曾小芳,趙 偉,*,楊瑞金,蔡體元,李雪良(.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 4; .食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無錫 4; .吉林省添正醫(yī)藥股份有限公司,吉林蛟河 500)

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超聲波輔助酶法提取骨明膠研究

曾小芳1,趙 偉1,*,楊瑞金2,蔡體元3,李雪良3
(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122; 2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無錫 214122; 3.吉林省添正醫(yī)藥股份有限公司,吉林蛟河 132500)

以脫脂脫礦骨粉為原料,利用超聲波輔助胃蛋白酶法提取骨明膠。比較了骨素酶解前、酶解中以及酶解后經(jīng)不同超聲時(shí)間和功率處理對(duì)明膠得率的影響,單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:骨素酶解前和酶解中經(jīng)超聲處理,明膠得率顯著提高。在骨素酶解前和酶解中分別經(jīng)250 W、20 min和250 W、10 min的超聲處理,明膠的得率分別為81.35%和83.32%,與未經(jīng)超聲處理組相比,明膠得率分別提高了9.96%和11.93%,而骨素酶解后在300 W超聲功率下處理10 min,明膠得率僅為71.59%,與未超聲處理組71.39%接近。SEM圖片顯示,酶解前和酶解中經(jīng)超聲處理,會(huì)使骨素表面出現(xiàn)孔隙,而酶解后超聲處理則會(huì)使骨素表面更加光滑,表明酶解前和酶解中超聲處理對(duì)骨素具有疏松作用。SDS-PAGE結(jié)果顯示,超聲波輔助酶法提取明膠,對(duì)明膠分子量分布沒有影響。超聲波輔助酶法提取,提高了骨明膠的得率,可為工業(yè)上骨明膠的生產(chǎn)提供有益的參考和借鑒。

脫脂脫礦骨粉,超聲波,胃蛋白酶,明膠

明膠(gelatin)是由動(dòng)物的骨、腱、軟骨、皮膚、肌膜等結(jié)締組織中的膠原經(jīng)溫和而不可逆的斷裂后的主要產(chǎn)物[1-3]。明膠是一種重要的高分子生物材料,具有膠凝、親水性強(qiáng)、成膜性好等優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)[4],因而廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、照相和其他行業(yè)。

明膠產(chǎn)業(yè)有一百多年的歷史,目前骨明膠生產(chǎn)的方法主要是傳統(tǒng)工藝堿法。堿法生產(chǎn)的明膠質(zhì)量較高,但堿法生產(chǎn)明膠周期很長(zhǎng),長(zhǎng)達(dá)2～3個(gè)月,其中浸灰時(shí)間約1～2個(gè)月。同時(shí),堿法生產(chǎn)采用多道提膠,提膠溫度高,提膠時(shí)間長(zhǎng)達(dá)60 h左右,高品質(zhì)的明膠得率不高[5]。此外,堿法每生產(chǎn)1 t骨明膠需要水量在600 t以上,生產(chǎn)過程中需要使用大量的酸堿試劑,環(huán)境污染嚴(yán)重,使企業(yè)面臨巨大的環(huán)保壓力[6]。

酶法制膠是用酶將膠原水解為明膠的方法[7],與傳統(tǒng)制膠工藝相比,具有生產(chǎn)周期短、廢水排放量少、好膠率高、純度高等優(yōu)點(diǎn)。韓應(yīng)昌[5]等以牛骨為原料,采用中性蛋白酶酶解制照相明膠,生產(chǎn)周期減少50%左右,好膠率高達(dá)90%以上。張鋒[8]等以中性蛋白酶酶解豬皮原料,生產(chǎn)周期大大縮短。Hossei ni-Parvar等[9]進(jìn)行了酶法從牛骨中提取食用明膠的研究。

超聲波是一種超過人的聽力范圍的聲波(>20 kHz),因具有安全、無毒、環(huán)保等優(yōu)勢(shì),近年來已經(jīng)普遍應(yīng)用于食品工業(yè)的加工、預(yù)處理和提取中[10-13]。楊萌萌等[14]以牦牛蹄筋為原料,利用超聲波輔助酶法提取膠原蛋白,提取率提高了10.69%。殷涌光等[15]以鮮鹿皮為原材料,采用超聲波輔助酶法對(duì)其蛋白的提取進(jìn)行了研究,提取率可達(dá)56.86%。李敏等[16]采用超聲預(yù)處理和常規(guī)方法分別進(jìn)行了木瓜蛋白酶酶解草魚魚鱗膠原蛋白的研究。

