耿介

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014）

酪氨酸激酶3對(duì)赫賽汀耐藥的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/H增殖和成瘤能力的影響

耿介

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014）

目的探索erb-b2受體酪氨酸激酶3（HER-3）對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/H的體外增殖和體內(nèi)成瘤能力的影響。方法采用赫賽汀濃度遞增法構(gòu)建SKOV3耐藥細(xì)胞株（赫賽汀起始濃度為5 mg/L，經(jīng)5～8次濃度遞增，每次提高50%）。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)HER-3在15對(duì)非耐藥卵巢癌組織和耐藥卵巢癌組織中的表達(dá)（SKOV3和SKOV3/H細(xì)胞中的表達(dá)）。MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分別轉(zhuǎn)染sh-HER-3及其對(duì)照質(zhì)粒vector對(duì)SKOV3/H細(xì)胞增殖能力的影響。將包含sh-HER-3的重組慢病毒質(zhì)粒及其陰性對(duì)照慢病毒空載體質(zhì)粒vector（均帶egfp熒光標(biāo)簽）分別以病毒/細(xì)胞數(shù)量=15的比例感染SKOV3/H細(xì)胞，加入2.0 μg/ml的嘌呤霉素篩選，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-HER-3或vector的SKOV3/H細(xì)胞，將2株細(xì)胞分別注射到裸鼠皮下，復(fù)制卵巢癌裸鼠移植瘤模型，觀察體內(nèi)成瘤情況。結(jié)果成功構(gòu)建卵巢癌SKOV3耐赫賽汀細(xì)胞株SKOV3/H，且SKOV3/H的群體倍增時(shí)間為SKOV3細(xì)胞的1.4～1.9倍。HER-3在耐藥卵巢癌組織中的表達(dá)水平高于非耐藥癌組織（P<0.05），且HER-3在耐藥細(xì)胞株SKOV3/H中的表達(dá)水平也高于非耐藥卵巢癌細(xì)胞株SKOV3（P<0.05）。轉(zhuǎn)染sh-HER-3后，SKOV3/H細(xì)胞的增殖能力低于陰性對(duì)照組（P<0.05）。轉(zhuǎn)染sh-HER-3后，耐藥細(xì)胞株SKOV3/H的裸鼠體內(nèi)成瘤能力降低（P<0.05）。結(jié)論HER-3參與卵巢癌的赫賽汀耐藥，并正向影響耐藥細(xì)胞株SKOV3/H的增殖和體內(nèi)成瘤能力。

卵巢癌；赫賽汀耐藥；HER-3；增殖；體內(nèi)成瘤

Abstract:ObjectiveTo explore the role of HER-3 in ovarian cancer and Herceptin resistant ovarian cancer,and the effect of HER-3 on the proliferation abilities in vitro and tumorigenicity abilities in vivo of Herceptin-resistant ovarian cancer cell SKOV3/H.MethodsHerceptin concentration was gradually increased to construct resistant cell lines (C0=5 mg/L,increased 5 to 8 times,each time increased by 50%).qRT-PCR was used to detect the expression of HER-3 in 15 pairs of ovarian cancer tissues which were non-resistant or resistant to Herceptin,and the expression of HER-3 in SKOV3 and SKOV3/H cells.MTT experiment was used to detect the proliferation of SKOV3/H after infected with sh-HER-3 or vector.KOV3/H cells infected with sh-HER-3 or vector were subcutaneously injected into nude mice to build the ovarian cancer xenografts.Tumor formation was observed in vivo situation.ResultsSuccessfully constructed the Herceptin-resistant ovarian cancer cell line SKOV3/H,the Td of SKOV3/H was 1.4 to 1.9 times of SKOV3.The expression levels of HER-3 was significantly higher in Herceptin resistant ovarian cancer tissues(P<0.05),and HER-3 expression levels were also significantly higher in SKOV3/H cells (P<0.05).After transfected with sh-HER-3,theproliferation and tumorigenicity abilities of SKOV3/H were significantly lower than vector group(P<0.05).The tumorigenicity ability of SKOV3/H in mice was significantly reduced (P<0.05).ConclusionsHER-3 is involved in the Herceptin resistant of ovarian cancer and affects the proliferation and in vivo tumorigenicity of SKOV3/H.

