胡強(qiáng) 俞文華 陳高 杜權(quán)

HIF-1α介導(dǎo)上調(diào)BNIP3在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期皮層神經(jīng)元凋亡中的作用機(jī)制

胡強(qiáng) 俞文華 陳高 杜權(quán)

目的 探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、BNIP3在蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后早期皮層神經(jīng)元凋亡中的作用機(jī)制。方法 采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立SAH大鼠模型，設(shè)SAH組、2-甲氧雌二醇（2ME2）組和假手術(shù)（sham）組，每組10只。造模后24h對(duì)SAH大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)；取大鼠腦組織，采用TUNEL法檢測(cè)凋亡指數(shù)，免疫熒光染色檢測(cè)HIF-1α的組織細(xì)胞定位，Western blot檢測(cè)HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 與sham組比較，造模后24h SAH組大鼠腦組織中HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05），凋亡指數(shù)明顯增高（P＜0.05），神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。與SAH組比較，2ME2組大鼠腦組織中HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)水平均明顯下降（均P＜0.05），凋亡指數(shù)明顯下降（P＜0.05），神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高（P＜0.05）。HIF-1α主要定位表達(dá)于神經(jīng)元。 結(jié)論 HIF-1α介導(dǎo)上調(diào)BNIP3并參與了SAH后早期皮層神經(jīng)元凋亡過(guò)程。

蛛網(wǎng)膜下腔出血 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 凋亡 BNIP3

蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）具有較高的致殘率、病死率，約85%由顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂所致[1]。目前治療手段（手術(shù)夾閉、介入栓塞）以及神經(jīng)影像技術(shù)等不斷進(jìn)步，然而SAH患者預(yù)后改善并不顯著。近年來(lái)研究表明早期腦損傷（EBI）與SAH患者高風(fēng)險(xiǎn)致殘、病死等密切相關(guān)，及時(shí)對(duì)EBI進(jìn)行有效干預(yù)可能改善患者預(yù)后[2-4]。EBI涉及一系列病理、生理變化，具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)有研究指出細(xì)胞凋亡在SAH后EBI中發(fā)揮重要作用[5-6]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在SAH后腦組織表達(dá)明顯增多[7-8]，但它在SAH后EBI中的具體機(jī)制尚未清楚。BNIP3是HIF-1α的重要靶基因之一，它是Bcl-2家族蛋白，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。本研究通過(guò)建立SAH大鼠模型，并予HIF-1α抑制劑干預(yù)，檢測(cè)大鼠腦組織HIF-1α和BNIP3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡情況、神經(jīng)功能評(píng)分及HIF-1α的組織細(xì)胞定位，以初步探討HIF-1α、BNIP3在SAH后早期皮層神經(jīng)元凋亡中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 健康雄性SD大鼠30只，月齡2～3個(gè)月，體重280～320g，均購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；按照隨機(jī)數(shù)字表法分為SAH組、2-甲氧雌二醇（2ME2）組和假手術(shù)（sham）組，每組10只。2ME2、二甲亞砜、多聚甲醛均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TUNEL試劑盒和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）均購(gòu)自美國(guó)Roche公司，兔抗HIF-1α和小鼠抗BNIP3一抗均購(gòu)自Abcom公司，小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、小鼠抗神經(jīng)元特異性核蛋白（NeuN）一抗均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，TRITC標(biāo)記羊抗兔和FITIC標(biāo)記羊抗小鼠二抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司，熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 SAH造模及評(píng)價(jià) 本研究采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法制作SAH模型。大鼠經(jīng)麻醉后取頸部正中入路，充分顯暴右側(cè)頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）及頸總動(dòng)脈（CCA）。結(jié)扎并切斷ECA遠(yuǎn)端，取單股尼龍線從ECA輕輕插入ICA顱內(nèi)段，刺破血管壁，造成SAH，拔出尼龍線，用絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端，嚴(yán)密縫合頸部切口。sham組大鼠除了不進(jìn)行穿刺血管壁外，其余步驟同上。2ME2組大鼠在SAH造模成功后1h按5mg/kg腹腔注射1%二甲亞砜溶解的2ME2試劑；SAH組和sham組大鼠均在造模后1h腹腔注射等體積1%二甲亞砜。造模后24h取腦組織標(biāo)本，此時(shí)可見(jiàn)Willis動(dòng)脈環(huán)周?chē)嬖谘龎K。SAH出血評(píng)分參照Sugawara等[9]改良的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，出血評(píng)分≤8分的大鼠予以剔除，用備用大鼠替代補(bǔ)充。若術(shù)中或術(shù)后24h內(nèi)出現(xiàn)大鼠死亡情況，及時(shí)補(bǔ)充以確保各組10只樣本。造模后24h參照Carcia等[10]制訂經(jīng)改良的18分評(píng)價(jià)法對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 組織學(xué)標(biāo)本采集 造模后24h，將大鼠（每組5只）深度麻醉，經(jīng)左心室灌注后取出腦組織，放入4%多聚甲醛溶液固定24h，再經(jīng)30%蔗糖溶液脫水直至沉底。用恒冷箱冰凍切片機(jī)取大腦冠狀位切薄片貼敷于載玻片，置于-80°C超低溫冰箱中保存。