本文以脫脂脫礦骨粉為原料,研究了超聲波輔助胃蛋白酶提取骨明膠對(duì)得率的影響,分析了超聲波處理后骨素結(jié)構(gòu)特征及產(chǎn)品分子量分布,對(duì)超聲波輔助酶法提取的機(jī)理進(jìn)行初步探究,以期更好地指導(dǎo)實(shí)際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂骨粒(來源于豬骨)、堿法明膠 吉林添正醫(yī)藥股份有限公司;胃蛋白酶、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、醋酸、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、甲基橙指示劑、甲基紅指示劑、硼酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;聚丙烯酰胺儲(chǔ)備液(30%) 前塵生物科技公司;標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker Bio-Rad公司;四甲基乙二胺(TEMED) MERCK公司。

脈沖多頻超聲波設(shè)備 無錫市華能超聲電子有限公司;MP-501A超級(jí)恒溫循環(huán)槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;C-MAC HS 4 S25磁力攪拌器 上海圣科儀器設(shè)備有限公司;FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;BS2202 S和BS 224 S精密天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;DK-824電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;KDN-103F自動(dòng)定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;UV-1100型紫外可見光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;WK-1000A型高速藥物粉碎機(jī) 青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司;LXJ-11B低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;Su1510掃描電子顯微鏡 日本日立公司;Bio-Rad mini-protein tetra cell電泳設(shè)備 美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本成分測(cè)定 粗蛋白含量測(cè)定:凱氏定氮法(GB 5009.5-2010),蛋白質(zhì)換算系數(shù)為5.55;含水量測(cè)定:105 ℃恒重法(GB5009.3-2010);灰分含量測(cè)定:灼燒法(GB5009.4-2010);粗脂肪含量測(cè)定:索氏抽提法(GB/T5512-2008)。

1.2.2 骨素的制備 經(jīng)前期脫礦脫脂優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定脫礦脫脂最佳條件。用高速藥物粉碎機(jī)將骨粒粉碎,收集過30目篩的骨粉,將骨粉與0.48 mol/L的鹽酸按1∶7(g∶mL)的比例于室溫下攪拌脫礦3 h,每1 h更換1次鹽酸溶液。將脫礦后的骨粉與0.6% NaOH溶液按1∶2(g∶mL)的比例于室溫下攪拌脫脂12 h,每3 h更換1次NaOH溶液,每次更換溶液前均采用5000 r/min,室溫下離心20 min,收集渣相,即為脫脂脫礦骨粉(骨素)。骨素的粗蛋白含量為(94.01%±0.03%),粗脂肪含量為(0.27%±0.01%),灰分含量為(1.30%±0.01%)。

1.2.3 骨素的酶解 將骨素分散于已預(yù)熱至30 ℃的去離子水中,料液比1∶10,加鹽酸溶液調(diào)至最適pH1.5并保持,加胃蛋白酶(60 U/g)后恒溫?cái)嚢?反應(yīng)結(jié)束后采用水洗三次的方法滅酶,明膠得率為71.39%。

1.2.4 超聲波輔助酶解 考察在酶解前、酶解中以及酶解后施加超聲波對(duì)明膠得率的影響。單因素的水平設(shè)定為:固定超聲功率250 W,研究超聲時(shí)間5、10、20、30、40 min對(duì)明膠得率的影響;固定超聲時(shí)間10 min,研究超聲功率100、150、200、250、300 W對(duì)明膠得率的影響。

1.2.5 骨明膠得率 膠原蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定,轉(zhuǎn)化系數(shù)取5.55[17]。

骨明膠得率(%)=產(chǎn)品膠重/(骨素粉重×骨素粉中膠原蛋白含量)×100

1.2.6 掃描電子顯微鏡(SEM)分析 將未經(jīng)超聲處理骨素和超聲處理骨素(酶解前、酶解中、酶解后250 W超聲10 min)干燥,采用掃描電子顯微鏡對(duì)酶解后骨素進(jìn)行拍照分析。