Keywords:ovarian cancer;herceptin resistant;HER-3;proliferation;tumorigenesis in vivo

卵巢癌是嚴(yán)重影響女性生殖健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其致死率長(zhǎng)期處于女性惡性腫瘤的首位，其中約90%的卵巢癌為上皮性卵巢癌，由于其發(fā)病癥狀不明顯，大多數(shù)患者被確診時(shí)已屬于晚期卵巢癌，易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，治療預(yù)后差，5年生存率低[1]。

目前，臨床用于治療卵巢癌的藥物主要有化療藥物鉑類(lèi)（如順鉑、卡鉑），紫杉醇等，靶向藥物吉非替尼、西妥昔單抗、貝伐單抗、曲貝替定及曲妥珠單抗等[2]。其中曲妥珠單抗又稱赫賽汀，為表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員（human epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制劑[3]，主要作用靶點(diǎn)為細(xì)胞膜（erb-b2）受體酪氨酸激酶2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）。人表皮生長(zhǎng)因子受體家族主要包括EGFR、HER-2、HER-3和HER-4 4個(gè)成員[4]。EGFR家族的異常表達(dá)與許多人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，例如乳腺癌、卵巢癌和胃癌等[5-7]。在卵巢癌中，赫賽汀可用于HER2過(guò)表達(dá)型卵巢癌的治療[8]。研究表明，許多卵巢癌患者在赫賽汀初始治療時(shí)即可出現(xiàn)耐藥，也有患者在赫賽汀治療1年后出現(xiàn)獲得性耐藥[9]，而目前的卵巢癌治療中，赫賽汀靶向HER-2的耐藥機(jī)制尚不明確，作為HER-2同家族的HER-3，近年來(lái)常有研究報(bào)道顯示，HER-3與HER-2共表達(dá)，乳腺癌中HER3的表達(dá)與赫賽汀的耐藥密切相關(guān)[10]。因此，本研究擬從HER-3的角度，探究HER-3在卵巢癌中的作用，HER-3在卵巢癌赫賽汀耐藥中的作用，HER-3對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞株（SKOV3/H）的增殖和體內(nèi)成瘤能力的影響。以期望為卵巢癌患者的早期診斷和治療提供更加完善、精準(zhǔn)的治療方案，改善卵巢癌患者的預(yù)后及生存。

1 材料與方法

1.1 主要材料

LipofectamineTM2000和Trizol試劑（購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司），核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）抽提試劑盒（購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Applied Biosystems公司），Taq Man逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（英國(guó)Life Technologies公司），qSYBR-Green-containing PCR kit（美國(guó)Qiagen公司），赫賽?。绹?guó)Gh公司）。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（16×25格），Thermo Multiskan Ascent酶標(biāo)儀，型號(hào) 413 MBY042078（美國(guó)薩默飛世爾公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SKOV3細(xì)胞（來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化細(xì)胞所），細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國(guó) Gibco公司）和 100 u/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素（美國(guó)Invitrogen公司）雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Sigma公司）中，細(xì)胞放置于37℃、含5%二氧化碳CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。建立卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/H：用含10%胎牛血清和雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞SKOV3，0.5%胰蛋白酶消化傳代。在細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%時(shí)，加入赫賽汀5 mg/L，作用1 h后更換培養(yǎng)基，第2天約50%左右的細(xì)胞死亡。細(xì)胞逐漸恢復(fù)且生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%時(shí)，繼續(xù)重復(fù)該步驟5～8次，逐步提高赫賽汀濃度，每次提高50%。直到某一濃度時(shí)，細(xì)胞基本無(wú)死亡、耐藥指數(shù)（resistant index，RI）>3.0、能保持傳代3個(gè)月仍維持類(lèi)似耐藥性。此時(shí)即成功建立卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/H。

