劉奇燕

摘要 概述了SSR分子標記原理和特點，闡述了SSR分子標記鑒定雜交水稻種子純度技術要點，對其應用前景進行了展望，以期為該技術在種子純度檢測中的應用提供參考。

關鍵詞 SSR分子標記；種子；純度檢測；應用

中圖分類號 S339.31 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）13-0049-01

Abstract This paper summarized principle and characteristics of SSR molecular marker，introduced technical points of hybrid rice seed purity identification by SSR molecular marker，and its application prospect was prospected，in order to provide reference for application of seed purity test.

Key words SSR molecular marker；seed；purity test；application

種子純度是評價種子質量的主要指標。在雜交水稻生產中，由于忽視種子真實性和品種純度檢驗，偽劣摻假種子傷農事件時有發(fā)生，給農業(yè)生產造成了不可彌補的損失。因此，對雜交種子純度進行快速、準確、有效的鑒定顯得十分重要。

SSR標記由于具有重復性好、遺傳上呈共顯性、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、引物序列易交流、結果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，已成為雜交水稻種子純度鑒定的一種理想分子標記方法。

1 SSR分子標記原理

SSR即簡單序列重復，不同水稻品種基因組DNA中，存在著能夠穩(wěn)定遺傳的簡單重復序列（SSR）重復次數(shù)的差異，這種差異可以通過從水稻種子、幼苗等組織中提取DNA，用SSR引物進行擴增，經電泳獲得DNA指紋圖譜加以區(qū)別。利用這一原理，農業(yè)部發(fā)布了水稻品種真實性鑒定標準，即《水稻品種鑒定——指紋分析方法》（2007年），利用該原理和SSR標記技術，在分子水平上鑒定品種純度也成為必然的發(fā)展趨勢[1-3]。

SSR分子標記技術用于雜交水稻種子純度鑒定，是基于F1雜交種子（父母本雜交后代）具有父母本共同的遺傳基礎，而父母本之間又在特定的SSR位點存在多態(tài)性，通過篩選引物對樣品DNA進行PCR擴增，凝膠電泳后觀察不同DNA譜帶類型，F(xiàn)1具有雙親互補的帶型，很容易將雜交組合與其親本及其他混雜種子分辨開來（圖1）。

2 SSR分子標記鑒定雜交水稻種子純度技術要點

2.1 DNA提取

多數(shù)研究者以新鮮葉片或發(fā)芽幼苗為材料來提取樣品中DNA，提取的DNA質量應符合PCR擴增的要求，常見的DNA提取方法主要有以下幾種：CTAB提取法、SDS提取法、磁珠提取法、堿煮法。CTAB提取法：DNA質量高、得率高，儲存時間長，成本低，但程序復雜；SDS提取法：DNA質量高，儲存時間長，程序較復雜；磁珠提取法：DNA質量高、得率較低，儲存時間長，程序較簡單；堿煮法：質量較低，存儲時間短、程序簡單，成本極低[4-6]。

2.2 PCR擴增

2.2.1 引物篩選。引物篩選原則：一是雜合率高、具有雙親共顯性；二是多態(tài)性高、區(qū)分異品種能力強；三是綜合考慮多重電泳組合潛力、堿基基序重復、擴增效果好（特異性擴增強、非特異性擴增少、引物擴增穩(wěn)定、重復性好）。

2.2.2 PCR擴增反應體系。通常PCR擴增在10 μL反應體積下進行，包含DNA聚合酶0.2 U、SSR標記引物1 μmol、模板DNA 2～10 ng、dNTP 1 μmol、10倍PCR反應液（含MgCl2）1 μL，其中選用的引物為在父母本間具有差異性的引物。

2.2.3 PCR擴增反應程序。94 ℃預變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s（不同引物退火溫度有別），72 ℃延伸30 s，共進行32個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，10 ℃保存，經過32個循環(huán)后，單個SSR位點特定片段可得到幾百萬倍的擴增，從而可在凝膠上顯現(xiàn)出來。

2.3 PCR擴增產物檢測

目前，應用于SSR擴增產物檢測的方法主要有溫度掃描凝膠電泳、DNA測序、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、普通瓊脂糖凝膠電泳、phor瓊脂糖凝膠電泳等[7-9]。

2.4 數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計

檢測純度的幾對引物分別讀出結果，標出含有父本多少粒、母本多少粒、雜株多少粒，再用總的供檢粒數(shù)減去異品種粒數(shù)，再除以總的供檢粒數(shù)，得出的結果進行綜合分析，推薦使用其中最小值作為純度鑒定的結果[10-14]。圖2為水稻雜交種兩優(yōu)培九100粒種子用一個SSR分子標記擴增后瓊脂糖電泳檢測的圖譜。100粒種子中含3粒母本、4粒父本，因而該水稻種子純度為（100-3-4）/100=93%。

3 應用前景

經多家科研單位、多位學者的努力，SSR分子標記技術已小范圍應用于種子純度檢測實踐[15-17]。隨著SSR分子標記技術的發(fā)展成熟，其應用于雜交水稻種子純度檢測的實踐將展示出更廣闊的前景[18-21]。

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