1.3.2 TUNEL染色 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。切片經(jīng)復(fù)溫、封閉及透膜，滴加50μl TUNEL反應(yīng)液，避光孵育60min，漂洗后DAPI染色，漂洗后封片，觀察拍照。每張切片在右側(cè)額底皮層區(qū)隨機(jī)取3個(gè)視野（×400），觀察陽(yáng)性細(xì)胞并計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.3.3 熒光雙標(biāo)染色 切片經(jīng)復(fù)溫及封閉，滴加一抗稀釋液（兔抗HIF-1α和小鼠抗NeuN混合物，1∶200）；4°C濕盒孵育過(guò)夜，漂洗，滴加熒光二抗稀釋液（TRITC標(biāo)記羊抗兔和FITIC標(biāo)記羊抗小鼠混合物，1∶150）；37°C避光孵育90min，漂洗后DAPI染色，清洗后封片，觀察拍照。HIF-1α與GFAP熒光雙標(biāo)染色用小鼠抗GFAP單抗替代小鼠抗NeuN單抗，其余操作步驟同上。HIF-1α與TUNEL熒光雙標(biāo)染色先行TUNEL染色，再行HIF-1α染色。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 造模后24h，將大鼠（每組5只）深度麻醉，經(jīng)灌注后斷頭取腦；從右側(cè)額底皮層取少量組織，稱(chēng)重、裂解、勻漿、離心（15 000g，15min，4℃）；將等量的蛋白樣品（60μg）加入上樣緩沖液，變性（95℃，10min），將樣品加入SDS-PAGE垂直電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉（30 min），滴加一抗（HIF-1α，1∶1 000；BNIP3，1∶1 000；β-actin，1∶2 000） 孵育過(guò)夜（4℃）；洗膜后滴加二抗，室溫下孵育60min，經(jīng)洗膜、曝光、顯影并作定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPASS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠SAH出血及神經(jīng)功能評(píng)分比較 SAH組、2ME2組SAH出血評(píng)分為（14.00±1.70）、（13.30±1.89）分，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1a；這表明兩組大鼠SAH損傷程度基本一致。SAH組大鼠造模后24h神經(jīng)功能評(píng)分為（12.40±1.34）分，明顯低于sham組的（17.10±0.74）分（P＜0.05）；2ME2組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分為（13.90±1.10）分，較SAH組明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1b。sham組大鼠基底動(dòng)脈環(huán)周?chē)匆?jiàn)出血；SAH組、2ME2組大鼠基底動(dòng)脈環(huán)周?chē)梢?jiàn)血凝塊，表明模型建立成功，見(jiàn)圖2。