1.3 穩(wěn)定表達(dá)sh-HER-3重組慢病毒質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒載體細(xì)胞株的建立

包含sh-HER-3的重組慢病毒質(zhì)粒及其陰性對(duì)照慢病毒空載體質(zhì)粒載體（均帶egfp的熒光標(biāo)簽）（美國(guó)Gene Copoeia公司構(gòu)建），將2種質(zhì)粒分別以病毒/細(xì)胞數(shù)量=15的比例感染SKOV3/H細(xì)胞，感染3 d后觀察熒光的表達(dá)量，并加入2.0 μg/ml的嘌呤霉素，繼續(xù)培養(yǎng)，直到所有細(xì)胞均可觀察到熒光的表達(dá)。此時(shí)即構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)sh-HER-3的細(xì)胞株及其陰性對(duì)照。

1.4 臨床樣本及RNA提取

選取2013年6月-2015年6月本院病理科確診并進(jìn)行手術(shù)切除的赫賽汀耐藥卵巢癌組織15例，與赫賽汀耐藥組的患者對(duì)應(yīng)年齡、性別及病理狀態(tài)的非耐藥卵巢癌組織15例。其中兩組患者的平均年齡分別為（40±16.03）和（39.98±16.00）歲，兩組均為已婚9例，未婚6例，絕經(jīng)8例，未絕經(jīng)7例?；颊叩乃信R床病理學(xué)數(shù)據(jù)均被妥善保存且可隨時(shí)查閱。實(shí)驗(yàn)的所有過(guò)程遵從赫爾辛基宣言，該研究得到我院倫理委員會(huì)的支持，且與所有患者簽署了知情同意書(shū)，研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。該15例赫賽汀耐藥卵巢癌組織和非耐藥卵巢癌組織均保存于液氮中用于提取RNA。

取液氮保存的耐藥卵巢癌組織和非耐藥卵巢癌組織各100 mg，各加入700 ml Trizol試劑，充分研磨（SKOV3和SKOV3/H細(xì)胞系總RNA提取則6孔板中各加入100μl Trizol，其他試劑按比例遞減）。室溫放置5min，加入140ml氯仿，劇烈震蕩15 s。室溫放置 5min，12000r/min，4℃離心 15min。吸取上層液體到另一干凈離心管，按0.5 ml異丙醇 Trizol的比例加入異丙醇，混勻，室溫放置10 min，離心去除上清液。加入1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，7 500 r/min，4℃離心5 min，棄上清液，室溫干燥，加入30 μl無(wú)核糖核酸酶水溶解，取1μl測(cè)RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連反應(yīng)檢測(cè)

以1.4中提取的組織和細(xì)胞總RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄生成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），以cDNA為模板，按 qSYBR-Green-containing PCR kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，Bio Rad IQTM5 Multicolor實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）系統(tǒng)檢測(cè)（美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司）。HER-3引物由（美國(guó)Invitrogen公司）合成，正向引物：5'-AGGCACGAGGAA CAAGCTCAC-3'；反向引物：5'-ATGAGGACATAACC AGCCACC-3'。β-actin為內(nèi)參，正向引物：5'-CTCC ATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反向引物：5'-GCTGTCAC CTTCACCGTTCC-3'。2-ΔΔCT用于計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCT=（CTmiRNA-CTβ-actin）target-（CTmiRNA CTβ-actin）control。反應(yīng)體系為 20 μl，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.6 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制

將SKOV3和SKOV3/H細(xì)胞0.25%胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度至1×103個(gè)/ml，接種至24孔板，每孔600 μl，細(xì)胞計(jì)數(shù)（血細(xì)胞計(jì)數(shù)板讀出細(xì)胞數(shù)，16×25格血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：1 ml細(xì)胞數(shù)=每小格細(xì)胞數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)），4 d/次，連續(xù) 28 d，并取其對(duì)數(shù)值-3，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，Patterson公式計(jì)算細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的群體倍增時(shí)間（Td）=T[lg2/lg（N/N0）]（T=天數(shù)，N=實(shí)際細(xì)胞數(shù)，N0=初始細(xì)胞數(shù)）。