1.2.7 SDS-PAGE電泳分析 采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)明膠進(jìn)行電泳分析。0.2 mL樣品加入0.05 mL 5×樣品緩沖液(內(nèi)含10% SDS,5%β-巰基乙醇,50%甘油,0.5%溴酚藍(lán),1 mol/L pH6.8 Tris-HCl緩沖液)處理后,于100 ℃沸水加熱3 min后離心,待測(cè)。采用5%的濃縮膠、7.5%分離膠對(duì)已處理樣品進(jìn)行電泳分析。采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色后,再用甲醇/乙酸溶液脫色。電泳膠采用GEL-DOC 2000凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行采集。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行,采用Excel和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行Duncan’s差異分析,以p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波輔助酶解對(duì)明膠得率的影響

2.1.1 酶解前超聲處理對(duì)明膠得率的影響

2.1.1.1 酶解前超聲時(shí)間對(duì)明膠得率的影響 如圖1所示,在一定的超聲時(shí)間范圍內(nèi),明膠得率會(huì)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高并在20 min時(shí)達(dá)到最高(79.48%),超聲波的“空穴效應(yīng)”可能是造成這一現(xiàn)象的原因之一。一定程度的超聲處理會(huì)在基質(zhì)表面附近產(chǎn)生一系列聲學(xué)效應(yīng)和微射流,暴露出更多的酶結(jié)合位點(diǎn),因此有助于提高酶解速度[18]。經(jīng)20 min的超聲處理,膠原纖維變得疏松,酶蛋白能夠進(jìn)入骨素內(nèi)部與更多的酶作用位點(diǎn)結(jié)合,從而提高明膠得率。隨著超聲時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng),膠原的螺旋結(jié)構(gòu)可能會(huì)遭到破壞[19-20],有一部分膠原被水解過度變?yōu)槟z原蛋白肽,從而導(dǎo)致明膠的得率隨之下降。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)明膠得率的影響Fig.1 The effect of ultrasonic time on yield of gelatin

2.1.1.2 酶解前超聲功率對(duì)明膠得率的影響 在較低超聲功率和短時(shí)間下,骨素的結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生一定程度的再聚集,使得骨素表面原有的與酶作用的位點(diǎn)有可能會(huì)被包裹[21],此時(shí)酶解效率降低,且在一定范圍內(nèi)(≤200 W)隨著超聲功率的提高,骨素聚集的程度更高,酶解效率隨之降低,導(dǎo)致明膠得率下降。繼續(xù)增大超聲功率,此時(shí)超聲波的“空穴效應(yīng)”使得膠原纖維的結(jié)構(gòu)重新疏松,酶蛋白作用位點(diǎn)暴露的更多[19],因此明膠得率隨超聲功率的增加先下降后升高,在功率達(dá)到250 W時(shí),明膠得率達(dá)到最高(81.35%),與未經(jīng)超聲處理的得率(71.39%)相比提高了9.96%。

圖2 超聲功率對(duì)明膠得率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic power on yield of gelatin

2.1.2 酶解中超聲處理對(duì)明膠得率的影響

2.1.2.1 酶解中超聲時(shí)間對(duì)明膠得率的影響 從圖3可以看出明膠得率隨超聲時(shí)間的增加先逐漸升高,在10～30 min基本保持穩(wěn)定,隨后明膠得率緩慢下降,并且在10 min時(shí)明膠得率達(dá)到最高79.12%。

與圖1酶解前超聲時(shí)間對(duì)明膠提取率影響結(jié)果相比,在酶解中進(jìn)行超聲處理,明膠提取率達(dá)到最高值的時(shí)間從20 min(圖1)縮短為10 min(圖3),說明酶解中超聲波處理不僅會(huì)對(duì)骨素表面結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,同時(shí)還可能對(duì)酶活產(chǎn)生一定的影響,即會(huì)在一定程度上提高所選用的胃蛋白酶的酶活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Yu[22]的研究結(jié)果相一致,Yu研究中發(fā)現(xiàn)超聲處理胃蛋白酶后,胃蛋白酶可以恢復(fù)到超聲前的初始結(jié)構(gòu),同時(shí)在它的活性中心可能暴露出天冬氨酸殘基,從而提高酶活。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)明膠得率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on yield of gelatin

