2）-α-L-Rhap-（1→，at175.57 and 171.25，the resonance-absorption peak indicates the polysaccharides contains uronic acid and lipid structure.

pumpkin；glycoprotein；agarose gel electrophoresis；nuclear magnetic resonance（NMR）

2016-11-24

張琳（1986—），女（漢），助教，碩士，研究方向：天然藥物生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)。

*通信作者：劉陽(yáng)，女，副教授，研究方向：天然藥物生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.014