1.7 MTT實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)分成sh-HER-3組和陰性對(duì)照組。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的sh-HER-3和陰性對(duì)照組的SKOV3/H細(xì)胞接種到96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞匯合度接近90%時(shí)，在每孔加入滅菌MTT液30 μl（其濃度為5 mg/ml）。37℃孵育4 h后向每孔中加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，隨后選擇570 nm波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan Ascent酶標(biāo)儀，型號(hào)413MB Y042078）測(cè)定各孔的吸光值并記錄結(jié)果，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 裸鼠移植瘤模型

將裸鼠分兩組，每組3只，將構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-HER-3及其陰性對(duì)照的SKOV3/H細(xì)胞分別皮下注射到裸鼠體內(nèi)，注射量為每只6×106個(gè)/ml，共100 μl。每4天觀測(cè)1次裸鼠體內(nèi)瘤體的體積與大小，裸鼠體內(nèi)瘤體的體積（V）=（長(zhǎng)徑×短徑2）/2，4周后處死小鼠并解剖，取出瘤體，所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組資料取正態(tài)分布的總體，并滿足方差齊性，兩組數(shù)據(jù)比較t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析，多時(shí)點(diǎn)觀測(cè)資料則用重復(fù)測(cè)量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 赫賽汀誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞株生長(zhǎng)情況

短梭形SKOV3細(xì)胞在赫賽汀誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)改變且體積變大，邊緣有樹(shù)突狀分支且呈星型，胞漿內(nèi)形成空泡和顆粒，該現(xiàn)象在給藥1 d時(shí)最明顯，5 d后恢復(fù)最初狀態(tài)，此時(shí)SKOV3和SKOV3/H形態(tài)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖1A）。SKOV3/H生長(zhǎng)速度低于SKOV3，根據(jù)Patterson公式計(jì)算細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的群體倍增時(shí)間（Td）=T[lg2/lg（N/N0）]（T=天數(shù)，N=實(shí)際細(xì)胞數(shù)，N0=初始細(xì)胞數(shù)），其中SKOV3/H細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為（28.33±2.12）h，SKOV3細(xì)胞的Td值為（46.52±2.71）h，SKOV3/H細(xì)胞的Td為SKOV3細(xì)胞的1.4～1.9倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖 1B。

2.2 HER-3在卵巢癌耐藥組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)了HER-3在15例卵巢癌耐藥和非耐藥癌組織中的表達(dá)，與非耐藥癌組織比較，HER-3在耐藥癌組織中表達(dá)上調(diào)[（0.773±0.235）vs（1.358±0.464）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見(jiàn)圖2A）。隨后分別檢測(cè)HER-3在非耐藥細(xì)胞株SKOV3和耐藥細(xì)胞株SKOV3/H中的表達(dá)，與SKOV3細(xì)胞比較，耐藥細(xì)胞株SKOV3/H中HER-3的表達(dá)上調(diào)[（1.037±0.119）vs（1.540±0.089）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見(jiàn)圖 2B）。

2.3 靶向HER-3抑制卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/H的增殖能力

分別轉(zhuǎn)染HER-3的shRNA和陰性對(duì)照到SKOV3/H細(xì)胞中，qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染sh-HER-3后，SKOV3/H細(xì)胞中HER-3的mRNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照組降低（陰性對(duì)照組：1.032±0.013，sh-HER-3 組：0.346±0.004）（P<0.05）（見(jiàn)圖 3A），即轉(zhuǎn)染成功。

MTT實(shí)驗(yàn)共分兩組，分別轉(zhuǎn)染sh-HER-3和陰性對(duì)照到SKOV3/H細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組比較，sh-HER-3轉(zhuǎn)染組SKOV3/H細(xì)胞的增殖能力被抑制 [抑制率的數(shù)值陰性對(duì)照組：（97.67±2.08）%，sh-HER-3 組：（45.00±15.00）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3B。

2.4 靶向HER-3抑制卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/H的體內(nèi)成瘤能力