2.2 3組大鼠凋亡指數(shù)比較 sham組同側(cè)前額底皮層幾乎未觀察到TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，其凋亡指數(shù)為（0.74± 0.61）%；SAH組同側(cè)前額底皮層出現(xiàn)大量的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，呈散在性分布，其凋亡指數(shù)為（30.78±6.63）%，較sham組明顯增多（P＜0.05）；2ME2組同側(cè)前額底皮層TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，其凋亡指數(shù)為（16.79± 5.92）%，較SAH組明顯減少（P＜0.05）。

圖1 3組大鼠SAH出血及神經(jīng)功能評(píng)分

圖2 3組大鼠基底動(dòng)脈環(huán)周?chē)?jiàn)（a：sham組大鼠基底動(dòng)脈環(huán)周?chē)匆?jiàn)出血；b：SAH組和2ME2組大鼠基底動(dòng)脈環(huán)周?chē)梢?jiàn)血凝塊；c：SAH出血評(píng)分≤8分的標(biāo)本，予以剔除）

2.3 3組大鼠熒光雙標(biāo)染色結(jié)果 SAH組大鼠造模后24h在出血同側(cè)前額皮層可見(jiàn)大量HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞；部分細(xì)胞呈現(xiàn)HIF-1α/NeuN雙重陽(yáng)性，而未見(jiàn)HIF-1α/ GFAP雙重陽(yáng)性細(xì)胞，可見(jiàn)HIF-1α主要定位表達(dá)于神經(jīng)元，見(jiàn)圖3a-f；部分細(xì)胞呈現(xiàn)HIF-1α/TUNEL雙重陽(yáng)性，提示部分細(xì)胞HIF-1α蛋白和凋亡共表達(dá)，見(jiàn)圖3g-i。

圖3 HIF-1α分別與NeuN、GFAP及TUNEL熒光雙標(biāo)染色結(jié)果

2.4 3組大鼠皮層HIF-1α、BINP3蛋白表達(dá)比較 sham組同側(cè)大腦額底皮層HIF-1α、BINP3蛋白表達(dá)水平均很低，分別為1.00±0.16、1.00±0.29；與sham組比較，SAH組造模后24h同側(cè)大腦額底皮層HIF-1α、BINP3蛋白表達(dá)水平均明顯升高，分別為2.49±0.36、1.85±0.29（均P＜0.05）；與SAH組比較，2ME2組大鼠同側(cè)大腦額底皮層HIF-1α、BINP3蛋白表達(dá)水平均明顯下降，分別為1.66±0.29、1.40±0.18（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 3組大鼠皮層HIF-1α、BINP3蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

通常在缺氧條件下，HIF-1α的降解會(huì)受抑制而轉(zhuǎn)錄活性增加，在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1β結(jié)合成異源二聚體HIF-1，通過(guò)調(diào)節(jié)下游基因適應(yīng)缺氧環(huán)境。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，HIF-1α在腦缺氧、腦出血時(shí)大量表達(dá)[11]。動(dòng)物缺血缺氧腦損傷模型研究提示HIF-1α的作用仍須進(jìn)一步探討[12-13]。低氧預(yù)處理誘導(dǎo)HIF-1α在動(dòng)物腦組織中表達(dá)具有神經(jīng)保護(hù)作用[14]，而在缺血缺氧腦損傷研究提示上調(diào)表達(dá)的HIF-1α可通過(guò)其靶基因介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[11]。雖然已有研究報(bào)道SAH后HIF-1α在腦組織中表達(dá)升高，但關(guān)于其在SAH后EBI中的作用仍有爭(zhēng)議。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)大鼠SAH后去鐵胺誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)水平上升，可減輕基底動(dòng)脈血管痙攣，并改善腦干血流量[15]。Yan等[16]研究表明SAH后基底動(dòng)脈血管中穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1α在腦血管痙攣過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，應(yīng)用HIF-1α抑制劑干預(yù)HIF-1α的表達(dá)，可減輕SAH后腦血管痙攣。筆者前期研究結(jié)果表明，SAH后早期HIF-1α與細(xì)胞凋亡之間存在相關(guān)性[17]。早期凋亡過(guò)程中線粒體功能被干擾，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)揮著重要作用。BNIP3通過(guò)影響線粒體功能降低Bcl-2蛋白對(duì)凋亡的抑制作用，從而發(fā)揮促凋亡作用。大鼠缺氧腦損傷模型中腦組織HIF-1α介導(dǎo)BNIP3上調(diào)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