2.1.2.2 酶解中超聲功率對(duì)明膠得率的影響 圖4顯示,明膠得率隨超聲功率的增加先下降后升高,在功率達(dá)到250 W時(shí),明膠得率達(dá)到83.32%,與未經(jīng)超聲處理的得率(71.39%)相比提高了11.93%。與圖2的趨勢(shì)相同,圖2在超聲功率大于200 W時(shí),得率開始呈現(xiàn)上升趨勢(shì),而圖4在超聲功率大于150 W時(shí),得率已經(jīng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì),可能是因?yàn)樵诿附膺^程中施加超聲波,超聲提高了胃蛋白酶的活性[22],從而降低了提高得率的最低超聲功率。

圖4 超聲功率對(duì)明膠得率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic power on yield of gelatin

2.1.3 酶解后超聲處理對(duì)明膠得率的影響

2.1.3.1 酶解后超聲時(shí)間對(duì)明膠得率的影響 如圖5所示,明膠得率隨超聲時(shí)間的增加先升高后緩慢下降,在10 min時(shí)得率達(dá)到最高71.45%。與圖1、圖3相比,盡管得率隨時(shí)間變化的趨勢(shì)類似,但是圖5的得率均低于圖1和圖3?？梢哉J(rèn)為酶解后超聲的效果差于酶解前超聲處理和酶解時(shí)超聲處理。膠原變?yōu)槊髂z主要包括兩個(gè)過程:膠原的解聚集過程和膠原的解螺旋過程[23]。酶解后膠原解聚集還未解螺旋,經(jīng)超聲處理后,有可能暴露出一部分帶不同電荷的基團(tuán),這些基團(tuán)通過相互吸引重新聚集[21],骨素結(jié)構(gòu)更緊密,從而明膠得率更低。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)明膠得率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic time on yield of gelatin

2.1.3.2 酶解后超聲功率對(duì)明膠得率的影響 從圖6可以看出，當(dāng)超聲功率為300 W時(shí),明膠得率僅為71.59%,與未經(jīng)超聲處理的得率(71.39%)接近。骨素經(jīng)超聲處理后,有可能暴露出一部分帶不同電荷的基團(tuán),這些基團(tuán)通過相互吸引重新聚集[21],從而導(dǎo)致骨素結(jié)構(gòu)更緊密。隨著超聲功率的增加,膠原結(jié)構(gòu)會(huì)重新疏松,明膠得率隨之上升[20],但是可能由于儀器本身的功率所限,得率最大與未經(jīng)超聲處理接近。

圖6 超聲功率對(duì)明膠得率的影響Fig.6 The effect of ultrasonic power on yield of gelatin

2.2 掃描電子顯微鏡分析

圖7是未經(jīng)超聲處理和超聲處理骨素的SEM照片,未超聲骨素(A)表面沒有小孔,說明結(jié)構(gòu)緊密;酶解前(B)和酶解中(C)超聲處理骨素表面分布很多小孔,說明超聲處理在酶解前和酶解中對(duì)骨素結(jié)構(gòu)都有疏松的作用;而酶解后超聲處理骨素(D)與未超聲骨素(A)比較表面更光滑,且沒有小孔,說明酶解后超聲波處理不僅沒有疏松骨素,反而使骨素的結(jié)構(gòu)更緊密,因此選擇在酶解前或者酶解中超聲處理骨素有助于明膠得率的提高。

圖7 未經(jīng)超聲處理骨素和超聲處理骨素電鏡圖(5000×)Fig.7 The SEM photos of untreatedand treated defatted and demineralized bone powder by ultrasonic(5000×)注:A未經(jīng)超聲處理骨素;B酶解前超聲處理骨素; C酶解中超聲處理骨素;D酶解后超聲處理骨素。

2.3 SDS-PAGE電泳分析

超聲波輔助酶解與未經(jīng)超聲波處理所得的明膠SDS-PAGE電泳圖如圖8所示。泳道2是未經(jīng)超聲處理的酶法提取骨明膠,分子量主要分布在100 kDa和116 kDa附近,泳道6是傳統(tǒng)方法堿法生產(chǎn)的明膠,分子量條帶主要在140 kDa附近,在250 kDa以上有少量條帶。酶法明膠與傳統(tǒng)堿法明膠相比,高分子量組分略少,110 kDa附近的組分增加,說明酶對(duì)膠原的降解比堿法更嚴(yán)重。泳道3、4、5是超聲輔助酶法提取的明膠,與泳道2未經(jīng)超聲處理的酶法膠相比,其分子量分布幾乎一致,說明超聲波處理對(duì)明膠分子量分布沒有影響。這可能跟儀器本身的功率有關(guān),本實(shí)驗(yàn)室的超聲波發(fā)生器的最大功率為300 W,短時(shí)間(≤20 min)超聲處理,能量不足以破壞膠原的結(jié)構(gòu)。