為評(píng)估HER-3對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/H體內(nèi)成瘤能力的影響，將復(fù)制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-HER-3和陰性對(duì)照SKOV3/H細(xì)胞株，皮下注射到裸鼠體內(nèi)（每組3只），復(fù)制裸鼠荷人卵巢癌移植瘤模型，4周后處死裸鼠并取出瘤體組織，結(jié)果顯示sh-HER-3組裸鼠成瘤體積小于陰性對(duì)照組（P<0.05）（見(jiàn)圖4）。

圖1 卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/H的檢測(cè)結(jié)果

圖2 HER-3在卵巢癌耐藥和非耐藥組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平

圖3 抑制HER-3對(duì)SKOV3和SKOV3/H細(xì)胞增殖能力的影響

圖4 抑制HER-3對(duì)SKOV3/H裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響

3 討論

卵巢癌是臨床上常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，其致死率居于女性惡性腫瘤的首位，其中尤以上皮性卵巢癌的致死率最高[11]。目前卵巢癌的主要治療方案有手術(shù)治療、一線化療、腹腔化療、新輔助化療、靶向治療、基因治療、免疫治療、內(nèi)分泌治療和中醫(yī)治療等[12]。其中靶向治療是一種以標(biāo)準(zhǔn)化生物標(biāo)志物識(shí)別是否存在某種疾病特定的控制腫瘤生長(zhǎng)的基因或基因譜，以確定針對(duì)特異性靶點(diǎn)的治療方法，又被稱為“生物導(dǎo)彈”，可靶向腫瘤特異性組織，而不對(duì)正常組織造成損傷，因此其在卵巢癌治療中運(yùn)用較為廣泛[13]。

EGFR是與卵巢癌靶向治療密切相關(guān)的重要受體，其在多種惡性腫瘤中均存在過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象[14]。EGFR家族包括erbB1/HER-1/EGFR，erbB2/HER-2、erbB3/HER-3和erbB4/HER-4共4個(gè)成員，目前針對(duì)HER-2的研究較多，但與HER-3相關(guān)的研究卻較少，并且觀點(diǎn)并不統(tǒng)一，有學(xué)者認(rèn)為HER-3在癌中高表達(dá)，與患者的生存無(wú)關(guān)；有學(xué)者認(rèn)為，HER-3和HER-2的過(guò)度表達(dá)高度相關(guān)，且HER-3陽(yáng)性與陰性患者OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15]。目前以EGFR家族為主要靶點(diǎn)的藥物研發(fā)已成為近年來(lái)靶向藥物研發(fā)的重點(diǎn)，臨床常用的卵巢癌靶向治療藥物以EGFR抑制劑為主，包括吉非替尼（作用靶點(diǎn)EGFR）、西妥昔單抗（作用靶點(diǎn)EGFR）和曲妥珠單抗（赫賽汀，作用靶點(diǎn) HER-2）等[16]。

藥物耐藥是導(dǎo)致腫瘤治療轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，并最終導(dǎo)致治療失敗的主要原因之一。研究表明，HER-2陽(yáng)性的卵巢癌患者在接受赫賽汀治療后，仍然有約60%的患者產(chǎn)生藥物抵抗或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致治療失敗[17]。目前，針對(duì)卵巢癌的赫賽汀耐藥尚無(wú)有效的預(yù)防及改善措施，因此尋找卵巢癌患者赫賽汀耐藥的內(nèi)在機(jī)制，減少或逆轉(zhuǎn)赫賽汀的耐藥，將為卵巢癌的治療和預(yù)防帶來(lái)較大的益處。

本研究成功構(gòu)建對(duì)赫賽汀耐藥的卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/H，檢測(cè)SKOV3/H和SKOV3細(xì)胞、赫賽汀耐藥和非耐藥的卵巢癌組織中HER-3的表達(dá)水平，筆者發(fā)現(xiàn)HER-3在卵巢癌的赫賽汀耐藥細(xì)胞株和組織中均存在過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象，本研究結(jié)果與HER-3在多種癌組織中存在過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象相一致，如HER-3在低分化的乳腺癌中高表達(dá)[18]。由于HER-3的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，使腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移性[19]，抑制HER-3的表達(dá)，可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和存活能力[20]，因此推測(cè)在赫賽汀耐藥的SKOV3/H細(xì)胞中抑制HER-3的表達(dá)，將可能降低SKOV3/H細(xì)胞的惡性程度。