為探討HIF-1α、BINP3在SAH后早期皮層神經(jīng)元凋亡的作用機(jī)制，筆者采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立SAH模型進(jìn)行研究。該模型造成瞬時(shí)顱內(nèi)壓升高、腦灌注壓急劇下降及神經(jīng)功能障礙，比較真實(shí)地模擬了臨床上動(dòng)脈瘤破裂的病理、生理過(guò)程，是國(guó)內(nèi)外研究SAH后EBI常用模型之一[18]。此外，本研究參照Sugawara等[9]改良的評(píng)分法對(duì)SAH嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，剔除SAH出血評(píng)分≤8分的標(biāo)本。該模型手術(shù)同側(cè)前額底為血流沖擊最大、血凝塊最明顯的區(qū)域，多數(shù)學(xué)者選取額底皮層作為研究SAH后EBI的部位。本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α主要定位表達(dá)于神經(jīng)元，同時(shí)HIF-1α與部分凋亡細(xì)胞共同表達(dá)；這表明SAH后大量表達(dá)的HIF-1α與早期皮層神經(jīng)元凋亡存在相關(guān)性。TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAH組造模后24h額底皮層大量細(xì)胞凋亡，呈散在性分布；2ME2組（HIF-1α抑制劑干預(yù)后）細(xì)胞凋亡明顯減少；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，造模后24h SAH組大鼠大腦額底皮層HIF-1α、BNIP3大量表達(dá)，而2ME2可抑制這一效果。大鼠神經(jīng)功能評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，2ME2能明顯改善大鼠神經(jīng)功能。

綜上所述，SAH后大量表達(dá)的HIF-1α介導(dǎo)上調(diào)BNIP3表達(dá)并參與了早期皮層神經(jīng)元凋亡過(guò)程，進(jìn)一步明確了HIF-1α、BNIP3在SAH后EBI中的作用，為臨床治療EBI提供了新思路。但是HIF-1α下游參與BNIP3調(diào)控的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[1] Jr C E,Rabinstein A A,Carhuapoma J R,et al.Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage:a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association[J].Stroke,2012,43(6):1711-1737.

[2] Chen J,Wang L,Wu C,et al.Melatonin-enhanced autophagy protects against neural apoptosis via a mitochondrial pathway in early brain injury following a subarachnoid hemorrhage[J].J PinealRes,2014,56(1):12-19.

[3] 李群,李建儒,曹生龍,等.二甲胺四環(huán)素在蛛網(wǎng)膜下腔出血中保護(hù)作用的研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2015,37(3):193-194.

[4] 張立新,嚴(yán)鋒,王林,等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用機(jī)制[J].浙江醫(yī)學(xué),2015,37(3):184-188.

[5] Palade C,Ciurea A V,Nica D A,et al.nterference of apoptosis in the pathophysiologyofsubarachnoid hemorrhage[J].Asian J Neurosurg,2013,8(2):106-111.

[6] YukselS,Tosun YB,CahillJ,et al.Early brain injury following aneurysmal subarachnoid hemorrhage:emphasis on cellular apoptosis[J].Turk Neurosurg,2012,22(5):529-533.

[7] Wang Z,Meng C J,Shen X M,et al.Potential contribution of hypoxia-inducible factor-1α,aquaporin-4,and matrix metalloproteinase-9 to blood-brain barrier disruption and brain edema after experimental subarachnoid hemorrhage[J].J Mol Neurosci, 2012,48(1):273-280.

[8] Xu W,Xu R,Li X,et al.Downregulating hypoxia-inducible factor-1α expression with perfluorooctyl-bromide nanoparticles reduces early brain injury following experimental subarachnoid hemorrhage in rats[J].Am J TranslRes,2016,8(5):2114-2126.