圖8 超聲處理骨素的產(chǎn)品和堿法明膠SDS-PAGE電泳圖Fig.8 SDS-PAGE pattern of gelatin solutions under ultrasound treatment and alkaline type gelatins注:1:蛋白Marker；2:酶解未經(jīng)超聲；3:酶解后超聲； 4:酶解前超聲；5:酶解中超聲；6:堿法;超聲條件250 W,10 min。

3 結(jié)論

在超聲波輔助酶解骨素提取明膠的研究中發(fā)現(xiàn),酶解前和酶解中超聲波處理骨素都可以顯著提高明膠的得率(p<0.05)。骨素酶解前超聲可以疏松骨素結(jié)構(gòu),增加骨素表面的酶作用位點(diǎn);而酶解過程中超聲處理則不僅可以疏松骨素結(jié)構(gòu),增加骨素表面的酶作用位點(diǎn),同時(shí)激活胃蛋白酶,提高酶活。酶解前超聲處理(250 W、20 min)和酶解中超聲處理(250 W、10 min)與未經(jīng)超聲處理相比,得率分別提高了9.96%和11.93%;而骨素酶解后再經(jīng)過超聲波的得率沒有提高甚至降低。SEM顯示,酶解前和酶解中超聲波處理使骨素表面出現(xiàn)小孔,酶解后超聲波處理使骨素表面更加光滑,表明酶解前和酶解中超聲波處理對(duì)骨素具有疏松作用。通過SDS-PAGE分析可知,超聲波輔助酶法提取明膠,對(duì)明膠的分子量分布沒有影響。由此可見,超聲波輔助可為酶法提取骨明膠的研究提供新的思路。

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Study on the extraction of gelatin from bone by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis

ZENG Xiao-fang1,ZHAO Wei1,*,YANG Rui-jin2,CAI Ti-yuan3,LI Xue-liang3

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2.State Key Laboratory of Food Science &Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 3.Jilin Tianzheng Medical Co.,Ltd.,Jiaohe 132500,China)

Taking defatted and decalcified bone powder as raw material,the extraction of gelatin was studied by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis using pepsin. The effects of ultrasonic treatment defatted and decalcified bone powder before,during and after enzymatic hydrolysis(different ultrasonic time and ultrasonic power)on the yield of gelatin were compared. The single factor experiment results showed that the yield of gelatin could be significantly increased by ultrasonic treatment before enzymatic hydrolysis and during enzymatic hydrolysis. The yields of gelatin reached 81.35% and 83.32% respectively at 250 W for 20 min and 250 W for 10 min by ultrasonic treatment before enzymatic hydrolysis and during enzymatic hydrolysis respectively,which was higher than without ultrasonic treatment,9.96% and 11.93% respectively. However,the yield of gelatin was only 71.59% by ultrasonic treatment at 300 W for 10 min after enzymatic hydrolysis,which had no advantage compared with without ultrasonic treatment. SEM showed that the surface of defatted and decalcified bone powder appeared small holes when treated with ultrasonic before enzymatic hydrolysis and during enzymatic hydrolysis. The surface of defatted and decalcified bone powder became smoother when treated with ultrasonic after enzymatic hydrolysis. It was indicated that the structure of defatted and decalcified bone powder with ultrasonic treatment before enzymatic hydrolysis and during enzymatic hydrolysis could be loosed. SDS-PAGE showed that ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis had no effect on the molecular weight distribution of gelatin. Ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis,which improved the yield of gelatin,could provide useful reference in industrial production of bone gelatin.

defatted and decalcified bone powder;ultrasound;pepsin;gelatin

2016-11-30

曾小芳(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與配料，E-mail：zeng_xiaofang123@126.com。

*通訊作者:趙偉(1982-)，男，博士，教授，研究方向：食品加工，E-mail：zhaow@jiangnan.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31522044)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)14-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.033