胡慧 韋偉 易辛 馮瑰麗

·論著·

信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3在乳腺癌中的表達(dá)及其與人基質(zhì)金屬蛋白酶2、9的關(guān)系研究

胡慧 韋偉 易辛 馮瑰麗

目的 觀察乳腺癌組織中信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的表達(dá)，分析其與患者臨床特征的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法(EnVision)檢測(cè)23例乳腺癌患者癌組織中STAT3、白細(xì)胞介素-6(interleukin，IL-6)、人基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9的表達(dá)情況，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 浸潤(rùn)性癌組織中STAT3表達(dá)高于非浸潤(rùn)性癌。23例乳腺癌組織中IL-6表達(dá)陽(yáng)性11例，陽(yáng)性率47.83%；MMP-2陽(yáng)性10例，陽(yáng)性率43.48%；MMP-9陽(yáng)性9例，陽(yáng)性率39.13%；STAT3陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)型乳腺癌有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=7.738，P<0.05)，兩者呈正相關(guān)(r=0.161，P<0.05)；STAT3陽(yáng)性表達(dá)與IL-6陽(yáng)性表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.032，P>0.05)，與MMP-9(r=0.537，P<0.05)和MMP-2(r=0.649，P<0.05)陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論 STAT3與乳腺癌的浸潤(rùn)侵襲有關(guān)，其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)控制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

乳腺癌； 信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3； 侵襲； 基質(zhì)金屬蛋白酶-9； 基質(zhì)金屬蛋白酶-2

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率均居女性癌癥第1位，手術(shù)、放化療及靶向治療與內(nèi)分泌治療是目前臨床最有效的治療手段[1-2]，但仍有近17.0%的乳腺癌患者死于乳腺癌轉(zhuǎn)移[3-4]。腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為，在腫瘤組織中存在一小部分具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，并且生長(zhǎng)不受控制。術(shù)后殘留的靜止期癌細(xì)胞可能為腫瘤干細(xì)胞，成了復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。研究表明，乳腺癌干細(xì)胞自我更新和增殖與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)有密切關(guān)系[5]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)的破壞在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，而基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)(matrix metalloproteinases，MMPs)是參與破壞細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白酶類(lèi)，特別是MMP-2和MMP-9，與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[6-7]。我們對(duì)23例乳腺癌患者腫瘤組織中STAT3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，分析在乳腺癌中STAT3的表達(dá)與患者臨床特征的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2015年8月～2016年8月，我院收治的新發(fā)乳腺癌且有完整臨床及病理資料的患者23例，均為女性，絕經(jīng)后13例，年齡30～71歲，平均年齡(54.48±4.74)歲。其中T1 9例，T2 11例，T3 3例。N0 6例，N1 1例，N2 5例，N3 11例。分子分型：HER-2過(guò)表達(dá)型2例，Luminal A型4例，Luminal B型13例，三陰性型 3例。浸潤(rùn)性乳腺癌20例，非浸潤(rùn)性乳腺癌3例。標(biāo)本采集符合北京大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會(huì)規(guī)定及赫爾辛基宣言。

二、方法

1.實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：兔抗人單克隆抗體IL-6、STAT3、MMP-2和MMP-9均購(gòu)自Proteintech(芝加哥，美國(guó))，抗兔/鼠通用型免疫組合試劑盒(REAL TMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE，Dako，丹麥)山羊血清、DAB顯色液、蘇木精均購(gòu)自康為世紀(jì)(北京，中國(guó))。

2.免疫組織化學(xué)分析乳腺癌組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況：組織4%多聚甲醛固定過(guò)夜，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉20分鐘后孵育IL-6(1∶200)、STAT3(1∶200)、MMP-2(1∶200)、MMP-9(1∶200)一抗過(guò)夜，PBS洗3次，每次5分鐘，37度孵育二抗30分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘，DAB顯色5到10分鐘，PBS洗10分鐘，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗10分鐘，脫水，透明，封片，鏡檢。

3.免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果判斷：IL-6、STAT3、MMP-2、MMP-9蛋白檢測(cè)以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，根據(jù)每張切片細(xì)胞的陽(yáng)性強(qiáng)度按無(wú)著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別打分0，1，2，3分；根據(jù)著色面積按無(wú)著色、著色<1/3、著色1/3～2/3、著色>2/3分別評(píng)0，1，2，3分。最終根據(jù)兩項(xiàng)總分判定結(jié)果：<3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.STAT3蛋白表達(dá)及患者臨床病理特征分析：23例乳腺癌組織中STAT3陽(yáng)性表達(dá)8例，其中浸潤(rùn)性癌7例，非浸潤(rùn)性癌1例，陽(yáng)性率34.78%(圖1)。非浸潤(rùn)性癌STAT3陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)型乳腺癌比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.738，P<0.05)，Spearman相關(guān)性分析顯示，兩者呈正相關(guān)(r=0.161，P<0.05)。與患者年齡、絕經(jīng)與否、乳腺癌分期、乳腺癌分型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，亦無(wú)顯著相關(guān)性(表1)。