[9] Sugawara T,Ayer R,Jadhav V,et al.A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model[J].J NeurosciMethods,2008,167(2):327-334.

[10] Garcia J H,Wagner S,Liu K F,et al.Neurological deficit and extent of neuronalnecrosis attributable to middle cerebralartery occlusion in rats[J].Statistical validation,Stroke,1995,26(4): 627-634.

[11] Chen C,Hu Q,Yan J,et al.Multiple effects of 2ME2 and D609 on the cortical expression of HIF-1α and apoptotic genes in a middle cerebral artery occlusion-induced focal ischemia rat model[J].J Neurochem,2007,102(6):1831-1841.

[12] Yeh S H,Ou L C,Gean P W,et al.Selective inhibition of early-but not late-expressed HIF-1α is neuroprotective in rats after focal ischemic brain damage[J].Brain Pathol,2011,21(3): 249-262.

[13] Lopez-Hernandez B,Posadas I,Podlesniy P,et al.HIF-1α is neuroprotective during the early phases of mild hypoxia in rat corticalneurons[J].Exp Neurol,2012,233(1):543-554.

[14] Jones N M,Lee E M,Brown T G,et al.Hypoxic preconditioning producesdifferential expression of hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)and its regulatory enzyme HIF prolyl hydroxy-lase 2inneonatalratbrain[J].NeurosciLett,2006,404(1-2):72-77.

[15] Hishikawa T,Ono S,Ogawa T,et al.Effects of deferoxamine-activated hypoxia-inducible factor-1 on the brainstem after subarachnoid hemorrhage in rats[J].Neurosurgery,2008,62 (1):232-240.

[16] Yan J,Chen C,LeiJ,et al.2-methoxyestradiolreduces cerebral vasospasm after 48 hours of experimental subarachnoid hemorrhage in rats[J].Exp Neurol,2006,202(2):348-356.

[17] Hu Q,Wu C,Chen J Y,et al.The relationship between hypoxia-inducible factor-1α expression and apoptosis in early brain injury after subarachnoid hemorrhage[J].Journal of Zhejiang University,2014,43(1):58-65.

[18] Lee J Y,Sagher O,Keep R,et al.Comparison of experimental rat models of early brain injury after subarachnoid hemorrhage [J].Neurosurgery,2009,65(2):331-343.

HIF-1α mediated up-regulation of BNIP3 involving in early cortical apoptosis after subarachnoid hemorrhage

HU Qiang,YU Wenhua,CHEN Gao,et al.Department of Neurosurgery,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the role of hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)and BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3 (BNIP3)in early cortical apoptosis after subarachnoid hemorrhage (SAH). Methods Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham,2-methoxyestradiol(2ME2),and SAH groups with 10 animals in each. The SAH model was induced by endovascular perforation on internal carotid in rats of 2ME2 and SAH groups.The neurological scores were recorded 24h after SAH induced.The expression of HIF-1α and BNIP3 was detected by Western blotting. TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling(TUNEL)technique was adopted to detect apoptotic cell.HIF-1α-positive cells were observed by double fluorescence labeling. Results Compared to sham group,expression of HIF-1α and BNIP3 was increased,marked cell apoptosis and neurologic function decline were observed in brain tissue of SAH group 24 h after model induced (P＜0.05).Compared to SAH group,the expression of HIF-1α and BNIP3 was suppressed,cell apoptosis was diminished and neurologic function improved in 2ME2 group(P＜0.05).Double fluorescence labeling showed that HIF-1α was mainly located in neurons. Conclusion These data indicated that HIF-1α-mediated up-regulation of BNIP3 in involved in early cortical apoptosis after subarachnoid hemorrhage.

Subarachnoid hemorrhage Hypoxia-inducible factor-1α Apoptosis BNIP3

2017-02-15）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-787

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171094）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院（南京醫(yī)科大學(xué)附屬杭州醫(yī)院）神經(jīng)外科（胡強(qiáng)、俞文華、杜權(quán)）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科（陳高）

俞文華，E-mail：ywh669@126.com