筆者轉(zhuǎn)染sh-HER-3及其對(duì)照質(zhì)粒到耐藥細(xì)胞株SKOV3/H中，采用MTT和體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證猜想，結(jié)果與猜想一致，即抑制耐藥細(xì)胞株SKOV3/H中HER-3的表達(dá)，可抑制SKOV3/H細(xì)胞的體外增殖和體內(nèi)成瘤能力。而關(guān)于該抑制作用的實(shí)現(xiàn)過(guò)程，研究顯示HER-3可先通過(guò)HER-2介導(dǎo)而發(fā)生磷酸化，并與磷脂酰肌醇-3-激酶（PI-3K）結(jié)合，隨后激活與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和遷移等密切相關(guān)的PI-3K通路，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[21]。另外，PI-3K/Akt信號(hào)通路還與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR、HER-2）的靶向藥物耐藥相關(guān)，該過(guò)程可經(jīng)HER-3激活[22]。關(guān)于HER-3對(duì)EGFR或HER-2靶向藥物產(chǎn)生耐藥性的內(nèi)在機(jī)制，有研究認(rèn)為與HER-3的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)[23]，而筆者在卵巢癌的赫賽汀耐藥細(xì)胞株和組織中觀察到該現(xiàn)象，研究顯示臨床常用的EGFR家族的分子靶向藥物吉非替尼或赫賽汀，對(duì)HER-2陽(yáng)性患者產(chǎn)生耐藥性的原因可能是HER-3在組織和細(xì)胞內(nèi)存在重排的現(xiàn)象[24]，可用于解釋HER-3在卵巢癌的赫賽汀耐藥細(xì)胞株和組織中存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象的原因。

綜上所述，HER-3與卵巢癌治療中的赫賽汀耐藥密切相關(guān)，靶向抑制HER-3可抑制赫賽汀耐藥細(xì)胞株的增殖和體內(nèi)成瘤能力，研發(fā)靶向HER-3的藥物將大大提高赫賽汀在卵巢癌臨床治療和和預(yù)防中的作用。

[1]EBELL M H,CULP M B,RADKE T J.A systematic review of symptoms for the diagnosis of ovarian cancer[J].American Journal of Preventive Medicine,2016,50(3):384-394.

[2]DONG A,LU Y,LU B.Genomic/Epigenomic alterations in ovarian carcinoma:translational insight into clinical practice[J].Journal of Cancer,2016,7(11):1441-1451.

[3]TEPLINSKY E,MUGGIA F.Targeting HER2 in ovarian and uterine cancers:challenges and future directions[J].Gynecol Oncol,2014,135(2):364-370.

[4]CHUANG J C,SHRAGER J B,WAKELEE H A,et al.Concordant and discordant EGFR mutations in patients with multifocal adenocarcinomas:implications for EGFR-targeted therapy[J].Clinical Therapeutics,2016,38(7):1567-1576.

[5]LI J,LIU J,GUO N,et al.Reversal of multidrug resistance in breastcancerMCF-7/ADR cellsbyh-R3-siMDR1-PAMAM complexes[J].International Journal of Pharmaceutics,2016,511(1):436-445.

[6]LI D,WU Q J,BI F F,et al.Effect of the BRCA1-SIRT1-EGFR axis on cisplatin sensitivity in ovarian cancer[J].American Journal of Translational Research,2016,8(3):1601-1608.

[7]PARK J S,KIM H S,BAE Y S,et al.Prognostic significance and frequency of EGFR expression and amplification in surgically resected advanced gastric cancer[J].Japanese Journal of Clinical Oncology,2016,46(6):507-516.