表1 STAT3表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系

2.STAT3表達(dá)與IL-6、MMP-9、MMP-2表達(dá)相關(guān)性分析：23例乳腺癌患者腫瘤組織中，IL-6表達(dá)陽(yáng)性11例，陽(yáng)性率47.83%；MMP-2陽(yáng)性10例，陽(yáng)性率43.48%；MMP-9陽(yáng)性9例，陽(yáng)性率39.13%(圖2、3、4)。使用Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)一步分析STAT3與IL-6、MMP-9、MMP-2的相關(guān)性，結(jié)果顯示，STAT3陽(yáng)性表達(dá)與IL-6陽(yáng)性表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.032，P>0.05)，與MMP-9(r=0.537，P<0.05)和MMP-2(r=0.649，P<0.05)陽(yáng)性表達(dá)呈顯著正相關(guān)(表1)。

A：STAT3表達(dá)陰性，細(xì)胞漿淡黃色，著色面積<1/3(× 200倍，DAB染色)；B：STAT3表達(dá)陽(yáng)性：細(xì)胞漿棕褐色，著色面積>2/3(× 200倍，DAB染色)圖1 STAT3在乳腺癌組織中表達(dá)

A：IL-6表達(dá)陰性，細(xì)胞漿淡黃色，著色面積<1/3(× 200倍，DAB染色)；B：IL-6表達(dá)陽(yáng)性：細(xì)胞漿棕褐色，著色面積>2/3(× 200倍，DAB染色)圖2 IL-6在乳腺癌組織中表達(dá)

A：MMP-2表達(dá)陰性，細(xì)胞漿淡黃色，著色面積<1/3(× 200倍，DAB染色)B：MMP-2表達(dá)陽(yáng)性：細(xì)胞漿棕褐色，著色面積>2/3(× 200倍，DAB染色)圖3 MMP-2在乳腺癌組織中表達(dá)

A：MMP-9表達(dá)陰性，細(xì)胞漿淡黃色，著色面積<1/3(× 200倍，DAB染色)B：MMP-9表達(dá)陽(yáng)性：細(xì)胞漿棕褐色，著色面積>2/3(× 200倍，DAB染色)圖4 MMP-9在乳腺癌組織中表達(dá)