[8]ELMLUND L,KACK C,AASTRUP T,et al.Study of the interaction of trastuzumab and SKOV3 epithelial cancer cells using a quartz crystal microbalance sensor[J].Sensors,2015,15(3):5884-5894.

[9]LI X,DUAN Y,QIAO C,et al.Anti-HER3 monoclonal antibody inhibits acquired trastuzumab-resistantgynecologic cancers[J].Technology in Cancer Research&Treatment,2016,15(4):573-582.

[10]CRAFTER C,VINCENTJ P,TANG E,etal.Combining AZD8931,a novel EGFR/HER2/HER3 signalling inhibitor,with AZD5363 limits AKT inhibitor induced feedback and enhances antitumour efficacy in HER2-amplified breast cancer models[J].International Journal of Oncology,2015,47(2):446-454.

[11]張恒,王宇平,谷楊,等.不同給藥途徑的新輔助化療在晚期上皮性卵巢癌的療效觀察[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,15(1):96-99.

[12]丁濱.卵巢癌治療研究進(jìn)展[J].人民軍醫(yī),2011,54(3):237-239.

[13]WANG M,MA H.Paired box gene 2 is associated with estrogen receptor alpha in ovarian serous tumors:potential theory basis for targeted therapy[J].Molecular& Clinical Oncology,2016,5(2):323-326.

[14]JACCA S,ROLIH V,QUAGLINO E,et al.Bovine herpesvirus 4-based vector delivering a hybrid rat/human HER-2 oncoantigen efficiently protects mice from autochthonous Her-2mammary cancer[J].Oncoimmunology,2015,5(3):e1082705.

[15]REVILLION F,LHOTELLIER V,HORNEZ L,et al.ErbB/HER ligands in human breast cancer,and relationships with their receptors,the bio-pathological features and prognosis[J].Annals of Oncology,2008,19(1):73-80.

[16]FUCHS I,VORSTEHER N,BUHLER H,et al.The prognostic significance of human epidermal growth factor receptor correlations in squamous cell cervical carcinoma[J].Anticancer Research,2007,27(2):959-963.

[17]DAMASCENO K A,FERREIRA E,ESTRELA-LIMA A,et al.HER-2 and EGFR mRNA expression and its relationship with versican in malignant matrix-producing tumors of the canine mammary gland[J].PLoS One,2016,11(8):e0160419.

[18]STEELMAN L S,FITZGERALD T,LERTPIRIYAPONG K,et al.Critical roles of EGFR family members in breast cancer and breast cancer stem cells:targets for therapy[J].Current Pharmaceutical Design,2016,22(16):2358-2388.

[19]KANG J C,POOVASSERY J S,BANSAL P,et al.Engineering multivalent antibodies to target heregulin-induced HER3 signaling in breast cancer cells[J].MAbs,2014,6(2):340-353.

[20]張挺麗,王彬,吳錦昌,等.HER3在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義[J].腫瘤防治研究,2012,39(5):538-541.

[21]OZKAVRUK E N,AKTAS S,OZGUR H,et al.The role of p95HER2 in trastuzumab resistance in breast cancer[J].Journal of Buon Official Journal of the Balkan Union of Oncology,2016,21(2):382-389.

[22]SERVIDEI T,RICCARDI A,MOZZETTI S,et al.Chemoresistant tumor cell lines display altered epidermal growth factor receptor and HER3 signaling and enhanced sensitivity to gefitinib[J].International Journal of Cancer,2008,123(12):2939-2949.

[23]王崇偉,馬振海,趙永福,等.HER-3在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2013,20(2):45-48.

[24]SERGINA N V,RAUSCH M,WANG D,et al.Escape from HER-family tyrosine kinase inhibitor therapy by the kinase-inactive ER3[J].Nature,2007,445(7126):437-441.

Effect of HER-3 on proliferation and tumorigenicity abilities of Herceptin-resistant ovarian cancer cell line SKOV3/H

Jie Geng
(Department of Gynecology,the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450014,China)

R737.31

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.005

1005-8982（2017）15-0022-07

2016-12-26