STAT是一種轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白質(zhì)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，特別是STAT3的異常激活在癌癥發(fā)生機(jī)制中處于核心位置[8]。在正常細(xì)胞中，STAT3的激活在時(shí)間和程度上均受到嚴(yán)格控制。但是在許多腫瘤細(xì)胞中，STAT3被持續(xù)激活，導(dǎo)致靶基因連續(xù)表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、存活、侵襲和血管生成[9]。在惡性腫瘤中，驅(qū)動(dòng)STAT3活化的主要驅(qū)動(dòng)因子是IL-6，它可通過(guò)一種復(fù)雜的IL-6受體ɑ和gp130激活兩面激酶(Janus kinases，JAK)，最終磷酸化STAT3[10]。IL-6驅(qū)動(dòng)STAT3活化的重要性已在多種腫瘤中被驗(yàn)證，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤等[11]。有報(bào)道認(rèn)為，在三陰型乳腺癌中通過(guò)抑制IL-6，能進(jìn)一步抑制STAT3而達(dá)到抑制腫瘤的目的；而在HER-2陽(yáng)性乳腺癌中則有可能通過(guò)IL-6的高表達(dá)激活STAT3通路而導(dǎo)致腫瘤對(duì)抗HER-2治療耐藥[12-13]。我們利用免疫組化的方法檢測(cè)23例乳腺癌患者癌組織中IL-6和STAT3的陽(yáng)性表達(dá)，IL-6陽(yáng)性率為47.83%，STAT3陽(yáng)性率為34.78%。楊潔等[14]采用同樣方法檢測(cè)了126例乳腺癌患者組織中STAT3的表達(dá)，陽(yáng)性率達(dá)到82.5%。楊增等[15]檢測(cè)了36例乳腺癌組織中STAT3的表達(dá)，陽(yáng)性率為58.3%。齊鳳杰等[16]的研究陽(yáng)性率為65%。楊林等[17]通過(guò)檢測(cè)三陰性乳腺癌組織中IL-6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率達(dá)72.6%。本研究中三陰型乳腺癌例數(shù)少，HER-2陽(yáng)性例數(shù)多，因此，是否本研究樣本量少，以及由于腫瘤異質(zhì)性導(dǎo)致在不同分子分型和不同生物學(xué)類(lèi)型的乳腺癌中表達(dá)有差異還有待研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，STAT3陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)型乳腺癌有正相關(guān)性，說(shuō)明STAT3的高表達(dá)與乳腺癌的浸潤(rùn)侵襲有著密切的關(guān)系。為了進(jìn)一步探究STAT3與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，我們利用免疫組化觀察了乳腺癌組織中MMPs的表達(dá)。MMPs是一種鋅依賴的肽鏈內(nèi)切酶家族，在各種組織細(xì)胞外環(huán)境中均有表達(dá)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs不僅在正常生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有著極其密切的關(guān)系[19-20]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程復(fù)雜，其中就包括細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的異常破裂[21]。而MMPs及其抑制劑，如TIMPs和膜相關(guān)MMP抑制劑(RECK)是ECM降解的重要調(diào)節(jié)因子[22]。MMP-9和MMP-2作為IV膠原酶，能夠破壞基底膜，特別是降解IV膠原，從而加速腫瘤在體外的侵襲。在乳腺癌中，MMP-9循環(huán)水平顯著升高，MMP-9和/或MMP-2的釋放在乳腺腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色[23]。在本研究中的23例乳腺癌組織中MMP-2陽(yáng)性率為43.48%，MMP-9陽(yáng)性率為39.13%，均與STAT3陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)，提示STAT3可能是通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)控制乳腺癌轉(zhuǎn)移侵襲的。有研究顯示，在結(jié)腸癌中，IL-6/STAT3/Fra-1信號(hào)通路能夠通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9等上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)促進(jìn)因子的表達(dá)，促進(jìn)EMT和結(jié)腸癌侵襲[24]。祝立和等[25]通過(guò)研究乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中STAT3與MMP-2和MMP-9表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其呈顯著正相關(guān)，并認(rèn)為STAT3基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9 的表達(dá)介導(dǎo) EMT 從而促進(jìn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

我們采用免疫組化檢測(cè)了23例乳腺癌患者腫瘤組織中STAT3、IL-6、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，分析STAT3表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果表明，STAT3與乳腺癌的浸潤(rùn)、侵襲有關(guān)，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)實(shí)現(xiàn)控制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。但由于本研究樣本量少，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

[1] DeSantis CE，F(xiàn)edewa SA，Goding Sauer A，et al.Breast cancer statistics，2015：Convergence of incidence rates between black and white women[J].CA Cancer J Clin，2016，66(1)：31-42.

[2] 殷茜，張汝超，楊筱嵬，等.中電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道在乳腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系[J].臨床外科雜志，2016，24(9)：666-668.

[3] 李會(huì)，李興睿.乳腺癌靶向治療進(jìn)展及趨勢(shì)[J].臨床外科雜志，2012，9(24)：656-659.

[4] Polvak K，Weinberg RA.Transitions between epithelial and mesenchymal states：acquisition of malignant and stem cell traits[J].Nat Rev Cancer，2009，9(4)：265 - 273.

[5] Su F，Ren F，Rong Y，et al.Protein tyrosine phosphatase Meg2 dephosphorylates signal transducer and activator of transcription 3 and suppresses tumor growth in breast cancer[J].Breast Cancer Res，2012，14(2)：R38.

[6] 李靖若，李盂圈，鮑俊濤.乳腺癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)及意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88(32)：2278-2280.

[7] Li HC，Cao DC，Liu Y.Prognostic value of matrix metalloproteinases(MMP-2 and MMP-9)in patients with lymph node-negative breast carcinoma[J].Breast Cancer Res Treat，2004，88(1)：75-85.

[8] Frank DA.STAT3 as a central mediator of neoplastic cellular transformation[J].Cancer Lett，2007，251(2)：199-210.

[9] Rodriguez-Barrueco R，Yu J，Saucedo-Cuevas LP，et al.Inhibition of the autocrine IL-6-JAK2-STAT3-calprotectin axis as targeted therapy for HR-/HER2+breast cancers[J].Genes Dev，2015，29(15)：1631-1648.

[10]Sansone P，Bromberg J.Targeting the interleukin-6/Jak/stat pathway in human malignancies[J].J clin oncol，2012，30：1005-1014.

[11]Hedvat M，Huszar D，Herrmann A，et al.The JAK2 inhibitor AZD1480 potently blocks Stat3 signaling and oncogenesis in solid tumors[J].Cancer cell，2009，16：487-497.

[12]Liang S，Chen Z，Jiang G，et al.Activation of GPER suppresses migration and angiogenesis of triple negative breast cancer via inhibition of NF-κB/IL-6 signals[J].Cancer Lett，2017，1(386)：12-23.

[13]Huang WC，Hung CM，Wei CT，et al.Interleukin-6 expression contributes to lapatinib resistance through maintenance of stemness property in HER2-positive breast cancer cells[J].Oncotarget，2016，7(38)：62352-62363.

[14]楊潔，葉雙梅，蔣學(xué)鋒，等.STAT3與Enolase-1在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義[J].腫瘤防治研究，2012，39(12)：1451-1455.

[15]楊增，嚴(yán)麗，蔡建輝.TAT3與pSTAT3在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)腫瘤臨床與康復(fù)，2011，18(1)：24-27.

[16]齊鳳杰，趙樹(shù)鵬，朱培.TAT3和CyclinD1蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及意義[J].山東醫(yī)藥，2010，50(52)：106-108.

[17]楊林，韓思奇.三陰性乳腺癌中SOCS3和IL-6表達(dá)的相關(guān)性及臨床意義[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，44(1)：82-86.

[18]Back M，Ketelhuth DF，Agewall S.Matrix metalloproteinases in athero-thrombosis[J].Prog Cardiovasc Dis，2010，52(5)：410-428.

[19]Chen PS，Shih YW，Huang HC，et al.Diosgenin，a steroidal saponin，inhibits migration and invasion of human prostate cancer PC-3 cells by reducing matrix metalloproteinases expression[J].PLoS One，2011，6(5)：e20164.

[20]Gonzalez-Arriaga P，Pascual T，Garcia-Alvarez A，et al.Genetic polymorphisms in MMP 2，9 and 3 genes modify lung cancer risk and survival[J].BMC Cancer，2012，28(12)：121.

[21]Chambers AF.The metastatic process：basic research and clinical implications[J].Oncol Res，1999，11(4)：161-168.

[22]Radisky ES，Radisky DC.Matrix metalloproteinase-induced epithelial- mesenchymal transition in breast cancer[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia，2010，15(2)：201-212.

[23]Lu P，Takai K，Weaver VM，et al.Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease[J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2011，3(12)：pii：a005058.

[24]Liu H，Ren G，Wang T，et al.Aberrantly expressed Fra-1 by IL-6/STAT3 transactivation promotes colorectal cancer aggressiveness through epithelial- mesenchymal transition[J].Carcinogenesis，2015，36(4)：459-468.

[25]祝立和，盧洪勝，周凱敏，等.STAT3基因與MMP-2、MMP-9在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及其相互關(guān)系[J].臨床研究，2012，50(29)：58-64.

(本文編輯：楊澤平)

歡迎賜稿 歡迎訂閱

郵發(fā)代號(hào)：38-184

Relationship research between expression of STAT3 in breast cancer with MMP-2/9

HUHui，WEIWei，YIXin，etal.

(DepartmentofBreastandThyroidSurgery，PekingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036，China)

Objective To observe the expression of STAT3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)in breast cancer and explore the relationship between the expression and clinical features.Methods The expression of STAT3，IL-6(interleukin，IL-6)，MMP(matrix metalloproteinase，MMP)-2 and MMP-9 in 23 cases of breast cancer were observed by immunohistochemistry(EnVision)and positive rates were calculated.Chi Square and Spearman correlation coefficients were used to further analyze the correlation between STAT3 expression and clinical pathological features.Results The expression of STAT3 in invasive carcinoma was higher than that in non-invasive carcinoma.11 cases of IL-6，10 cases of MMP-2，9 cases of MMP-9 were positive in 23 cases of breast cancer，positive rate were 47.83%，43.48% and 39.13% respectively.There was a significant difference between STAT3 positive expression and invasive breast cancer(χ2=7.738，P<0.05)，and there was a significant positive correlation between them(r=0.161，P<0.05).There was no significant correlation between STAT3 positive expression and IL-6 positive expression(r=0.032，P>0.05)，while significant correlations were with MMP-2(r=0.649，P<0.05)and MMP-9(r=0.537，P<0.05)respectively.Conclusion STAT3 is closely related to invasion of breast cancer，which may be to controll the invasion and metastasis of breast cancer by regulating the expression of MMP-2 and MMP-9.

breast cancer; STAT3; invasion; MMP-2; MMP-9

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.07.012

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目(A2015545)

518036 深圳，北京大學(xué)深圳醫(yī)院乳腺甲狀腺外科

韋偉，Email：rxwei1123@163.com

2017-03-14)